Control de la contaminación por aflatoxinas en sistemas intensivos de producción lechera del altiplano central mexicano

Introducción

La presencia de hongos Aspergillus spp. Toxicogénicos y las aflatoxinas (AF) se distribuyen ampliamente en todo el mundo y contaminan frecuentemente diversos cereales, semillas y otros productos agrícolas; la AFB1 es considerada como el tóxico natural más potente y se ha demostrado ampliamente su potencial carcinogénico, teratogénico y mutagénico, por lo queha sido clasificada por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer dentro del grupo I (IARC, 2002).

Cuando las vacas lecheras ingieren productos agrícolas contaminados con AF son absorbidas en el tracto gastrointestinal, se distribuyen en el organismo y reciben un proceso de biotransformación principalmente en hígado;entonces se activan sus mecanismos de eliminación iniciando por la formación de un epóxido reactivo que termina siendo eliminado por la bilis como ácido mercaptúrico o como AFM1, un metabolito que se elimina en leche y que es considerado como agente carcinogénico para los humanos. Si la dosis de AFingerida rebasala capacidad de neutralización de los epóxidos reactivos, ocurre un daño a las macromoléculas que integran las estructuras subcelulares originando un ataque tóxico y carcinogénico (IARC, 2002).

Por estas razones, se han establecido niveles máximos permitidos para la concentración de aflatoxinas presentes en el alimento destinado para el consumo de las vacas lecheras (5-20 μg/kg de AF por kg de alimento). Considerando que no es posibleevitar la contaminación del suelo por los hongos del género Aspergillus yde las cosechas por AF, se ha hecho popular en algunos países la estrategia de reducir su biodisponibilidad en forrajes para vacas lecheras mediante la incorporación de compuestos minerales o de naturaleza orgánica, que al ser mezclados con los alimentos, desarrollan una capacidad secuestrante de las micotoxinas (Gonçalves et al., 2015).El objetivo de este estudio fue evaluar la contaminación por hongos aflatoxicogénicos y AF en los alimentos y en la leche producida en Unidades de Producción Lechera del Altiplano Central Mexicano.

Materiales y Métodos

Ubicación del estudio

Durante 2012-2014 se monitorearon dos establos localizados en el Altiplano Central de México (21°48’N, 102°03’ W; 1986-2008 msnm; clima templado-semiseco) y expuestos de manera natural a la contaminación de la dieta con AF. Ambos establos tenían un hato con más de 1000 vacas Holstein en línea de ordeño mecánico y un manejo alimenticio y reproductivo similar, con celo natural e inseminación artificial, además de estar libres de brucelosis y tuberculosis.

El alojamiento era en estabulación libre, con áreas de descanso sombreadas y con comederos de libre acceso, donde servían la ración totalmente mezclada (TMR) dos veces al día con un carro mezclador-repartidor mecanizado.Siguiendo el programa de control de micotoxinas implementado en cada establo, cada animal consumió una TMR que incluyó la adición de alguno de diez preparados comerciales al momento de elaborar la TMR.

Procesamiento de Muestras

Se obtuvieron267 muestras de alimento (ensilaje de maíz, alimento concentrado y ración total mezclada)y se secaron en una estufa de alta temperatura con circulación forzada de aire (OF- 22G JEOI-TECH, LabCompanion, Corea) a 60°C durante 24 horas y se molieron en un molino universal de funcionamiento continuo (MF series 10 Basic, IKA®-Werke, Alemania) hasta obtener un tamaño de partícula de entre 500 y 800 μm.Las muestras secas y molidas se almacenaron en refrigeración dentro de bolsas rotuladasy con cierre hermético.

También se obtuvieron 216 muestras de leche cruda directamente del tanque enfriadorrecolector, de acuerdoal nivel productivo de las vacas (altas, medias y bajas). Se utilizaron frascos limpios de plástico (25 mL) previamente identificados los cuales fuerontransportados en condiciones de refrigeración y almacenados en congelación (-20°C) hasta su procesamiento (< 48 h).

Aislamiento e identificación de Aspergillus spp.

Se empleó la técnica de vaciado en placa por diluciones sucesivas (1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000), las cuales se inocularon y se incubaron (27°C/72-120 h). Las colonias de interés se procesaron y se observaron con microscopio óptico y un microscopio electrónico de barrido (JSM-5900 LV, Joel, EUA). Las imágenes fueron capturadas y digitalizadas con electrones retro-dispersados (BSE).

Cuantificación de aflatoxinas

La identificación de AF con TLC en aislados de Aspergillus spp.mediante el método 972.26 de la AOAC.La cuantificación de AF en las muestras de alimento y leche se realizó con kitscomerciales de ELISA competitivo (Ridascreen® aflatoxin R-5202yAflatoxin M1,R Biopharm, Alemania)con un rango de detección de 1.7-45.0μg/kg y 5-80 ng/kg, empleando en un lector de microplacasa 450 nm (Biotek (ELx800TM, BioTek, EUA).

Las muestras que en el procedimiento de ELISA sobrepasaron el límite máximo permisible se analizó mediante HPLCsiguiendo el método 990.33 de la AOAC, empleando un sistema cromatográfico(Perkin Elmer Series 2000, columna LC-18, USP LI, guarda columna LC- 18),con detección UV visible. La concentración de AF detectada mediante HPLC se consideró definitiva y sustituyó al valor estimado por ELISA, debido a que no se observaron diferencias significativas entre los valores de AF detectados por ELISA y HPLC.

Análisis Estadístico

Se realizó el análisis de varianza para determinar si hubo o no diferencias estadísticas significativas entre las medias de concentración de AF entre las dos UPL participantes (A y B), entre los ingredientes alimenticios de la misma UPL o entre los meses del año; con intervalos de confianza del 95% con un valor P de 0.05; se realizó el procedimiento de comparación múltiple de Bonferroni con intervalos de confianza del 95% y un valor P de 0.05.

Resultados y Discusión

Frecuencia de Aspergillus spp.

Se identificaron en total 163 aislados, de los cuales el 36.0 % correspondió a hongos con morfología compatible con el género Aspergillus. También se encontraron aislados congruentes con la morfología típica de los géneros Cladosporium, Rizophus, Mucor, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Curvulariay Bipolar, aunque en menor proporción (14.9, 11.8, 11.8, 9.9, 9.9, 3.1, 1.86 y 0.62 %).

Se obtuvieron 58 aislados con características morfológicas congruentes con el género Aspergillus;de los cuales10 (17.2%) se clasificaron como positivo a la capacidad de producción de AF en comparación con un control positivo de AFB1 purificada. No se observó una asociación significativa entre la presencia de hongos Aspergillus y la contaminación por AF en las dietas empleadas en las unidades de producción participantes en el estudio.

Estos resultados son coincidentes con otros estudios como lo reportado por Ortega et al. (2015) quienes en un estudio enel terreno donde se produce maíz en varias zonas de Sonora, sólo encontraron una incidencia de 4.4% (18/405) para cepastoxicogénicasde A. flavus.

Aflatoxinas detectadas en los alimentos

Tanto en la UPL-A como en la UPL-B, se observó una diferencia significativa entre la suma proporcional de la concentración de AFen los ingredientes que integraron la ración y la concentración detectada en la RTM(Tabla1). No se encontró diferencia significativa (p >0.05) entre el nivel de eficiencia de la reducción de la concentración de AF por la adición de productos secuestrantes a la RTMen la UPL-A como en la UPL-B (60.7 y 58.5% respectivamente).

Los resultados obtenidos mostraron una contaminación por AF en el 99% de las muestras, aunque sólo el 15.4% de las muestras presentó niveles de contaminación superiores a los niveles máximos permitidos (20 μg/kg) lo cual coincide con las condiciones realistas o representativos de las condiciones de campo de campo (GranieryApplegate 2012).

En este estudio, la eficacia global de la aplicación en la dieta de adsorbentes de micotoxinas mostró un valor entre el 58-5 y 60 % de la concentración existente previamente en los ingredientes dietéticos. Estos compuestos secuestranteshan mostrado el potencial para disminuir el efecto adverso en la salud animal ocasionado por el consumo de AF. Sin embargo, en estudios in vitro se ha reportado la capacidad de este tipo de secuestrante con niveles de adsorción de las AF presentes en la muestra mayores al 90%. Armando et al. (2012) concluyeron que la evaluación in vitro del efecto secuestrante es muy variante y no siempre es indicativo de las respuestas que se pudieran presentar en experimentos in vivo.

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Exposición por lote productivo a dietas contaminadas con aflatoxinas

La cantidad de ración total mezclada proporcionada a cada lote productivo presentó variaciones en la cantidad suministrada (kg/animal/día), por lo que los animales de cada lote se expusieron a cantidades diferentes de AF (Tabla 3); en general, los lotes productivos de vacas con alta producción se expusieron a la ingestión de mayores cantidades de AF de manera proporcional al tamaño de la dieta consumida; así como a la variación propia de la concentración entre lotes de ingredientes alimenticios.

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Los productos del metabolismo hepático de AF pueden ser excretados a través de la leche como AFM1, constituyendo un riesgo sanitario debido a su consumo humano directo o en derivados lácteos, ya que se ha establecido que la AFB1 presente en la dieta de las vacas lactantes se transfiere a la leche en una tasa de 1-6 porciento (Xiong et al., 2015).

En síntesis, los resultados de este estudio sugieren que en el Altiplano Central Mexicano es frecuente la presencia de cepas toxicogénicas de hongos del géneroAspergillusasí como la contaminación subsecuente de aflatoxinas en las dietas de vacas Holstein;así como fue evidente quela adición de compuestos secuestrantesa la dieta tuvo el potencial de reducir significativamente la concentración detectable de aflatoxinas totales en la ración total mezclada y disminuirla tasa de transferencia de residuos (AFM1) ala leche cruda.

Agradecimientos

Se agradece el apoyo financiero del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (proyecto: 178546CONACYTCientífica Básica 2012) y de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (proyecto: PIP/SA 15-1). Se agradece también a los propietarios de explotaciones lecheras del Altiplano Central de México por su apoyo logístico.

Referencias

Armando MR, Pizzolitto RP, Dogi CA, Cristofolini A, Merkis C, Poloni V, Dalcero AM, CavaglieriLR, 2012. Adsorption of ochratoxin A and zearalenone by potential probiotic Saccharomyces cerevisiae strains and its relation with cell wall thickness. J ApplMicrobiol 13(2):256-264. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.2012.05331.x.

GonçalvesBL, Rosim RE, Fernandes CA, Corassin CH, 2015. The in vitro ability of differentSaccharomycescerevisiae -basedproducts to bindaflatoxin B1. Food Control 47: 298-300. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.07.024.
Grenier B, ApplegateTJ, 2013. Modulation of intestinal functionsfollowingmycotoxiningestion: Meta-analysis of publishedexperiments in animals. Toxins 5(2): 396-430. http://dx.doi.org/10.3390/toxins5020396.

IARC, International Agency for Research on Cancer. 2002. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 82. Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans II, Press Lyon France.http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol82/mono82.pdf

Ortega, A., Jaime, R. and Cotty, P. 2015.Aflatoxin-producing fungi in maize field soils from sea level to over 2000 masl: A three year study in Sonora, Mexico. Fungal Biology. 119: 191-200.http://dx.doi.org/10.1016/j.funbio.2014.12.006.

XiongJL, Wang YM, Nennich TD, Li Y, Liu JX, 2015. Transfer of dietary aflatoxin B1 to milk aflatoxin M1 and effect of inclusion of adsorbent in the diet of dairy cows. J Dairy Sci 98(4):2545-54. http://dx.doi.org/10.3168/jds.2013-7842.

Control de la contaminación por aflatoxinas en sistemas intensivos de producción lechera del altiplano central mexicano

Análisis de Micotoxinas: Myco 5-in-1 PLUS

Granos contaminados con micotoxinas, Fernando Tamames (Special Nutrients)