Etiología de infecciones intramamarias en vacas de raza carora en sistemas de pastoreo y estabulación

INTRODUCCIÓN

Aunque se han identificado hasta 137 especies de microorganismos responsables de provocar infecciones intramamarias, en grupos tan diversos como bacterias, micoplasmas, hongos, levaduras y algas [32], afortunadamente la gran mayoría de mastitis están provocadas por unas pocas bacterias. De hecho, en los estudios epidemiológicos es frecuente encontrar que casi el 80% de todas las mastitis diagnosticadas están provocadas por solo 5 especies de bacterias, tales como Str. agalactiae, Str. dysglactiae, Str. uberis, S. aureus y E. coli [4, 35].

Clásicamente los principales patógenos mamarios se han clasificado en tres grandes grupos (contagiosos, ambientales y flora oportunista de la piel), basándose en la ubicación de su reservorio primario, desde donde se produce la exposición del extremo del pezón a los gérmenes y la subsecuente infección [6, 12].

Los gérmenes contagiosos más importantes son: S. aureus, Str. agalactiae, C. bovis y Mycoplasmas spp.; además, Str. dysgalactiae se considera tantocontagioso como ambiental. Los patógenos contagiosos se pueden considerar que

son microorganismos adaptados a vivir dentro del huésped y, en particular, dentro de la glándula mamaria. Se caracterizan porque su reservorio principal son las glándulas infectadas y la infección se difunde entre vacas, contaminando el extremo del pezón, durante el proceso del ordeño (manos del ordeñador, manguitos de las pezoneras, trapos etc..). Muchos gérmenes contagiosos tienen una gran capacidad de adherencia (S. aureus, Str. agalactiae), lo que les permite atravesar el canal del pezón por crecimiento. Las infecciones tienden a ser persistentes (semanas, meses o años) y subclínicas, aunque también son frecuentes los episodios clínicos.

Los más importantes patógenos ambientales podemos separarlos en tres subgrupos: los coliformes (E. coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp y Citrobacterspp), los estreptococos (Str. uberis, Str. bovis y Str. dysgalactiae) y los enterococos (Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis). Tradicionalmente han sido considerados como invasores oportunistas de la glándula mamaria y no adaptados a sobrevivir en el organismo hospedador. El principal reservorio de los patógenos ambientales es el entorno de la vaca (camas, estiércol, tierra, agua, etc...), de ahí que sea imposible su erradicación. La exposición primaria de los pezones a estos gérmenes se produce principalmente entre ordeños, aunque también puede ocurrir durante el ordeño, en el periodo seco o previo al parto en las vacas primíparas [12]. En general estos microorganismos tienen una baja capacidad de adherencia, de modo que habitualmente necesitan de un mecanismo de propulsión (fenómeno de flujo inverso o impacto, durante el ordeño) para atravesar el canal del pezón; no obstante algunos de estos gérmenes, como E. coli, también pueden penetrar en el interior de la glándula en ausencia de flujo de leche (por ejemplo, cuando al extremo del pezón se le somete a una exposición elevada de patógenos inmediatamente después del ordeño). Típicamente estos gérmenes invaden el interior de la ubre, se multiplican, provocan una respuesta inmune del animal y son eliminados normalmente con cierta rapidez. Además, se piensa que la severidad de la enfermedad depende, en parte, de la rapidez de la respuesta inmunitaria, en particular de la migración de los leucocitos polimorfonucleares a la ubre [31]. Con frecuencia estos gérmenes provocan mastitis clínicas (el 70-80% de las mamitis por E. coli y el 50% de los estreptococos ambientales; [12]. En el 60-70% de los casos la infección dura menos de 30 días, pero en ocasiones (alrededor del 13-18% de los casos) también puede ser crónica y persistir más de 100 días [15], provocando mamitis clínicas recurrentes [4]. Por ejemplo, [3] demostraron que alrededor del 50% de las mastitis clínicas provocadas por enterobacterias durante los primeros 100 días de lactación, procedían en realidad de infecciones adquiridas en el periodo seco.

La flora oportunista de la piel está formada por los estafilococos coagulasa negativo (ECN). Este grupo de gérmenes ha adquirido una gran relevancia en los últimos años. Aunque existen más de 20 especies de ECN que pueden provocar mastitis [19], podemos destacar como más prevalentes a,S. simulans, S. chromogenes, S. xylosus, S. epidermidis y S. capitis [23]. Los ECN se consideran como microorganismos oportunistas, ya que se encuentran en la piel sana del pezón y en las manos del ordeñador. Las infecciones que producen suelen ser leves, aunque también pueden ocasionar síntomas clínicos poco agudos [27]. La incidencia de nuevas infecciones con ECN es máxima en el período de secado, por lo que la prevalencia es elevada en el parto. Además, también es remarcable que se aíslan con mayor frecuencia en las vacas de primer parto que en las vacas multíparas, y que son los principales patógenos que se aíslan en las vacas primíparas al parto [25, 23]. Aproximadamente la mitad de estas infecciones se curan espontáneamente durante la lactación [27], por lo que la prevalencia de estos gérmenes decrece a medida que la lactación avanza. Además, la curación espontánea al secado, sin tratamiento, es de alrededor del 90%. Algunos autores sugieren que estos gérmenes podrían tener un efecto de protección contra las infecciones por patógenos más virulentos, especialmente de los ambientales [4], aunque esta hipótesis está bajo discusión ya que en algunos trabajos se ha encontrado un efecto contrario (aumento del riesgo de infección por Str. uberis y C. bovis; [26].

Finalmente, otro grupo de microorganismos con elevado poder patógeno, pero normalmente poco prevalentes, son las Pseudomonas spp., Arcanobacteriumpyogenes, Nocardia spp. y Serratia spp.

A partir de la década de los sesenta empezaron aplicarse en muchos países programas de control de mastitis que tuvieron un gran éxito en controlar los patógenos contagiosos y en disminuir la incidencia de mastitis clínicas y subclínicas y el RCS de la leche de tanque [4]. Sin embargo, en este mismo periodo también se ha observado un incremento absoluto y relativo de mastitis provocadas por patógenos ambientales. Además, los programas de control de mastitis instaurados también parecen ser menos efectivos en reducir la prevalencia de los ECN [27], por lo que ha aumentado la importancia relativa de las mastitis provocadas por este grupo de gérmenes, e incluso en muchos casos se han convertido en el grupo de patógenos con mayor prevalencia [17, 23]. Por otra parte, estudios relativamente recientes, basados en la identificación del ADN bacteriano, han demostrado la persistencia de algunas enterobacterias, ya que infectan la glándula mamaria en el periodo seco y permanecen de modo subclínico durante los primeros 100 días de la lactación, provocando simultáneamente brotes de mastitis clínicas [4]. Este autor sugiere que durante estos últimos años es posible que ciertas cepas de gérmenes como E. coli, con capacidad de adquirir ADN exógeno, hayan sufrido un proceso de adaptación al medio ambiente mamario y hayan adquirido ciertos mecanismos (mayor capacidad de adherencia al tejido mamario, de secuestrar hierro y de sobrevivir dentro de los neutrófilos de la mama) que les permiten provocar mamitis persistentes o crónicas, así como mamitis clínicas recurrentes [9]. Lo mismo podría ocurrir con algunos estreptococos ambientales Str. uberis; [34].

MATERIALES Y METODOS

Diseño Experimental

El experimento se llevó a cabo en 10 explotaciones pertenecientes a (ASOCRICA). En la mitad de ellas las vacas estaban estabuladas permanentemente, mientras que en la otra mitad los animales practicaban el pastoreo. Todas las explotaciones elegidas tenían más de 80 vacas.

Con objeto de poder separar los efectos “estación” (época del año), “estado de lactación” y “número de lactación” de las vacas, se planteó un diseño experimental que consistió en realizar tres controles (Febrero-Marzo, Junio-Julio, Noviembre) de 51 animales de cada explotación distribuidos de acuerdo a la Tabla 1. En el primer control los animales fueron elegidos al azar, de entre todos los que reunían las características de número y estado de lactación especificados en la citada Tabla I.

TABLA I - NÚMERO DE VACAS MUESTREADAS EN CADA CONTROL, SEGÚN NÚMERO Y ESTADO DE LACTACIÓN.

En el segundo control, cuatro meses después del primero, inicialmente se intentaron muestrear las mismas vacas del primer control. Sin embargo, también fue necesario incorporar nuevos animales para sustituir a los que ya no se encontraban en lactación (secas de las vacas, control y sistema de explotacióno eliminadas) o ya no estaban al inicio de la lactancia, y así mantener el plan de muestreo explicitado en la tabla anterior. Esta misma planificación del muestreo se siguió en el tercer control. En total se tomaron 1.530 muestras de leche individual (51 x 10 explotaciones x 3 controles), procedentes de 958 vacas (406 de 1 parto y 552 ≥ 2 partos).

VARIABLES REGISTRADAS

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO

Este análisis se llevó a cabo para identificar la presencia de mamitis subclínica a nivel de ubre. Las muestras de leche se tomaban antes del ordeño, recogiendo una mezcla de leche de los cuatro pezones de cada animal. Previamente se limpiaba el extremo de cada pezón con algodón empapado en alcohol isopropilico al 70%; a continuación se eliminaban los primeros chorros y se recogían unos 2 ml de cada pezón (total unos 7-8 ml) en un único tubo estéril de unos 10 ml de capacidad. Con objeto de disminuir los riesgos de contaminación en la recogida de muestras, los pezones de una ubre se limpiaban empezando desde los más alejados hasta los más cercanos al operario, mientras que la toma de la muestra se llevaba a cabo en orden inverso.

Las muestras se mantuvieron en refrigeración (4-8 ºC), un máximo de 6 horas, mientras eran transportadas hasta el laboratorio. A continuación fueron congeladas a -20 °C durante una semana, como máximo, antes de proceder a su análisis. Para realizar la siembra en medio de cultivo, las muestras se atemperaban previamente en baño María a 37 ºC hasta alcanzar una temperatura de 18-20 ºC. A continuación, con un asa de platino calibrada se sembraban, mediante frotis, 0.01 ml de leche en placas petri con agar-sangre, agar sal manitol y agar McConkey. Las placas se incubaban a 37 ºC durante tres días, realizando lecturas diarias. La identificación, a nivel de grandes grupos bacterianos, se realizó según:

a) Las características de las colonias en cada medio de cultivo.

b) Resultados de la tinción Gram.

c) Pruebas de catalasa, coagulasa, fermentadores o no en agar-esculina y la prueba de CAMP.

Los criterios utilizados para identificar los principales grupos bacterianos se han resumido en la Tabla II.

TABLA II - CRITERIOS UTILIZADOS PARA IDENTIFICAR LOS PRINCIPALES GRUPOS BACTERIANOS RESPONSABLES DE PROVOCAR MASTITIS SUBCLÍNICAS.

En la Figura 1 se han recogido las especies y grupos bacterianos aislados en cada una de las explotaciones muestreadas.

FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE BACTERIAS EN EL TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS

Puede observarse que, considerando conjuntamente todos los controles realizados, la mayoría de las infecciones mamarias estuvieron causadas por tres grupos de gérmenes: ECN (32.9 %), Streptococcus spp. (31.9 %) y Staphylococcus aureus (23 %). Por el contrario, Strep. agalactiae (2.5 %), Corynebacterium spp. (3.5 %) y los gérmenes Gram negativo (Coliformes: 4.6 % y Otros Gram negativo: 1.5 %) fueron asilados en bajos porcentajes. Podemos destacar que la prevalencia de S. aureus en las 10 explotaciones fue muy variable. Así, hubo granjas en las que apenas se aisló este germen (granjas 2, 7 y 8, con 2.5 %, 0 % y 4.9 % de las IIM) mientras que en la explotación 9 se identificó en el 62 % de las infecciones intramamarias (prevalencia media de S. aureus de casi el 50 % de las vacas). Por otra parte, también es remarcable que no se aisló Str. agalactiae en 4 de las 5 granjas que estaban en estabulación (granjas 2, 3, 4 y 5).

En la Tabla III se presenta la distribución de las especies/grupos bacterianos en cada uno de los tres controles realizados. Aunque la distribución no varió significativamente, puede apreciarse que los estafilococos fueron más frecuentes en el control de Noviembre (S. aureus 27.9 %; ECN.: 35.7 %), los estreptococos en el control de Julio (Streptococcus spp.: 35 %) y, finalmente, las Corinebacterias, los Coliformes y los Otros Gram-negativo en el control de Febrero (6.2 %, 6.2 % y 3.9 %, respectivamente.

TABLA III - DISTRIBUCIÓN DE LAS BACTERIAS AISLADAS EN CADA UNO DE LOS CONTROLESREALIZADOS.

La etiología de las IIM fue muy similar en las vacas de primer parto y en las de 2 o más partos (Tabla IV), así como en las explotaciones con estabulación y en las que practicaban el pastoreo (Tabla V). Sin embargo, hubo ciertas diferencias con el estado de lactación de los animales (Tabla VI). Así, a medida que avanzaba la lactación tendieron a disminuir las infecciones causadas por los estafilococos (S. aureus: 26.9 % y 19.6 % en el inicio y final de la lactación, respectivamente; ECN: 34 % y 30.9 %, respectivamente) y por Str. agalactiae (5 %, 0.6 % y 2.1 % en el inicio, mitad y final de la lactación, respectivamente). Por el contrario, al avanzar la lactación el porcentaje de infecciones causadas por Streptococcus spp. aumentaron (25.5 %; 33.8 % y 38.1 % en inicio, mitad y final de la lactación). A pesar de lo señalado, el Test de Chi-cuadrado no mostró que existieran diferencias significativas en la distribución de los gérmenes según el número de lactación, el sistema de explotación ni el estado de lactación de los animales.

TABLA IV - DISTRIBUCIÓN DE LAS BACTERIAS AISLADAS SEGÚN EL NÚMERO DE LACTACIÓN DE LAS VACAS.

TABLA V. DISTRIBUCIÓN DE LAS BACTERIAS AISLADAS SEGÚN EL SISTEMA DE EXPLOTACIÓN UTILIZADO EN LAS 10 GRANJAS MUESTREADAS.

TABLA VI. DISTRIBUCIÓN DE LAS BACTERIAS AISLADAS SEGÚN EL ESTADO DE LACTACIÓN DE LAS VACAS

a) VACAS SEPARADAS SEGÚN NÚMERO DE LACTACIÓN

b) Todas la vaca

DISCUSION

Etiología de las IIM.

La prevalencia global de S. aureus fue relativamente baja (6%; 91 aislamientos de 1.503 muestras), si bien hubo mucha variabilidad entre granjas (0% a 31%). Así mismo, de media este germen se aisló en el 23% de las ubres infectadas. Estos valores son similares a los hallados en otros trabajos realizados en explotaciones de nuestro entorno (S. aureus identificado en el 24-30% de los aislamientos) [24, 10] e incluso de otros países con vacas Frisonas/Holstein [22]: 8% de prevalencia y 22% de los aislamientos; [8]: 7.6% de prevalencia; [33]: 9% de prevalencia). No obstante, también existen estudios en los que este germen se ha aislado con una frecuencia menor [20]: 3.4% de prevalencia y 10% de los aislamientos) y mayor [16]; 22% de las vacas; [13]: 41% de los aislamientos; [7]: 22% de prevalencia) respecto a los obtenidos en nuestro trabajo.

También podemos destacar la baja prevalencia de Str. agalactiae, ya que tan solo se identificó en el 2.5% de los aislamientos y en 4 explotaciones no se aisló ningún caso. Esta prevalencia es ligeramente superior a la observado en muchos países que llevan a cabo planes de control de mamitis y que tienen como objetivo eliminar este germen de las explotaciones [22]: 0.9% de los aislamientos; [18]: 0.9% de prevalencia y 1.3% de los aislamientos; [20]: menos del 0.07% de los aislamientos; [16]: 0% de los aislamientos). Sorprendentemente, este germen aún está lejos de ser erradicado en ciertas zonas de EE.UU. (10% de las vacas infectadas por Strep. agalactiae: [33].

El grupo de ECN y el grupo de Streptococcus spp. (estreptococos no agalactiae) fueron los gérmenes más frecuentemente aislados (32.9% y 31.9%), lo cual coincide parcialmente con lo observado en la mayoría de trabajos de la bibliografía. Por ejemplo, [14] y [10, 11] encuentran una mayor frecuencia de ECN (37-67%) y una menor frecuencia de Streptococcus spp. (11-26%) a los hallados en nuestro trabajo. En este sentido debemos destacar que suele ser frecuente que, tras aplicar un programa de control de mamitis, los ECN pasan a ser los patógenos que más predominan, tal y como se ha observado en muchos estudios [20, 5, 29, 23]. Aun así, también existen trabajos en los que se observa que los Streptococcus spp. son más prevalentes que los ECN [18].

La baja prevalencia de las corinebacterias (3.5% de los aislamientos) y los gérmenes Gram-negativo (4.6% de Coliformes; 1.5% de otros Gram-negativo) también coincide con otros trabajos. Por ejemplo, [14], en un trabajo realizado durante cuatro años, siempre obtuvo que las corinebacterias representaban menos del 2.8% de los aislamientos, y [16] solo aíslan 2 casos de corinebacterias en 14.152 muestras tomadas de cuarterones. Por el contrario, también existen estudios que muestran una relativa elevada prevalencia de estos patógenos (17% de los aislamientos en el trabajo de [18]; 34% de los aislamientos en [20]; 24% en [2]. En relación a los gérmenes Gram-negativo, normalmente representan menos del 5% de los aislamientos [33, 16, 22, 8], aunque en algunos casos han llegado a representar más del 10% de los aislamientos [14,18].

La distribución de los gérmenes responsables de las IIM varió poco según la época de muestreo (Febrero, Julio y Noviembre), lo cual podría ser explicado porque las condiciones ambientales (principalmente temperatura) apenas variaron durante los meses en que se desarrolló el experimento. En este sentido debemos mencionar que, en otros países más fríos, se ha encontrado cierta estacionalidad en la etiología de las IIM. Por ejemplo, [29], en Alemania, encuentran que la prevalencia de S. aureus, ECN y coliformes fue más elevada en verano, mientras que la prevalencia de los estreptococos fue superior en invierno. [16], en Noruega, también encontraron una mayor prevalencia de S. aureus en el verano. En el caso concreto de Str. uberis, también se ha descrito que se aíslan con mayor frecuencia en el verano [30,16].

En nuestro trabajo tampoco hemos encontrado importantes diferencias de la etiología según el número de lactación de las vacas. Particularmente, la distribución de los aislamientos de S. aureus fue muy similar en las vacas primíparas (24.5%) y multíparas (22%), lo que coincide con otros trabajos [34, 20, 16]. Sin embargo, algunos autores han encontrado que la prevalencia de ECN es más elevada en las vacas primíparas, respecto a las multíparas [21, 28], lo que discrepa de lo encontrado en nuestro estudio (32.7% y 33.1% de los aislamientos en vacas primíparas y multíparas, respectivamente). Finalmente, el hecho de que S. aureus tendiera a disminuir a medida que avanza la lactación (particularmente en las vacas multíparas) también fue observado por [16].

CONCLUSIONES

La mayoría de las infecciones intramamarias fueron ocasionadas por ECN (32.9% de los aislamientos), Streptococcus spp (31.9%) y Staphylococcus aureus (23.0%). El resto de gérmenes (S. agalactiae, Corynebacterium spp., coliformes y otros bacilos Gram-negativo) representaron, cada uno, menos del 5% de las IIM.