Efecto sobre la mucosa intestinal de un antibiótico y un extracto vegetal polifenólico en pollos inoculados con Salmonella Enteritidis

Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) constituyen un importante problema de salud a nivel mundial. Las mismas se producen por el consumo de alimentos contaminados con microorganismos o bien por las sustancias tóxicas que ellos producen.

El género Salmonella es causante de ETA y el serotipo Enteritidis (SE) es frecuentemente reportada en todo el mundo como responsable de producir diarrea, morbilidad y, en ocasiones, la muerte de personas por el consumo de alimentos contaminados, especialmente de origen avícola3. El control en pollos parrilleros puede realizarse mediante el uso de antibióticos, pero en los últimos años, debido a las restricciones impuestas sobre estos productos, se comenzaron a estudiar agentes de origen natural. El objetivo del trabajo fue evaluar la respuesta en la mucosa intestinal en pollos que recibieron diversos aditivos en la dieta (antibiótico y extracto vegetal polifenólico), infectados con SE mediante la histología e histomorfometría intestinal

Se utilizaron 288 pollos parrilleros, hembra, de elevada uniformidad de la línea Cobb 500, de un día de edad que provenían de una planta de incubación de la zona de influencia de la Universidad Nacional de Luján (UNLu), a los que se les suministró el alimento y el agua ad libitum. El número de animales fue de 48 por tratamiento. Cada jaula fue equipada con comedero manual tipo canaleta, bebedero tipo niple, una lámpara eléctrica ubicada en el centro de cada jaula como fuente de calor y de luz y un tanque dosificador de agua.

La prueba, fue realizada en el bioterio avícola de la UNLu, en jaulas experimentales, en un ambiente semicontrolado con temperatura constante y aire filtrado.

Se evaluaron dos agentes promotores de crecimiento (APC), un extracto vegetal polifenólico (EVP) obtenido a partir de quebracho colorado (Schinopsis lorentzii) (Prosdócimo y col, 2010; Cejas y col, 2011;) y Bacitracina Metileno Disalicilato (BMD Alpharma).

Los animales fueron divididos al comienzo de la prueba, en seis tratamientos, con tres dietas diferentes y 18 aves por jaula (modelo factorial de 2 X 6).

Los tratamientos 2, 3, 5 y 6 recibieron el aditivo desde el día 1 al 35.

Todas las aves fueron pesadas al ser recibidas en el laboratorio con el objeto de obtener uniformidad.   El desafío se realizó al día 2 por vía ingluvial con la cepa de Salmonella Enteritidis Nal R 12 protocolo 285/94 cedida por el Dr. Horacio Terzolo del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) – Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Las cepas que fueron utilizadas se encontraban conservadas a -20ºC en agua peptonada bufferada con 20% de glicerol como crioprotector. En el momento de su uso fueron reactivadas por sucesivos repiques, en pollos parrilleros de 1 día de vida para incrementar su virulencia. Con el objeto de establecer su virulencia se determinó la dosis letal mínima, la que resultó ser de 103 ufc/ave, mientras que la dosis letal máxima fue de 107 ufc/ave.

Se realizaron muestreos a los 7, 14, 21, 28 y 35 días de edad, los animales fueron sacrificados a razón de cuatro por cada grupo de tratamiento, de acuerdo a las normas de bioética de la Universidad Nacional de Luján En cada uno de los días de muestreo se realizó la siguiente metodología:

Se utilizaron muestras de 1 gramo de ciego y unión cecal. Estos fueron colocados individualmente en 9 ml de agua peptonada bufferada (APB)-Oxoida 37°C por 18 ± 2 h. Posteriormente, se realizó un enriquecimiento, transfiriendo 0,1 ml de APB a 10 ml de caldo Rapapport – Vassiliadis con soja (RVS)-Oxoid. Después de la incubación por 24 ±1 h a 42°C se sembró por agotamiento una ansada en placa en agar verde brillante (AGV)-Oxoid, un medio selectivo y diferencial, adicionado con 10 μg por ml de ácido nalidíxico (Sigma) para el caso de SEI y con 20 microgramos por ml de noboviocina (Sigma) para SG. Las placas fueron incubadas posteriormente por un periodo de 24 ± 1h a 37 ° C. Luego de su aislamiento se identificó la bacteria por medio de pruebas bioquímicas específicas (agar hierro tres azucares, agar Lisina hierro, agar urea, agar citrato Simmons, medio-indolmovilidad, Caldo MR-VP) (Voogt et al., 2001; SENASA, 2002; SENASA, 2004).

- Se realizó la extracción de muestras de duodeno, yeyuno, íleon y ciego, para la histología, con evaluación cualitativa utilizando un score, e histomorfometría, con evaluación cuantitativa, en las muestras de los diferentes tramos de intestino. La muestra de duodeno fue tomada a nivel de la flexura, la de yeyuno en la unión con el divertículo de Meckel mientras que la de íleon y ciego en la unión ileocecal. Se fijaron en formol al 10 % para luego procesarlas bajo procedimientos estandarizados realizando cortes que se colocaron en “cassettes” para ser deshidratados en alcoholes de graduaciones crecientes y su posterior aclaramiento en xilol. La inclusión se realizó en una estufa de cultivo con parafina. Los tacos se cortaron con un micrótomo de rotación Rietchert-Jung con cortes de 5 micras y fueron coloreadas con Hematoxilina- Eosina. Luego se procedió a realizar la evaluación cualitativa (tabla 1) y cuantitativa con el programa Image J, con el que se determina la longitud de las vellosidades, la profundidad de las criptas de Lieberkühn y la relación vellosidad – cripta.

Tabla 1: score de lesión en la mucosa intestinal con sus características histológicas observadas, Gibson, 2013.

Los valores de las variables: peso de aves y consumo de alimento, fueron sometidos al análisis de varianza. Cuando se encontraron diferencias significativas en el orden p < 0,05% se analizaron con el objetivo de establecer diferencias significativas entre los tratamientos con el test de comparaciones múltiples de Tukey.

Lo mismo se realizó con el recuento de las Unidades Formadoras de Colonia, pero primero se lo transformó en logaritmo de base 10. En el caso de las muestras que fueron positivas después de haberse realizado un enriquecimiento, pero no se obtuvo un recuento de UFC, se les asignó el valor de 1 y en aquellas muestras negativas se les asignó el valor de 0 (Varmuzová, K. et al., 2015). Luego fueron analizados con el test de comparaciones múltiples de Tukey con α = 0,05%.

La histología e histomorfometría se analizó mediante one way ANOVA y el pos-test de Dunnet (Graph Pad 5).

Cada jaula a los efectos de la medición de los valores productivos, se constituye en una unidad experimental.

Los datos promedios obtenidos de peso, consumo e índice de conversión de las aves, de las dos jaulas de cada tratamiento, durante todo el ensayo se presentan en la tabla 2.

Tabla 2: Peso, consumo e Índice de Conversión, por tratamiento, tanto el peso como el consumo están expresados en gramos.

- Análisis a los 7 días de vida de las aves

Al analizar estadísticamente, la variable peso vivo, no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, tampoco entre los tratamientos sin inocular y los inoculados con SE. Además, al comparar los diferentes alimentos (Comercial: T1 y T4, BMD: T2 y T5, EVP: T3 y T6), no hubo diferencias significativas (Tabla 3).

Tabla 3: Comparación variable peso vivo, entre tratamientos inoculados y no inoculados con SE, a los 7 días. * Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Al analizar la variable consumo, no se encontraron diferencias significativas entre las medias de los diferentes alimentos (Tabla 4).

Tabla 4: Comparación variable consumo, entre los diferentes alimentos a los 7 días * Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Por el contrario, se encontraron diferencias significativas al comparar los Tratamientos no inoculados (T1, T2, T3) e inoculados con SE (T4, T5, T6), siendo menor el consumo en éstos últimos, como se observa en la Tabla 5.

Tabla 5: Comparación variable consumo, entre tratamientos inoculados y no inoculados con SE, a los 7 días. * Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

En la Tabla 6 se observan diferencias significativas en el índice de conversión entre los tratamientos inoculados con SE y los no inoculados. Pero no se encontró diferencias significativas entre los distintos tratamientos, ni entre los diferentes alimentos.

Tabla N° 6: Comparación de Índice de Conversión entre tratamientos, a los 7 días de vida.

- Análisis a los 14 días de vida de las aves

En cuanto a la variable peso vivo de las aves y consumo de las mismas, al día 14 de vida, no se observaron diferencias significativas entre las medias de los tratamientos, ni de los alimentos, ni de los tratamientos inoculados y los no inoculados con SE. Tampoco se obtuvieron diferencias significativas en el índice de conversión en ninguna de las comparaciones anteriores.

- Análisis a los 21 días de vida de las aves

Al realizar la comparación entre las medias del peso vivo, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos. Tampoco entre los tratamientos inoculados y los no inoculados con SE (Tabla 7).

Tabla 7: Comparación variable peso vivo entre tratamientos inoculados y no inoculados con SE, a os 21 días. * Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Sin embargo, se encontraron diferencias en el peso vivo, entre los diferentes alimentos, y al realizar comparaciones de a pares, se encontró que la media del alimento comercial fue menor con aquellos alimentos que contienen un aditivo (Tabla N° 8). No presentándose diferencias entre el alimento que contiene el aditivo BMD y el EVP.

Tabla 8: Comparación variable peso vivo, entre los diferentes tratamientos, a los 21 días. * Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Con respecto a la variable consumo, al día 21 de edad, no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos, ni entre los diferentes alimentos y entre las aves inoculadas y sin inocular.

En la variable Índice de conversión, no se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos, ni entre los inoculados y los no inoculados con SE Tabla 9.

Tabla 9: Comparación variable Índice de conversión, entre tratamientos inoculados y no inoculados con SE, a los 21 días.* Letras distintas indican diferencias significativas (p ≤ 0,05)

Al analizar los parámetros productivos (Peso, Consumo, Índice de Conversión), no se presentaron diferencias significativas, entre los tratamientos, al comparar tanto los alimentos como los tratamientos infectados.

Tabla10: Resumen de diferencias estadísticas de los parámetros productivos en cada semana y por tratamiento, por alimentos y al comparar los inoculados y no inoculados.

No: no hubo diferencias significativas.

Durante todo el ensayo, no se halló SE en ninguno de los tratamientos T1, T2, T3 (aves sin inocular), provenientes de las muestras de los órganos: ciego y unión cecal. En la Tabla 11 se resume el recuento de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC/ gramo) de SE expresados en notación científica, de los tratamientos T4, T5 y T6 (aves inoculadas experimentalmente).

Tabla 11: Niveles de SE en ciego y unión cecal en UFC/gramo.

* A: ausencia de UFC/gramo

Luego, se los transformó en logaritmo base 10 para analizarlos y aquellas muestras que fueron positivas sólo después de haberse realizado un enriquecimiento, se les asignaron el valor de 1 y a las negativas, el valor de 0 (Varmuzová, K. et al., 2015).

Los recuentos de SE obtenido a los 7, 14, 21 y 28 días de vida de las aves, no presentaron diferencias significativas entre los diferentes alimentos (comercial, BMD y EVP).

A los 14 días de vida, se obtuvo una diferencia cercana a la significancia (p = 0,051) entre los dos alimentos que contienen un aditivo (EVP y BMD). En el análisis de los recuentos obtenidos a los 21 y 28 días, en la unión cecal, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes alimentos.

  

En duodeno, la pérdida de la integridad no presenta diferencias significativas entre tratamientos (Gráfico 1), a diferencia de la inflamación, encontrándose en los tratamientos con los aditivos un menor score de lesión. El tratamiento que recibió el EVP, es estadísticamente menor con respecto al control T4 en el score de lesión (Gráfico 2).

El resto de los tramos intestinales no presenta diferencias entre los tratamientos.

La histomorfometría en duodeno y yeyuno, no presenta diferencias significativas entre los tratamientos en la relación de vellosidad – cripta (Gráfico 3), como tampoco al comparar los tratamientos desafiados sobre los no desafiados (Gráfico 4 y 5).

Gráfico 3, Relación vellosidad – criptas en los 6 tratamientos.