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XIII Congreso Internacional AVEM 2020

Exposición entérica a deoxinivalenol y ruptura de la integridad intestinal

Publicado el: 8/4/2020
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Resumen

Investigaciones recientes han demostrado que el deoxinivalenol (DON) tiene la capacidad de afectar la integridad del epitelio intestinal. Teniendo en cuenta que DON es una micotoxina encontrada muy comúnmente en numerosos ingredientes de los alimentos concentrados, se ha estudiado ampliamente el daño que causa en el epitelio intestinal y su repercusión sistémica. Importantes procesos fisiológicos como los de barrera intestinal, su capacidad para digerir ingredientes y absorber nutrientes pueden ser afectados negativamente con la exposición del epitelio intestinal a DON. Adicionalmente, la exposición del epitelio intestinal a DON puede resultar en translocación bacteriana ocasionando una infección sistémica, baja absorción de nutrientes y un menor desempeño zootécnico. El objetivo de este estudio es evaluar el daño causado por DON en el epitelio intestinal a través de dos metodologías de medición de la permeabilidad entérica: filtración de 14C-mannitol a través de la mucosa entérica en los intestinos largo y delgado y la translocación de E. coli desde el intestino y su colonización en órganos internos de las aves después de la exposición a DON. Un total de 75 pollitos broiler (Ross 308) de un día de edad fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos y alojados en corrales (n = 25 ; 5 réplicas/grupo) . Los tratamientos consistieron en un control negativo no retado (NEG) y dos grupos desafiados con 5 mg DON/kg de alimento y 10 mg DON/kg de alimento. Las aves fueron alimentadas con sus correspondientes dietas durante sus 5 semanas de vida. Todos los test fueron desarrollados usando un modelo lineal general multivariado test de rango múltiple Duncan y un software estadístico 24 IBM SPSS (Chicago, IL, USA). Los hallazgos arrojaron una diferencia significativa en peso corporal (PC) y ganancia de PC de las aves alimentadas con 10 mg/kg en comparación con las alimentadas con 5 mg/kg de DON y el grupo control. Adicionalmente, niveles significativos (P < 0.05) de filtración de manitol fueron encontrados en yeyuno y ciego en los grupos que ingirieron alimento contaminado con DON en comparación con el grupo control. Acorde a estos resultados se encontró un mayor conteo de E. coli en hígado y bazo. Todos estos resultados sugieren que DON puede afectar negativamente la integridad del epitelio intestinal, su función de barrera y por lo tanto desencadenar una septicemia como consecuencia de la translocación de bacterias tales como E. coli y por lo tanto ocasionar un impacto negativo en la salud general de las aves.

Palabras Clave: Manitol, Permeabilidad, Translocación, Broilers, DON.


 

Introducción

Deoxynivalenol (DON) es la micotoxina más común dentro de los tricotecenos detectados en alimentos a nivel global. La presencia de DON no puede ser evitada y representa un riesgo permanente que puede afectar a animales y humanos, no únicamente su integridad intestinal sino también otros órganos y sistemas como el inmune, endocrino y nervioso (Maresca 2013). Los efectos causados por DON dependen de su concentración y tiempo de exposición (Awad et al. 2010, 2012a, 2013; Grenier and Applegate 2013; Pinton and Oswald 2014).
 
Numerosos estudios han concluido que la exposición del intestino a DON puede comprometer su integridad por numerosas razones. Primero que todo debido a que cuando hay contacto con DON, el intestino está expuesto por mayor tiempo en comparación a otros tejidos (Awad et al. 2007a, 2011; Ghareeb et al. 2013, 2015). Segundo, el epitelio intestinal tiene una rata de regeneración muy acelerada en comparación a otros tejidos (Osselaere et al. 2013) y este tipo de células son un blanco principal para la acción inhibitoria de síntesis de proteínas de DON. Debido a la acción de DON en el epitelio intestinal hay evidencias que se afecta la resistencia del intestino a algunos agentes infecciosos (Vandenbroucke et al. 2011; Antonissen et al. 2014). El epitelio intestinal actúa principalmente como una barrera física que permite el paso selectivo de ciertas sustancias entre ellas nutrientes, agua, iones y al mismo tiempo restringe el paso de sustancias toxicas y microorganismos patógenos (Awad et al. 2015, 2018). Se ha postulado que la medición de la selectividad de esta permeabilidad puede ser utilizada como un mecanismo de evaluación de la integridad del epitelio intestinal.
 
Es importante entender los conceptos generales de la fisiopatología de algunos agentes etiológicos que vulneran la barrera intestinal así como también los fenómenos de la cascada de eventos que conforman la respuesta inflamatoria (Groschwitz and Hogan 2009; Odenwald and Turner 2013; Awad et al. 2017). Los efectos tóxicos de DON se manifiesta en diferentes maneras como son la regulación negativa del paso de nutrientes a través de la mono capa reduciendo su absorción así como su función de barrera. DON también altera funciones de las células caliciformes tales como: (1) la producción de moco que presta una función de barrera muy importante y (2) la producción de factores (trefoil factors) que promueven la regeneración del epitelio intestinal (Pinton et al. 2015; Graziani et al. 2019). A pesar de que se han desarrollado muchos estudios del daño ocasionado por DON en el intestino delgado, no hay mucha evidencia de su acción en el intestino grueso.
 
Adicionalmente, no se ha documentado el daño ocasionado por DON en la función de barrera del intestino en aves. Se ha documentado el daño que puede ocasionar DON en ratones desafiados vía oral (25 mg/kg) demostrando un incremento significativo del paso de FITC-dextran (Akbari et al. 2014). Por lo anterior, los propósitos principales del estudio son (1) evaluar el efecto que DON pueda tener en el intestino de aves mediante la medición del flujo de C-Manitol usando la técnica de cámara y (2) determinar la translocación de E. coli a órganos internos.
 
Materiales y Métodos

Las pruebas fueron aprobadas por el comité de ética científica de la Universidad de Medicina Veterinaria y el Ministerio de Ciencia e Investigación bajo la licencia número GZ 68.205/0159-WF/V/3b/2017. Se utilizaron 75 pollitos de un día (machos y hembras) obtenidos de una incubadora comercial (Ross- 308, Geflügelhof Schulz, Graz, Austria) y se dividieron aleatoriamente en 3 grupos (25 aves/5 réplicas/grupo).
 
Las aves fueron alojadas sobre viruta de madera y se oferto agua y alimento a voluntad. Los grupos fueron alimentados ya sea con ración contaminada (5 o 10 mg DON/kg alimento) o la dieta control a base de maíz, trigo, torta de soya, aceite de soya y una premezcla conteniendo vitaminas minerales, aminoácidos, sal y fosfato monocálcico. Los tipos de dieta según su contenido nutricional fueron iniciador desde el día 1 al 10 y uno de crecimiento desde el día 11 al 35. Muestras representativas de cada alimento fueron analizadas con el fin de determinar la concentración de DON y otras micotoxinas en la dieta. Las aves fueron monitoreadas diariamente ante cualquier sintomatología clínica.
 
El peso vivo fue obtenido cada semana y con base en este dato se calculó la ganancia de peso semanal. De igual manera se procedió con consume de alimento seminal y diario y con el cálculo de la conversión alimenticia (FCR) por grupo. En cada momento (21, 28 y 35 días de edad) se sacrificaron 5 aves de cada grupo desangrando por yugular bajo el efecto de una inyección previa con tiopental (1 mg/kg) en la vena del ala y se extrajo muestras de yeyuno, ciego, hígado y bazo para recuperación de E. coli bajo el método descrito abajo. Posteriormente, al final de la prueba, se sacrificaron 10 aves de cada grupo para realizar las mediciones por método de cámara.
 
Determinación de permeabilidad celular por método de cámara
Al final de la prueba se aisló epitelio usando cámaras como lo describe Awad et al. (2014a). El uso de la cámara es conectado a la mucosa y serosa en reservorio buferado que permite la separación de la mucosa y la serosa en soluciones buferadas. La rata de flujo de manitol (a concentración de 10 mM. Del radioactivo, (0.1 mCi/ml; Hartmann Analytic), fue adicionado a la solución mucosa. Luego de un periodo de 30 minutos se tomaron estándares del lado de mucosa en cada cámara y se estableció un flujo de 30 minutos tomando muestras de 0.6-mL por cada compartimento de la serosa (Aschenbach et al. 2000; Tavelin 2003). El epitelio fue incubado por cerca de 3 horas dividiendo entre los 3 periodos de flujo permitiendo la evaluación del efecto de DON (periodo de medida base) y posteriormente exposición de la hiperosmolaridad de la mucosa (periodo de desafío, incrementando la concentración del manitol luminal de 10 a 20 mM) y una persistencia de los efectos del desafío de hiperosmolaridad (periodo de persistencia). La presencia de la medición de la emisión β en la solución fue contada después de la adición del fluido (Aquasafe 300 Plus, Zinsser Analytic, Maidenhead, UK). El flujo indirecto de manitol desde la mucosa a la serosa por medio de la estimación por análisis de la solución rinse de la serosa como un radio del flujo/concentración como se ha descrito anteriormente (Aschenbach et al. 2000).
 
Conteo bacteriano
La cuantificación de E. coli en intestino (contenido cecal y de yeyuno), hígado y bazo. La muestra tomada fue equivalente a 1 g de heces/muestra, colectado de 10 aves por grupo en cada momento de sacrificio de aves, realizando posteriormente una dilución de 1:10 (wt:vol) en solución salina buferada fosfatada (PBS) (BR0014G, OXOID, Hampshire, UK). La mezcla fue homogenizada usando Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Germany). Finalmente, se realizaron multiples diluciones de cada muestra y 100 μl de cada una fueron ubicados en platos en duplicado sobre agar MacConkey (Scharlau, Barce- lona, Spain). Los platos se incubaron a 37 °C por 24 horas. Posterior al periodo de incubación, las colonias de incubación de E. coli fueron contadas como unidades formadoras de colonia por gramo.
 
Resultados

DON asociado a cambios con el peso vivo
El desempeño de las aves, en términos de peso vivo fue afectado (P < 0.1) al día 7 de vida en las aves alimentadas con 10 ppm/kg de alimento en comparación con otros grupos. Posteriormente, a los días 14, 21 y 28 de edad, se encontró pesos significativamente deprimidos en las aves alimentadas con la ración contaminada con 10 ppm/kg en comparación con otros grupos (P < 0.05, Fig. 1). El peso vivo semanal también fue afectado en los grupos tratados con DON. Sin embargo, este efecto se evidenció en mayor proporción al inicio de la prueba y disminuyo hacia el final de la misma.
Adicionalmente, el consumo de alimento fue inferior en los grupos consumiendo alimento contaminado con DON, esta reducción fue incrementada a mayor concentración de DON. Se observó un detrimento de la conversión alimenticia. Los resultados presentaron una recuperación compensatoria hacia el final de la prueba.
 
DON asociado a cambios de permeabilidad intestinal
Los resultados revelaron que la exposición a DON incrementa significativamente el flujo de manitol en el yeyuno de una manera dosis dependiente indicando un incremento en la permeabilidad a través del espacio paracelular. No se presentaron diferencias durante el periodo de línea base. Posteriormente, durante el periodo de desafío (segundo periodo de flujo), se presenta un incremento en la concentración de manitol luminal de 10 a 20 mM resultando en un incremento en el flujo de manitol de una manera no dosis dependiente, probablemente debido a una difusión pasiva. Sin embargo, el efecto de DON 10 fue más persistente en el ciego en comparación de DON 5, la diferencia fue más significativa con el paso del tiempo. Adicionalmente se encontró diferencia (P < 0.001) en cuanto a la permeabilidad paracelular en yeyuno y ciego en los grupos control y DON, siendo el flujo de manitol más alto en el ciego que en el yeyuno.
 
Influencia de DON en la colonización y translocación de E. coli
Las aves mostraron mayores niveles de E. coli en el yeyuno y ciego a los días 21 en comparación con el grupo control. Sin embargo, en el tiempo, no se encontró diferencias significativas en el conteo de E. coli en hígado y bazo de aves alimentadas con los diferentes tipos de dietas. Adicionalmente, al día 28 de edad, el conteo de E. coli resultó más alto en hígado y bazo en las aves alimentadas con raciones contaminadas con DON en comparación de las dietas control.
 
La translocación de E. coli no fue linealmente incrementada con el aumento de los niveles de DON y no se presentó una diferencia significativa entre DON 5 y DON 10 excepto que en la medición de translocación de E. coli en bazo a día 28 presentándose más alta en DON-5 en comparación con DON-10. Estos resultados demuestran que la translocación de E. coli hacia el hígado y el bazo es incrementada con la exposición del epitelio intestinal a DON en estadios tardíos de exposición. Los resultados proveen una clara evidencia que DON incrementa el paso vía paracelular de E. coli a través de la vía paracelular comprobándose mediante la recuperación de esta bacteria en hígado y bazo. Esto sugiere que el mecanismo mediante el cual la bacteria atraviesa la barrera intestinal posterior al suministro de DON es mediante la alteración de la capacidad de permeabilidad selectiva del tracto gastrointestinal.
 
Discusión

La contaminación de cereales con micotoxinas es un problema creciente al rededor del mundo con un considerable impacto en la salud de animales y humanos. La contaminación con DON del alimento terminado es una preocupación constante dado a su alto contenido de cereales. El mecanismo de acción de DON radica en su habilidad de inhibir la síntesis proteica y de inducir un estrés a nivel ribosomal caracterizado por la activación del MAPKs (Awad et al. 2014a, b; Ghareeb et al. 2016). Los numerosos estudios realizados con el objetivo de caracterizare el daño ocasionado por DON en el epitelio intestinal se fundamentan en la importancia que tiene el tracto gastrointestinal como un lugar inicial donde DON encuentra un primer contacto por medio del alimento contaminado. Numerosos son los perjuicios que puede ocasionar DON al epitelio intestinal, dentro de los que se tiene sus cambios a nivel morfológico (Awad et al. 2006a, b, Awad et al. 2011a, b; Kolf-Clauw et al. 2009), disrupción de la barrera intestinal incrementando su conductancia tisular (Awad et al. 2004, 2005a, b; Pinton et al. 2009; Awad and Zentek 2015), reducción de la absorción de nutrientes (Maresca et al. 2002; Awadet al. 2007a, 2011b), producción de moco, importante sustancia como parte de la función de barrera, producción de factores trefoil que contribuyen a la renovación del epitelio intestinal (Pinton et al. 2015; Graziani et al. 2019) y la modulación de la expresión de las proteínas estructurales de la zona paracelular del epitelio entérico (Pinton et al. 2009; Osselaere et al. 2013). Todos estos resultados indican que DON puede alterar la función de barrera del epitelio intestinal con consecuencias negativas en la eficiencia productiva.
 
Estudios realizados previamente han indicado que el impacto de DON en el desempeño de las aves fue contradictorio en comparación con resultados encontrados en otros tipos de animales debido a diferencias en razas de aves y composición de la dieta (Kubena et al. 1988, 1989; Dänicke et al. 2003; Awad et al. 2004, 2006a; Ghareeb et al. 2014). Sin embargo, en el presente estudio se evidenció que niveles de exposición de 10 mg/kg de alimento mostraron una inhibición de crecimiento de las aves mayor a las expuestas a 5 mg/kg, así como también las diferencias de pesos fueron más pronunciadas entre los grupos consumiendo raciones de 5 y 10 mg/kg de alimento en comparación al control. Estos resultados están en concordancia con estudios previamente realizados donde se demostró que la ingestión de alimento contaminado con DON afecta el crecimiento de las aves (Dänicke et al. 2003; Andretta et al. 2011; Awad et al. 2012b).
 
Los resultados revelaron que DON incrementa el flujo de manitol en el yeyuno de una manera dosis dependiente. Adicionalmente, estos efectos fueron más marcados en el ciego incluso a dosis más bajas de DON, lo que puede explicarse debido al efecto de DON en el transporte de nutrientes en el ciego y la secreción mucosa (Antonissen et al. 2015). Por otra parte, la absorción de manitol fue más elevada en el ciego que en yeyuno, toda vez que el ciego es el segmento del intestino el flujo paracelular es muy importante, lo que fue también demostrado en este estudio. A este respecto Amat et al. (1999) demostró que los segmentos medios y distal del ciego son regiones moderadamente estrechas indicando que la permeabilidad del ciego de las aves es diferente del intestino de los mamíferos (Awad et al. 2007b). Las aves poseen la mayor cantidad de bacterias en el ciego y juega un papel crucial en la modulación de la barrera epitelial del intestino (Awad et al. 2016a, b). La retención de la ingesta por un tiempo mayor en los ciegos permite que la fibra se desdoble de una manera más completa por parte de los microorganismos y en consecuencia se produzca una mayor cantidad de ácidos grasos de cadena corta (SCFAs) (Oakley et al. 2014). Las alteraciones en las concentraciones de SCFAs puede incrementar la translocación de patógenos entéricos bacterianos extra intestinales a sitios donde puede incrementar su virulencia por medio del desarrollo de la expresión de genes de invasión (Lawhon et al. 2002). Los resultados de este estudio mostraron claramente que DON puede incrementar la permeabilidad intestinal. Previas investigaciones han demostrado que la exposición del epitelio intestinal a DON torna el intestino más susceptible a infecciones entéricas, translocación y potencializa los procesos inflamatorios. En este contexto, la translocación del patógeno E. coli a través de las células epiteliales porcinas IPEC-1 se incrementa de manera dosis dependiente ante la exposición de DON (Pinton et al. 2009).
 
Uno de los resultados más significativos fue que dosis incluso no toxicas parecen ser capaces de afectar la función de barrera del epitelio intestinal permitiendo la translocación de bacterias como E. coli en células intestinales humanas Caco-2 (Maresca et al. 2008). De manera similar, una alta translocación de Salmonella typhimurium también se observó a través de células porcinas IPEC-j2 a exposición de bajas dosis de DON (Vandenbroucke et al. 2011). Adicionalmente a confirmar cambios en la permeabilidad de las células intestinales de aves, este estudio revelo, por primera vez, que DON incrementa inicialmente el paso de E. coli a hígado y bazo. Estos hallazgos están acorde con Pinton et al. (2009) y Maresca et al. (2008) quienes encontraron que DON promueve la translocación de E. coli a través del epitelio intestinal de células de epiteliales entéricas de humanos y cerdos. Los resultados indican que el efecto de DON sobre la translocación bacteriana radica principalmente en su capacidad de incrementar la permeabilidad entérica, esto puede ser promovido en cierta medida por los cambios en las concentraciones de SCFAs así también como también por la promoción de una mayor replicación de genes de invasión (Lawhon et al. 2002).
 
Analizando todos estos resultados juntos se puede indicar que la ingestión de alimento contaminado con DON incrementa la permeabilidad del epitelio intestinal. Por otra parte, DON puede alterar la colonización dinámica de ciertos microorganismos como se demostró con E. coli. DON promueve la translocación luminal bacteriana con posibles consecuencias sobre la salud animal.

Referencias bibliográficas

 
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"Me gusta" de Referentes: Marcelo César Ricci, Verena Starkl
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