Uso de levadura (Pichia kudriavzevii) sola y en combinación con micotoxina y coccidiostático sobre el comportamiento productivo de pollos parrilleros

Las micotoxinas son metabolitos tóxicos secundarios producidos principalmente por los siguientes géneros fúngicos Aspergillus, Penicillium, Fusarium, and Alternaria, presentes frecuentemente tanto en las materias primas como en los alimentos terminados. En condiciones favorables, los hongos pueden sintetizar micotoxinas y acumularse en las materia primas. Este proceso puede ocurrir durante el crecimiento del cultivo, durante el almacenamiento, posterior a la cosecha o durante el almacenamiento del alimento terminado (CAST, 2003). La contaminación de las materias primas y los alimentos terminados con micotoxinas son un problema de importancia mundial, debido a las pérdidas económicas ocasionadas en la producción animal en los países en desarrollo. Las aflatoxinas (AFs) son principalmente producidas por Aspergillus flavus y A. parasiticus, siendo de gran preocupaciónen la producción avícola (Bhat et al., 2010). Las AFs causan graves pérdidas económicas y problemas de salud en la industria avícola debido a su toxicidad y frecuencia de ocurrencia en los alimentos balanceados (Nemati et al., 2014a). La toxicidad de las AFs en pollos parrilleros ha sido ampliamente investigada por sus efectos carcinogénicos, mutagénicos, teratogénicos y la inhibición del crecimiento (Oğuz et al., 2000a; Sur y Celik, 2003; Magnoli et al., 2011a; Gutleba et al., 2015). Otros efectos adversos conocidos de las AFs son los cambios bioquímico-hematológico e inmunológico (Oğuz et al., 2000a; Manafi et al., 2014; Nemati et al., 2015). La presencia de cepas productoras de AFsen alimentos balanceados comerciales para aves ha sido ampliamente reportada en estudios previos (Oliveira et al., 2006; Fraga et al., 2007; Monge et al., 2013). El contenido de AFs en la mayoría de los alimentos avícolas de Argentina es más alto que el nivel máximo permitido de 20 μg/kg de alimento (Monge et al., 2013). La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) establece niveles reguladores de 20 μg/kg de aflatoxina para las aves de corral (Bhat et al., 2010). La producción avícola creció mucho en los últimos años en Argentina, siendo uno de los sistemas de producción animal más importantes, adquiriendo gran importancia económica, principalmente en el sector de la producción de carne (Lamelas et al., 2010).

El objetivo de los productores, investigadores y gobiernos es desarrollar tecnologías efectivas de gestión en la prevención y descontaminación para minimizar los efectos tóxicos de la AFs en la producción animal. Varios adsorbentes naturales como las zeolitas, bentonitas y clinoptilolita, han sido evaluadas tanto en estudios in vitro (Chiacchiera et al., 2000) como in vivo por su capacidad para adsorber AFs (Miazzo et al., 2000, 2005; Oğuz et al., 2000a, 2000b; Magnoli et al., 2011a, 2011b; Nemati et al., 2014b). Estos productos están disponibles como aditivos comerciales, sus niveles de inclusión son altos y pueden tener efectos negativos, al reducir el valor nutricional de los alimentos o producir efectos secundarios indeseables (Zain, 2011). Diferentes estudios han indicado que las paredes celulares de Saccharomyces cerevisiae se pueden agregar a alimentos contaminados, para unir selectivamente micotoxinas (Yiannikouris et al., 2003, 2004). Estos autores afirman que el complejo levadura-toxina pasa a través del tracto digestivo sin ningún efecto negativo en los animales o cualquier transferencia a productos animales comestibles como leche, huevos o carne (Yiannikouris et al., 2003, 2004).

La monensina sódica (MON) es un miembro de una familia de compuestos conocida como antibióticos poliéteres ionóforos del ácido carboxílico. Su principal aplicación terapéutica es como un aditivo alimentario para aves de corral para prevenir la coccidiosis (Schwarz et al., 2001). Debido a que muchas de las pérdidas económicas asociadas con la coccidiosis tienen lugar antes del diagnóstico, la prevención se vuelve más importante que el tratamiento (Elliott et al., 1998). Gray et al. 1998; Dusi y Gamba, 1999 y Magnoli et al . 2011a,b, informaron el efecto interactivo de la bentonita sódica y la MON. De hecho, informaron que la MON puede reducir la eficacia de una bentonita sódica para adsorber AFs. Sin embargo, no se sabe si la presencia de MON puede afectar la capacidad de las levaduras para enlazar AFs.

Por lo expuesto anteriormente el objetivo de este estudio fue evaluar la eficiencia in vivo de una cepa autóctona del medio ambiente aviar, Pichia kudriavzevii, para prevenir los efectos tóxicos de la aflatoxina B₁ sola y en combinación con monensina sobre parámetros productivos en pollos parrilleros.

Producción de levadura:Pichia kudriavzevii fue aislada de alimento balanceado de pollos parrilleros y caracterizada molecularmente por Magnoli et al. (2016). Además, en un estudio in vitro realizado previamente se demostró la capacidad de esta levadura para adsorber AFB₁ (Magnoli et al. 2016). La cepa fue depositada en la colección de cultivos de Micología y Micotoxicología de la Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. La biomasa de levadura se obtuvo a partir de 24 h de cultivo en caldo de levadura-peptona-dextrosa (YPD) en un fermentador a 28ºC, con agitación. Después de producida la biomasa, las células fueron centrifugadas y liofilizadas para ser añadidas a las diferentes dietas al 0,1% p/p.

Producción de aflatoxina B₁: la AFB₁ fue producida por fermentación del arroz por A. parasiticus NRRL 2999 (USDA, Agricultural Research Service, Peoria, IL). A los 7 días el arroz conteniendo el hongo fue autoclavado y secado durante 48 h 40 ºC en una estufa de aire forzado, posteriormente el arroz se molió. El producto molido obtenido fue cuantificado por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) con detector de fluorescencia de acuerdo a la metodología descripta por Trucksess et al. (1994). La concentración de AFB₁ del producto molido fue de (60 ± 1,1 μg/g). Una cantidad determinada del producto molido fue agregado a la dieta basal para proporcionar una concentración aproximada de 100 - 150 μg de AFB₁/kg de alimento.

Ensayo in vivo: el ensayo fue realizado en las instalaciones de la Universidad Nacional de Rio Cuarto. Se utilizaron pollos parrilleros de la línea comercial Cobb vacunados contra Marek de un día de edad; lo que fueron previamente sexados, y alimentados ad libitumhasta los 33 días de edad. Un total de 120 pollos, 3 réplicas por tratamiento, 8 tratamientos, con 5 pollos por réplica fueron pesados individualmente y seleccionados al azar. Durante el período experimental fueron mantenidos a la temperatura adecuada de acuerdo a las exigencias de la edad y con iluminación fluorescente continua. Las aves fueron alimentadas con una dieta iniciadora comercial hasta el día 33 de edad (final de la experiencia, 28 días de experimentación). La dieta iniciadora basal fue realizada en base a maíz y soja cumpliendo con los requerimientos de acuerdo con la Nacional Research Council (NRC, 1994). A partir de la dieta iniciadora basal se prepararon las diferentes dietas experimentales para cada uno de los tratamientos: tratamiento 1 (T1): dieta basal (DB); T2: DB + monensina (MON) (50 mg/kg); T3: DB + levadura (0,1%); T4: DB + AFB₁ (100 μg/kg); T5: DB+ MON (50 mg/kg) + levadura (0,1%); T6: DB + AFB₁ (100 μg/kg) + levadura (0,1%); T7: DB + AFB₁ (100 μg/ kg) + MON (50 mg/kg) + levadura (0,1%); T8: DB + AFB₁ (100 μg/kg) + MON (50 mg/kg). Las diferentes dietas experimentales fueron suministradas a partir del quinto día de edad para asegurar una buena adaptación y homogenización del lote hasta los 33 días de edad. Diariamente se monitorearon signos de morbilidad y mortalidad en las aves. Al final del ensayo, se evaluó la eficiencia de la levadura y sus combinaciones con MON y AFB₁ midiendo los parámetros productivos: ganancia media diaria por ave (GMD g/d/ave), consumo medio diario por ave (CMD g/d/ave), índice de conversión (IC), peso de la carcasa (PC), peso de muslos (PM), peso pechuga (PP), peso de hígado (PH) y pesos de los órganos inmunológicos como bazo (PB), timo (PT) y bolsa de Fabricio (PBF). Para la determinación de la GMD las aves fueron pesadas al inicio y al final de la experiencia, el CMD fue determinado por diferencia entre la cantidad de alimento suministrado diariamente y el alimento remanente al final de la experiencia, el IC fue determinado teniendo en cuenta el alimento consumido versus la ganancia de peso de cada tratamiento.

Determinación de AFB₁ en alimento balanceado: la determinación de AFB₁ en cada una de las dietas experimentales se llevó a cabo siguiendo la metodología propuesta por Trucksess et al. (1994). El tiempo de retención para AFB₁ fue de 4,7 min y el límite de detección fue de 0,001 μg/ml. Los niveles de AFB₁ en la dieta basal fueron de 3 ± 1 mg/kg (T1, T2, T3 y T5) (contaminación natural) y 100 ± 6 mg/ kg de AFB₁ para las dietas T4, T6, T7 y T8. Los análisis se realizaron por triplicado. Si bien los niveles de otras micotoxinas no fueron determinados, los animales no presentaron sintomatología asociada a deoxinivalenol, nivalenol, zearalenona, ocratoxina A, fumonisinas B1+B2 y toxinas T-2 y HT-2.

Examen patológico: a los 28 días de experiencia es decir a los 33 días de edad de las aves, el ensayo concluyó y se seleccionaron 3 aves de cada réplica de cada tratamiento al azar, se les extrajo sangre de la vena subclavia, para evaluar los parámetros bioquímicos como proteínas totales (PT), albúmina (ALB), globulina (GLOB) y la relación albúmina:globulina (ALB:GLOB). A las muestras de sangre se les agregó heparina, para evitar la coagulación, se centrifugaron y el plasma obtenido se almacenó a -20°C hasta su análisis. Las determinaciones bioquímicas de PT, ALB, GLOB y la relación ALB:GLOB se determinaron con un kit comercial de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante (Laboratorio Wiener, 2000). Los valores bioquímicos de plasma se agruparon y se expresaron como valores medios. A continuación, se llevó a cabo la eutanasia por sangría a blanco como lo recomienda el comité de ética de la UNRC. Posteriormente se procedió a la necropsia detallada de las aves. Se determinó el peso de los hígados, carcasas, muslos, pechugas y de los órganos inmunológicos (bazo, timo y bolsa de Fabricio).

Análisis estadísticos de los datos: los datos experimentales se analizaron mediante el software estadístico InfoStat 2008. Las medias de los tratamientos que mostraron diferencias significativas en el análisis de varianza (ANOVA) fueron comparadas usando el test de la mínima diferencia significativa de Fisher’s. La significancia estadística fue aceptada a un p< 0,05 (Balzarini et al. 2008).

En la tabla 1 se muestran los efectos de la inclusión de levadura y/o monensina sobre parámetros productivos en pollos parrilleros alimentados con aflatoxina B₁ durante 28 días. Los valores de ganancia media diaria (GMD) demostraron diferencias significativas (p< 0,05) entre las aves alimentadas con la levadura (T3) y las aves alimentadas con AFB₁ (T4). La GMD de las aves alimentadas con AFB₁ y con levadura (T6) si bien no mostraron diferencias significativas (p< 0,05) comparadas con los otros tratamientos, el valor de este parámetro fue mayor en el tratamiento T6 y fue menor en el tratamiento T4. Si bien no mostró diferencias significativas (p< 0,05) la GMD de las aves alimentadas con MON (T2) y con MON más AFB₁ (T8), mostraron valores inferiores comparado con las aves alimentadas con MON más levadura (T5 y T7). En cuanto al CMD se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p< 0,05). Tanto el agregado de MON, levadura como AFB₁ aumentaron el CMD con respecto a la dieta basal. En cuanto al índice de conversión (IC) se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p< 0,05). Los tratamientos T4, T5, T6, T7 y T8 presentaron los valores más altos, al comparar este parámetro productivo con los valores obtenidos por los tratamientos T1, T2 y T3, los cuales presentaron los menores valores de índice de conversión.

Tabla 1. Efectos de la inclusión de levadura y/o monensina sobre parámetros productivos en pollos parrilleros alimentados con aflatoxina B₁ durante 28 días.

En la Tabla 1 se muestra el peso de las carcasas de los diferentes tratamientos. No se observaron diferencias significativas (p< 0,05) en el peso de la carcasa entre los tratamientos. Sin embargo, los pesos de la carcasa de las aves alimentadas con AFB₁ y MON (T8) presentaron los valores más bajos al compararlos con los otros tratamientos. Cuando se analizaron los pesos de pata muslo, pechuga, órganos inmunológicos (bazo, timo y bolsa de Fabricio), y los parámetros bioquímicos, no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p< 0,05) (datos no mostrados).

En este estudio se evaluó la eficiencia in vivo de una cepa autóctona del medio ambiente aviar, P. kudriavzevii, para prevenir los efectos tóxicos dela aflatoxina B₁ (AFB₁) sola y en combinación con monensina (MON) sobre parámetros productivos en pollos parrillero. En este estudio la GMD de peso fue mayor en las aves alimentadas con levadura, que aquellas alimentadas con AFB_1. Este parámetro se vio afectado en las aves alimentadas con MON sola y en combinación con AFB₁. En cuanto al consumo de alimento fue mayor en todos los tratamientos de las aves alimentadas con levadura; como así también aquellas aves alimentadas con AFB₁ más MON. La presencia de la levadura sola mejoró significativamente el índice de conversión. Estos resultados coinciden con los informados por Afzal y Saleem (2004) quienes observaron una mejoría importante en la GMD y en el IC en pollos parrilleros alimentados con un desintoxicante de micotoxinas basado en levaduras en dietas contaminada con 170 μg/kg AFB₁. En forma similar, Celik et al. (2001) y Juan-Juan et al. (2010) demostraron que la adición de extractos de células de levadura a una dieta que contenía 100 μg/kg de AFB₁ tuvo efectos mejoradores en el rendimiento de los pollos parrilleros y los parámetros bioquímicos. Hashmi et al. (2006) si bien no encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, los valores obtenidos para el consumo de alimento, el aumento de peso y la relación de conversión alimenticia indicaron una eficiente disminución de los efectos tóxicos de la AFB₁ al suplementar con levadura (1%) y mananoligosacáridos (0,26%) a dietas de pollos contaminadas con 100, 200 y 300 μg/kg de AFB₁. Similares resultados también fueron observados por Motawe et al. (2014) quienes demostraron GMD inferior, CMD menor e IC alterado en pollos parrilleros alimentados con dietas contaminadas con 0,5 y 1 mg/kg de AFB₁. Estudios previos realizados por nuestro grupo de trabajo con pollos parrilleros alimentados con 100 μg/kg de AFB₁ más el agregado de 0,1% de levadura durante un período de 22 días mostraron mejoras significativas en la GMD y en el CMD con el agregado de la levadura, sin embargo el IC no mostró diferencias significativas (Magnoli et al., 2017). Es importante destacar que si bien no hubo diferencias significativas, las aves alimentadas con AFB₁ y MON presentaron los menores valores de peso de carcasa. En concordancia con Magnoli et al., (2017), no se detectaron diferencias significativas en parámetros bioquímicos y en el peso de los órganos inmunológicos e hígado en aves alimentadas con 100 ± 6 μg/kg de AFB₁. Estos resultados se deben probablemente a los bajos niveles de inclusión de AFB₁ consumidos y al corto tiempo de exposición.