Susceptibilidad a antibióticos de Staphylococcus aureus aislados de mastitis bovina en lecherías de la cuenca central de Argentina

INTRODUCCION

Staphylococcus aureus es uno de los patógenos mayores de mastitis más prevalente en los rebaños bovinos lecheros a nivel mundial (Zecconi et al., 2006; Persson et al., 2011). La terapia antimicrobiana es una de las bases de los programas de control de mastitis bovina causada por este organismo. La respuesta a la terapia antibiótica está influenciada por factores del microorganismo, del hospedador y de la disponibilidad de las drogas en el sitio de infección, lo cual resulta en tasas de curación bacteriológica variables (Barkema et al., 2006). En consecuencia, las pruebas para determinar la susceptibilidad de S. aureus frente a los antibióticos no siempre predicen con eficacia el resultado de la terapia. Sin embargo, existe consenso sobre la utilidad de las mismas para seleccionar los antimicrobianos en forma racional (Barkema et al., 2006; Pyörälä, 2009).

Dentro de las pruebas disponibles para determinar la susceptibilidad in vitro de los organismos patógenos de mastitis a los antimicrobianos, el método de difusión en agar o antibiograma, que se usa rutinariamente, expresa los patrones de susceptibilidad en términos cualitativos. Este método no solamente es utilizado como procedimiento de rutina por la mayoría de los laboratorios de diagnóstico veterinario, sino también para monitorear los patrones de resistencia a los antibióticos de poblaciones bacterianas en distintos países (Persson et al., 2011, Oliver and Murinda, 2012). Considerando que para el control de mastitis bovina se usan antimicrobianos tanto en forma curativa como preventiva, el uso no responsable de estas drogas implica la posible emergencia de resistencia (Errecalde, 2004; Oliver and Murinda, 2012). Consecuentemente, el estudio de la evolución de la resistencia a los antimicrobianos proporciona información de utilidad con relación al uso de estas drogas en el ganado lechero. El objetivo de este estudio fue determinar la susceptibilidad de S. aureus aislados de muestras de leche provenientes de lecherías de la cuenca lechera central de Argentina frente a antibióticos seleccionados de uso frecuente en el tratamiento de la mastitis bovina.

MATERIALES Y METODOS

Aislamientos bacterianos

Se evaluaron 96 S.aureus aislados a partir de muestras obtenidas en forma aséptica de secreción mamaria de vacas con mastitis clínicas y subclínicas. Las muestras provinieron de 40 establecimientos lecheros de la cuenca central de la Argentina; ubicados en las provincias de Santa Fe, Entre Ríos, Córdoba y Buenos Aires. De cada establecimiento se obtuvieron entre 2 a 4 aislamientos. Las muestras fueron sembradas en agar base Columbia (Laboratorio Britania) suplementado con 5% de sangre bovina, incubándose por 24 a 48 hs a 37º C en aerobiosis. Los aislamientos caracterizados como pertenecientes al género Staphylococcus fueron identificados utilizando métodos fenotípicos convencionales (Oliver et al., 2004). Brevemente, se determinó morfología colonial y hemólisis, se realizó coloración de Gram, prueba de catalasa, clumping factor, producción de coagulasa usando plasma de conejo, producción de acetoína y crecimiento selectivo en Agar P adicionado con 7 µg/ml de acriflavina (Roberson et al. 1992). Luego de la identificación, los organismos fueron conservados por congelación en infusión cerebro corazón (Laboratorio Britania) adicionado con glicerol al 15% a -70°C hasta su uso posterior.

Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos

Se utilizó el método de difusión en agar, de acuerdo con metodología estándar (CLSI, 2013). Los discos de antimicrobianos utilizados en las pruebas de difusión en agar fueron almacenados a –20ºC y llevados a temperatura ambiente una hora antes de su uso para evitar la condensación. Se utilizaron los siguientes discos de antimicrobianos: penicilina G (10 U) (Oxoid); oxacilina (1 μg) (Oxoid); eritromicina (15 μg) (Oxoid); amoxicilina + ac clavulánico (30 μg) (Oxoid), ceftiofur (30 μg) (Oxoid), cefalexina + kanamicina (15 µg/ 30 µg) (Ubrolexin®, Boehringer Ingelheim), cefquinoma (30 µg) (Oxoid), cefalexina (30 µg) (Oxoid), framicetina + penicilina G (100 µg/10 UI) (Mamyzin®, Boehringer Ingelheim). Como control se utilizó S. aureus ATCC 25923. Los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento fueron interpretados de acuerdo con los criterios desarrollados por el CLSI (2013) para los siguientes antimicrobianos: penicilina, oxacilina, eritromicina, amoxicilina+ácido clavulánico, ceftiofur. Para los discos de framicetina+penicilina se utilizó el criterio sugerido por Pillar et al (2014), para los de cefalexina+kanamicina el criterio sugerido por Pillar et al (2009); mientras que para cefquinoma el criterio sugerido por Rose and Swinkels (2008).

RESULTADOS Y DICUSION

Los resultados de las pruebas de susceptibilidad se muestran en la tabla 1. Los antibióticos beta lactámicos se utilizan frecuentemente para el tratamiento de mastitis bovina en Argentina. Dentro de este grupo, la penicilina es el representante más antiguo. El 28,12% de los aislados fueron resistentes a la penicilina; lo cual fue superior a lo hallado por Pellegrino et al (2011) para aislados de la Provincia de Córdoba (14,3%), aunque inferior a estudios previos realizados con aislados de distintas provincias (Gentilini et al., 2000, 40,3%; Calvinho et al., 2002, 47,6%; Russi et al., 2008, 48,4%). Si bien los resultados del presente estudio y el de Pellegrino et al (2011) muestran una menor resistencia a la penicilina comparado con los estudios previos, la naturaleza de los mismos no permite realizar inferencias acerca del origen de estas diferencias. Serán necesarios estudios futuros para determinar la persistencia de esta tendencia. En otros países, el porcentaje de aislados resistentes varía desde un 4 hasta un 100% (Aarestrup & Jensen, 1998; Oliver & Murinda, 2012).

La combinación de penicilina y framicetina como componentes activos se utiliza actualmente en varios países en la terapia para vacas secas y en lactancia. En este estudio 18 cepas (18.75%) fueron resistentes, hallándose un porcentaje de aislados susceptibles del 80.21% (77 cepas), el cual fue superior al observado para la penicilina sola 71.88% (69 cepas). Los valores hallados en este estudio concuerdan con los de un estudio previo, donde el 89,1% de las cepas de S. aureus fueron susceptibles a la combinación de los antimicrobianos (Pillar, et al. 2014).

La cloxacilina es frecuentemente utilizada en varios países, incluido la Argentina, para el tratamiento de mastitis bovina, formando parte de las penicilinas resistentes a betalactamasas o penicilinasas. En este estudio fue evaluada la oxacilina, un análogo de la cloxacilina, debido a su mayor estabilidad y confiabilidad para detectar cepas de S. aureus meticilino-resistentes, aunque actualmente se recomienda utilizar cefoxitime en remplazo de oxacilina por su mayor sensibilidad y facilidad de interpretación de los resultados (CLSI, 2013). No se detectaron aislamientos resistentes a la oxacilina, lo cual coincide con estudios realizados en Argentina durante las dos décadas pasadas (Gentilini et al., 2000; Calvinho et al., 2002; Russi, et al.2008; Pellegrino et al., 2011), corroborando que el mecanismo de resistencia más frecuentemente observado en Argentina es por presencia de betalactamasas (Russi et al., 2015). Sin embargo, la detección de aislados de S. aureus meticilino-resistentes de bovinos en otros países como un patógeno emergente (Nam et al., 2011; Huber et al., 2009) indica la necesidad de establecer sistemas de monitoreo para la identificación precoz de estos organismos.

La clasificación de las cefalosporinas se ha orientado tradicionalmente en generaciones, basándose en la aparición cronológica de las mismas. Este es un criterio relativamente arbitrario, aunque existen diferencias en lo referente a espectros de acción y capacidad de resistencia a las betalactamasas por parte de las cefalosporinas de distintas generaciones (Errecalde, 2004). La cefalexina es una cefalosporina de primera generación que tiene gran actividad contra bacterias gram positivas y negativas. El 99% de las cepas estudiadas fueron sensibles, detectándose 1 sola cepa resistente (1,04%). Existen escasos datos en Argentina acerca de la susceptibilidad in vitro de cepas de S. aureus frente a este antimicrobiano. En un estudio realizado sobre 76 cepas de bovinos en Eslovenia se encontró una sensibilidad de S. aureus a este antimicrobiano del 93,5% (Pengov and Ceru, 2003). La combinación cefalexina+ kanamicina no se mostró más activa in vitro frente a S. aureus que la monodroga cefalexina, ya que 69 cepas (71.88%) fueron susceptibles, mientras que 95 cepas (98.96%) fueron susceptibles a la cefalexina sola. Catorce aislados (14,58%) fueron resistentes a esta combinación de antimicrobianos, lo que difieren de lo hallado en otros estudios en los cuales se halló una menor resistencia (Güler et al., 2005; Ibriss et al., 2014).

El ceftiofur es una cefalosporina de tercera generación, que posee mayor actividad contra bacterias gram negativas. El 94,79% de las cepas estudiadas fueron susceptibles a esta droga antimicrobiana, lo cual concuerda con lo hallado en otros países (Saini et al., 2011, Erskine et al.,2002, Idriss et al., 2014). La cefquinoma es una cefalosporina de cuarta generación, con acción contra gram positivos, espectro extendido sobre gram negativos y mayor actividad antibacteriana que las de segunda y tercera generación (Sader et al., 1993). Un 77,08% y un 21,88% de las cepas fueron susceptibles e intermedias a cefquinona, respectivamente. Estos resultados coinciden un estudio realizado en Turquía donde el 85% de las cepas de S. aureus fueron sensibles (Kirkan et al., 2005); mientras que Mosaferi et al (2012) hallaron un mayor porcentaje de aislados susceptibles en un estudio realizado en Irán.

La eritromicina es un macrólido que posee en su estructura un anillo lactónico de 14 constituyentes con azúcares aminados, que actúa inhibiendo la síntesis proteica de la porción 50S ribosomal, teniendo un espectro de acción tanto sobre bacterias gram positivas como negativas (Errecalde, 2004). La eritromicina, así como otros macrólidos, como la espiramicina y la tilosina, se utilizan para el tratamiento de mastitis bovina debido a que alcanzan concentraciones efectivas en leche contra S. aureus por lo menos por 12 hs luego de su administración parenteral (Ziv, 1992). Estos dos últimos antimicrobianos no se incluyeron en este estudio debido a que no existe acuerdo sobre los criterios de interpretación de resultados del método de difusión en agar. Respecto a eritromicina, fueron detectadas 3 cepas (3,12%) resistentes, lo que coincide con los resultados obtenidos por Calvinho et al. (2002), Gentilini et al. (2000) y Russi et al. (2008), quienes informaron un 2, 11,6 y 2,1% de aislados resistentes, respectivamente. Mientras que Pellegrino et al. (2014), informaron valores más elevados de aislados resistentes (35,5%). Sin embargo, en el presente estudio, 73 cepas (76,04%) dieron una susceptibilidad intermedia. Estos resultados difieren de estudios informados en otros países (Malinowski et al., 2002; Gooraninejod, et al., 2007).

La combinación de amoxicilina + ác. clavulánico se ha utilizado desde hace varios años para el tratamiento de mastitis bovina, considerándose que posee mayor actividad que ambos agentes en forma individual (Moroni et al., 2006). En esta experiencia se detectaron 3 aislados resistentes a amoxicilina + ác. clavulánico (3,12%), lo cual coincide con valores hallados en estudios de otros países en donde se detecta un muy bajo porcentaje de resistencia a este antimicrobiano, tanto en Argentina (Lucas et al., 2005) como en otros países (Güler, et al., 2005; Kirkan et al., 2005; Idriss et al., 2014).

Al evaluar los perfiles de resistencia, 7 cepas (7,3%) mostraron resistencia a dos o más antibióticos (Tabla N°2). Cabe destacar que el 3,12% (3/96) a eritromicina y penicilina y el 2,06% (2/96) a amoxicilina + ac. clavulánico y penicilina. Pellegrino et al. (2011) en Argentina informaron un perfil de resistencia múltiple del 19%. Si bien el porcentaje de aislados con resistencia a más de un antibiótico no es elevado, es oportuno mantener estudios periódicos de monitoreo para detectar desviaciones de estos patrones.