Avances en las investigaciones de Staphylococcus aureus como agente patógeno causante de Mastitis bovina, mediante biología molecular.

INTRODUCCIÓN.

En México, los españoles introdujeron los primeros bovinos en el siglo XVI, la ganadería se desarrolló en las haciendas coloniales, destinándose a la producción de carne y leche, principalmente para consumo humano. A principios del siglo XX se comenzó a importar ganado de raza lechera, lo que fue desarrollando la producción lechera y las agroindustrias lácteas. (FIRA 2001).

La industria de la leche en México se consolido hasta los años cuarenta, debido al desarrollo industrial y la expansión del mercado interno. Durante el periodo de 1950 a 1970 se efectuó un proceso de integración de la actividad lechera, dado como resultado el surgimiento de algunas pasteurizadoras e industrializadoras de lácteos importantes, las cuales actualmente se encuentran cercanas a las cuencas lecheras de nuestro País (fig.1).

DEFINICIÓN DE LA MASTITIS.

La Mastitis se define como la inflamación de la glándula mamaria de los mamíferos, como consecuencia de la introducción y multiplicación de microorganismos patógenos en los conductos galactóforos, es la enfermedad más común del ganado lechero y afecta a los hatos de todo el mundo.

Se distinguen dos formas diferentes de mastitis: la clínica caracterizada por la afectación de las características físico-químicas de la leche, la cual se encuentra visiblemente alterada por coágulos, descamaciones y en ocasiones sangre y la forma subclínica, donde la vaca parece sana y la ubre no presenta ningún signo de inflamación, sin
embargo, las células somáticas se encuentran aumentadas en número y es posible detectar en leche la presencia de microorganismos patógenos. Se estima que un tercio de todas las vacas lecheras están afectadas por cualquier forma de Mastitis en uno o más cuartos.

El diagnóstico oportuno es muy importante en el hato lechero, puede basarse en los diferentes signos clínicos, como son, la inflamación, dolor al tacto, fiebre, depresión y disminución de la producción láctea. Con pruebas sencillas como la de California Mastitis Test (CMT) o cualquier otra que permita conocer el estado normal o anormal
de células somáticas en leche.

Avances en las investigaciones de Staphylococcus aureus como agente patógeno causante de Mastitis bovina, mediante biología molecular. - Image 1

Comúnmente es una enfermedad infecciosa causada por más de 140 especies de microorganismos, especialmente las bacterias, también pueden ser Micoplasmas, hongos, levaduras y algas, siendo las más frecuentes Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. Esta enfermedad constituye un problema tanto para la salud pública como para la economía del sector lechero en general.

Los cálculos mundiales recientes han revelado que la mastitis representa el 30% del costo total de las enfermedades del ganado lechero. La mastitis subclínica y las enfermedades reproductivas son los problemas de salud que causan más pérdidas económicas en la crianza de bovinos. Se calcula que anualmente estas enfermedades causan perdidas, de miles de millones de pesos; una gran cantidad de esta suma se debe a la enorme pérdida de leche, así como a los altos costos del médico veterinario y el tratamiento de las vacas.

La mastitis es una enfermedad multifactorial, es decir que no se debe como frecuentemente se acepta a una sola causa; actúan en conjunto muchos factores, que finalmente desencadenan la enfermedad. Además de las propiedades particulares heredadas de resistencia a enfermedades, hay otros factores que influyen en la presentación de la mastitis subclínica tales como la técnica y el trabajo de la ordeña, el ambiente, la alimentación, el manejo, así como obviamente los agentes patógenos (fig. 2).

MICROORGANISMOS PATÓGENOS CAUSANTES DE MASTITIS.

Las bacterias patógenas que han sido identificadas en la mastitis subclínica se describen a continuación. Pueden clasificarse, según sus propiedades para causar la enfermedad, en contagiosas y asociadas con el medio ambiente. En la literatura internacional también se les conoce y define como patógenos mayores y menores respectivamente (major and minor pathogens). Esta división se realiza según la fuerza de la reacción del organismo a los agentes patógenos. Las infecciones por patógenos mayores generalmente son más fuertes y presentan elevados conteos de células somáticas, mientras que las infecciones con patógenos menores en casos normales ocasionan leves reacciones de tejido glandular.

Agentes patógenos contagiosos. El cuarto infectado de la ubre es el principal reservorio de los agentes contagiosos de mastitis. Solo dentro del cuarto infectado esos agentes patógenos logran reproducirse y sobrevivir largo tiempo. Los patógenos pueden ser transmitidos en la ordeña mediante los plásticos de las pezoneras, las manos del ordeñador y también cuando se utiliza la misma toalla para limpiar un cuarto y otro o una vaca y otra. Los patógenos también pueden estar en el medio ambiente: en la cama, el piso de la sala de ordeña, etc.., pero ahí sobreviven por corto tiempo.

Patógenos ambientales causantes de mastitis. Los patógenos ambientales de la mastitis se encuentran como su nombre lo dice, continuamente en el medio ambiente que rodea a la vaca, a diferencia de los patógenos contagiosos. Estas cepas medioambientales pertenecen a la microflora natural y se pueden encontrar casi en cada establo y en la piel de los animales (fig.3).

Los representantes más importantes de este grupo son los estreptococos esculina positivos (frecuentemente Streptococcus uberis, ocasionalmente enterococos), los estafilococos coagulasa negativos (diferentes tipos de estafilococos, pero no S. aureus) y las llamadas cepas coliformes. Estas bacterias patógenas poseen en general un débil potencial para causar enfermedades, aunque a veces penetran el canal lineal del pezon hacia la ubre y provocan infección muy fuertes, persistentes y de terapia muy difícil. Las corinebacterias (Corynebacterium bovis) se encuentran de forma fisiológica en el canal del pezón hacia la glándula y provocan infecciones muy fuertes.

Otro de los patógenos ambientales mas comunes es el Streptococcus uberis y se presenta comúnmente en el periodo seco de las vacas. La infección tiene preponderantemente un curso subclínico. Es raro que se presenten casos clínicos de mastitis por St. uberis. En comparación con los otros agentes patógenos ya mencionados el St. uberis es menos patógeno para la glándula mamaria, pero esta bacteria tiene la característica de causar infección en todo el organismo cuando existen bajas en las defensas. Las infecciones por patógenos ambientales causantes de mastitis se deben entonces comúnmente a fallas en los mecanismos de defensa de la vaca o de la ubre. Las causas por fallas en el manejo tienen que ver con la falta de higiene, la alimentación y la rutina de la ordeña.

Un clima cálido y húmedo en el establo y una higiene deficiente en la cama de las vacas ocasionan que haya una cantidad mayor de bacterias en el ambiente, motivando la presencia de gran cantidad de cepas bacterianas en el establo, que lesionan o debilitan el sistema de defensa de las vacas lecheras y por consiguiente de la ubre.

También las deficiencias en la nutrición, por ejemplo menor cantidad de alimento, disminuyen las defensas contra infecciones y con ello indirectamente la salud de la ubre. Este mismo riesgo tienen las vacas gordas con muchas lactaciones y las vacas secas cuando hay una fuerte deficiencia de energía en el periodo de lactación máxima y una suplementación deficiente de vitaminas minerales y elementos traza.

El mejoramiento en los mencionados factores (alimentación, instalaciones, rutina de ordeña) conduce a un aumento de la capacidad de defensa de la vaca; entonces su organismo podrá eliminar sin algún tratamiento de antibióticos las bacterias patógenas ambientales de la ubre.

Únicamente cuando hay síntomas muy pronunciados de inflamación o en infecciones de curso crónico en la mastitis ambiental es necesario un tratamiento con antibióticos indicado por un médico veterinario (antes del tratamiento es necesario investigar las muestras de leche).

Se puede afirmar que mediante el efecto conjunto de diferentes influencias negativas (deficiencias de alimentación, manejo inadecuado, mala higiene, y una técnica errónea de ordeña) los agentes patógenos de la mastitis penetran en la ubre y ocasionan una mastitis subclínica. Dependiendo si son agentes patógenos contagiosos o asociados al medio ambiente, es necesario realizar diferentes medidas de saneamiento en diferentes fases. Esto debe de ser controlado constantemente por el ganadero, quien en caso de de que los agentes patógenos sean contagiosos pedirá al medico veterinario diseñar una terapia efectiva. Incluso en el caso de los agentes patógenos ambientales de mastitis se aplicara una terapia efectiva para el hato lechero.

AISLAMIENTOS DE LOS AGENTES PATÓGENOS CAUSANTES DE MASTITIS, EN EL ESTADO DE JALISCO.

A pesar de la importancia económica y de salud publica de la mastitis bovina, la información sobre la prevalencia y distribución de la enfermedad, por muestreos en los establos lecheros en la región Occidente es muy escasa o nula. El estado de Jalisco cuenta actualmente con más de 900,000 vacas lecheras, las cuales aportan el 17.5% de la leche producida en México.

Investigaciones realizadas sobre la mastitis, nos señalan que existe una incidencia de mastitis clínica y subclínica, hasta en un 50% de las vacas lecheras. Sin embargo hay muchos vacíos de información, con respecto a los agentes causales más comunes (Mc Dowell R. E. 1994 y Perez, D.M. 1996). Se acepta una división, de los agentes causantes de mastitis; en patógenos principales o “major pathogens” y patógenos secundarios o “minor pathogens”, esto tiene relación con la reacción que estos microorganismos causan en la ubre (Djabri et al. 2002).

Teniendo como objetivo de determinar que agentes patógenos son los principales causantes de la mastitis en hatos lecheros comerciales en la cuenca lechera del estado de Jalisco, analizamos 33 establos lecheros de las diferentes zonas lecheras del estado de Jalisco, estando ubicados la mayoría de ellos en la cuenca lechera de la
región de los Altos de Jalisco, en estos fueron tomados de vacas lactantes, de manera antiséptica, al inicio del ordeño, muestras de leche de cuartos sencillos de la ubre, sin importar si la vaca tenia o no mastitis. Al final de este muestreo se obtuvieron un total de 2,979 muestras., Los aislamientos y métodos utilizados para la identificación, fueron los sugeridos por la DVG (2002) y el documento 132 de la Federación Internacional de la leche (IDF).

Una vez realizados los análisis obtuvimos los siguientes resultados. Respecto a las 2,979 muestras tomadas en los establos lecheros, 1,603 resultaron negativas, 53.8% (no hubo crecimiento). En el restante 46.2% (1,376 muestras) fueron positivas. Siendo los agentes patógenos mas frecuentes; SCN (estafilococos coagulasa negativos), Corynebacterium spp, S. aureus, Sc. agalactiae, seguido de los microorganismos coliformes y de los Streptococcus spp. En la Tabla 2 se muestra la prevalencia de los microorganismos aislados.

Los resultados de las muestras bacteriológicamente positivas (46.2%) concuerdan con otros reportados en la literatura (Wolter et al. 2004 Tabla 1). Además en los resultados donde se sugiere que las bacterias aisladas están en relación con un mal manejo zootécnico del hato lechero, por ejemplo aislamientos de SCN, Sc. agalactiae y de S. aureus. En el caso de Corynebacterium spp existe la controversia, de sí estos son patógenos, ya que comúnmente se encuentran como colonizadores normales del canal del pezón.

Entonces podemos observar claramente que los microorganismos encontrados en casos de mastitis clínica y/o subclínica de vacas en lactación, predominaron los patógenos menores o “minor pathogens”, seguidos de los patógenos clásicos los cuales se consideran como agentes muy importantes para la presentación de casos de mastitis en el estado de Jalisco, México.

Realizamos también otra investigación a nivel del rastro municipal de Guadalajara, con el objetivo de comparar los resultados en hatos comerciales y con vacas que son enviadas al sacrificio. Recolección de las muestras de leche. Se tomaron de manera antiséptica un total de 177 muestras de leche de cuartos sencillos de la ubre a 49 vacas con problemas de mastitis (vacas con síntomas clínicos o con conteos elevados de células somáticas, observados mediante la prueba de California), en los corrales del rastro municipal de Guadalajara, Jalisco.

Los aislamientos y métodos utilizados para la identificación, fueron los sugeridos por la DVG (2002) y el documento 132 de la Federación Internacional de la leche (IDF). Adicionalmente los estreptococos fueron identificados utilizando el sistema API 20 strep system (BioMerieux). Los estafilococos fueron diferenciados con la prueba de la coagulasa en tubo por el método descrito por Roberson et al.1992.

De las muestras tomadas del rastro municipal de Guadalajara fueron obtenidos 110 aislamientos de bacterias patógenas de las 49 vacas con mastitis, 69 muestras no tuvieron crecimiento bacteriano alguno. El Streptococcus agalactiae fue encontrado en 33 muestras provenientes de 15 vacas, todas las cepas aisladas mostraron la hemólisis β, fueron positivas a la prueba de CAMP y a la reacción típica al antisuero del grupo B de Lancefield.

El patógeno bacteriano mas común, (de los estafilococos) causante de Mastitis fue el Staphylococcus aureus, con un total de 32 aislamientos encontrado en 14 vacas, todos los aislamientos mostraron las características comunes de este microorganismo. Todos los demás resultados se muestran en la tabla 1. En las muestras de leche de los cuartos de la glándula mamaria de las vacas en el rastro municipal de Guadalajara, Jalisco, pudieron ser aislados los agentes patógenos contagiosos, como causantes de mastitis. Destacan los aislamientos de S. aureus como agente patógeno en vacas lecheras, perteneciendo a los agentes clásicos de la mastitis Los agentes patógenos del medio ambiente tales como St. uberis y otros estreptococos esculina positivos o los estafilococos coagulasa negativos tuvieron niveles bajos de aislamientos, si los comparamos con países que tienen una mejor organización de sus programas de control de la mastitis.

IMPORTANCIA DEL STAPHYLOCOCCUS AUREUS COMO AGENTE CAUSANTE DE MASTITIS.

Los principales problemas de mastitis en la actualidad son causados por el Staphylococcus aureus, una de las bacterias mas comunes en la mastitis clínica y subclínica. Mientras que en los años sesenta la mastitis por estafilococos no era muy importante, ahora se aísla el S. aureus en un 20% de las muestras bacteriológicamente
positivas de cuartos afectados por mastitis El S. aureus no se adapta tan bien al tejido de la ubre como el St. agalactiae; tiene una gran resistencia fuera de la ubre bovina y por ello puede vivir mucho tiempo fuera de esta. Posee diferentes factores de patogenicidad (factor aglutinante, coagulasa, DNAsa, hemolisinas etc.,), los que acumulados causan la enfermedad en la glándula.

A pesar de la alta capacidad de sobrevivencía de esta bacteria en el ambiente, los cuartos infectados de la ubre juegan un papel decisivo en la trasmisión de la infección por S. aureus en los establos lecheros. La maquina de ordeña, las toallas, las manos del ordeñador, trasmiten la bacteria de un cuarto infectado a otro sano. De la punta del pezón, pasa el patogeno a través del conducto galactoforo a la ubre. Mediante algunos factores de patogenicidad de la bacteria son eliminados, por lo menos parcialmente, los mecanismos de defensa de la ubre, por ello, este patógeno se presenta y elimina en la leche por muy largo tiempo. Algunos de los cúmulos de bacterias están rodeados por células inmunes en los alvéolos, por eso no hay una erradicación muy efectiva de las bacterias. El S. aureus, es capaz de encapsularse en el tejido de la glándula mamaria especialmente del epitelio alveolar, prolifera, de esta forma se hacen nódulos, que contienen bacterias vivas. Estas pueden salir posteriormente de esas celulas y el cuarto afectado empieza nuevamente a eliminarlas, lo que representa un peligro para los cuartos sanos. Debido al carácter contagioso de los agentes patógenos asociados con la ubre, los animales infectados son peligrosos para el hato lechero. Las bases para combatir a este tipo de patógenos consisten en medidas higiénicas durante el proceso de ordeña o a mitad, y la utilización consecutiva de selladores de los pezones.

El aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus de muestras de leche. Para la investigación de las muestras de leche de los cuartos sencillos de ubre tomadas asépticamente se usan comúnmente medios no selectivos. El agar sangre es el medio de cultivo mas adecuado para aislar los agentes causantes de mastitis. La diferenciación de estreptococos, Staphylococcus aureus, y Mycrococcus spp. se puede hacer bien en este medio. Si se le agrega =.1% de esculina se diferencian mejor los estreptococos. Para la preparación de agar sangre se puede utilizar sangre de borrego, la antihemolisina de estafilococos, presente en la sangre de determinados animales, puede inhibir la presencia de las hemolisinas α y β de S. aureus. Por ello debe ser probada cada sangre nueva mediante una cepa de referencia de S. aureus que forme una zona amplia de 4 a 6 milímetros de hemólisis incompleta (β), (cepa ATCC núm. 8096). La sangre de conejo, caballo o humano no es adecuada para la preparación de agar sangre.

Después de enfriar las muestras, las bacterias se concentran en la capa de grasa. Por ello todos los tubos deben ser cuidadosamente agitados y calentados a una temperatura de 16 a 18 °C. Inoculación de los medios. En el diagnostico microbiológico de la mastitis no se puede hacer una inoculación cuantitativa. Debido al tamaño del inoculo y a la superficie sembrada se dan las respectivas variaciones de la cantidad de cepas encontradas. Por eso se recomienda utilizar un inoculo de 0.05 mililitros, que deberá ser agregado a cuando menos media caja de Petri (se puede usar una asa con diámetro de 6 milímetros; una espátula de vidrio o un palillo de vidrio, también se pueden utilizar). Para la investigación de todas las vacas de un hato inclusive es posible un inoculo de 0.01 mililitros en un cuarto de una caja de Petri.

Por lo tanto todas las muestras de leche infectadas y las no infectadas contendrán una cantidad baja de microbios. También algunos cuartos infectados pueden en algunos casos contener menos de 20 microorganismos patógenos por mililitro. Entonces son necesarias mas investigaciones de diferentes muestras del mismo cuarto, ya que eso da mas y mejor información que varias inoculaciones de una sola muestra.

Staphylococcus aureus es el microorganismo económicamente mas importante causante de mastitis bovina. La conocida capacidad de supervivencia del S. aureus en el medio ambiente juega un papel importante en la trasmisión de la infección a otras vacas del hato lechero. Las pezoneras de la maquina de ordeña, las toallas de papel o textil y las manos del ordeñador trasmiten el agente patógeno de un cuarto infectado a un cuarto sano y de las vacas infectadas a las vacas sanas. De los plásticos de las pezoneras penetra el patógeno hacia el canal lineal y al tejido glandular de la ubre. Mediante algunos factores de patogenicidad específicos se eliminan, cuando menos en parte, las defensas de la ubre, eso ocasiona que el patógeno pueda sobrevivir y estar presente en la leche durante largos periodos.

Si bien acumulos de estafilococos en el tejido glandular son rodeados de células de defensa especificas, no se presenta, una destrucción efectiva de las bacterias patógenas.

Además de esto, el S. aureus es un agente causante de Zoonosis. Las bacterias secretadas en leche pueden, bajo condiciones desfavorables, ocasionar intoxicaciones alimenticias al humano. Una parte de las cepas aisladas de muestras de leche tiene la capacidad de formar enterotoxinas estables al calor; por protección del consumidor
esta bacteria no debe encontrarse en leche que el ganadero vende. Una de las metas del productor a largo plazo, debe ser la eliminación de S. aureus de todo el hato lechero.

En los últimos años se han logrado considerables avances al respecto en Hesse, Alemania. Durante el año 1995 se detecto en 13% de todas las muestras de leche de los cuartos investigados, el patógeno S. aureus. Para el año 2000 disminuyo esa tasa a 2.8%. En este caso se reconoce fácilmente que los ganaderos hicieron un enorme esfuerzo para mejorar la calidad de la leche, disminuyendo por una parte las células somáticas y, por otra, los agentes patógenos en la leche que se envía a las pasteurizadotas; sin embargo en muchos hatos lecheros aun se detecta este patógeno a niveles de hasta 40% de las vacas infectadas.

Esta bacteria produce en agar sangre colonias blanco-grisáceas y ocasionalmente doradas, con un diámetro de 3 a 5 milímetros. Regularmente se observan zonas de hemólisis.

La α hemolisina crea una zona clara con una hemólisis completa, mientras que la β-hemolisina causa una zona clara delimitada con una hemólisis incompleta (fig. 4).

Algunas cepas de S. aureus no producen hemólisis. Los estafilococos formadores de las hemolisinas tienen por lo regular el factor aglutinante y son coagulasa-positivos. Las colonias de estafilococos que tienen una zona muy pequeña de hemólisis (un milímetro o menos) o que tienen una hemólisis parcial, por lo regular son coagulasa negativos (fig.5). También esas cepas pueden causar infecciones con un número elevado de células somáticas en leche.

Los estafilococos son bacterias cocoides gram- positivas y se agrupan en forma de racimos de uva.

Identificación preliminar:
si no se presenta una zona clara de β-hemólisis en el agar sangre, no se necesita de hacer la prueba de la coagulasa o la del factor de aglutinación. En los demás casos se debe hacer ya sea la identificación del factor de aglutinación, de la coagulasa o una prueba con un equipo comercial que ayude a la clasificación de los estafilococos, especialmente de los coagulasa-negativos.

Prueba del factor de aglutinación. A una asa de bacterias que se han tomado de una caja con medio de agar sangre, se le agrega una gota de solución salina fisiológica y esto se mezcla en un portaobjetos con unas gotas de plasma citratado bovino o de cerdo o conejo. La aglutinación significa un resultado positivo. Paralelamente se
realiza una prueba control utilizando cloruro de sodio fisiológico.

Prueba de coagulasa en tubo de ensayo. Se toma una colonia sencilla de un cultivo de 24 horas de incubación –o se puede tomar 0.02 mililitros de un cultivo en caldo- y se mezclan con 1.0 y 3.0 mililitros de plasma citratado de conejo, de cerdo o de humano (este plasma previamente se diluirá en solución salina fisiológica 1:5). Además se deben tener dos controles, uno positivo y otro negativo. La incubación se hace en baño María a 37 ° C. La coagulación del plasma se observa a las 3 y 24 horas de incubación. Pruebas comerciales. Existen algunas pruebas comerciales para la aglutinación y hemoaglutinación que posibilitan la diferenciación de S. aureus de los estafilococos
coagulasa-negativos. La mayoría de estas pruebas enlazan el fibrinogeno y la proteína A unida con la inmunoglobulina G a las partículas de látex con eritrocitos. Algunas pruebas que existen en el mercado para la aglutinación en látex son: Staph. aureux, Bacto Staph. Latex, Staphylasa, Staphylex y Pastorez Staph. Plus.

La prueba de la penicilinasa.
La capacidad de los estafilococos para producir penicilinasa (β-lactamasa) es una propiedad que tiene gran importancia terapéuticamente. Cuando se aísla el S. aureus o alguna otra cepa de estafilococos de muestras de leche, para realizar un proceso terapéutico es necesario determinar si cada cepa es penicilinasa positiva o negativa,
mediante el siguiente procedimiento: En una caja de Petri con agar almidón se siembran las colonias de estafilococos con una asa de tal forma que se pueda formar una gran colonia (macrocolonia). Hasta 21 cepas de estafilococos se pueden probar de esta forma en cada caja de Petri.

Luego de la incubación (mínimo de 7 horas a 37 ° C) se agregan 2 mililitros de una solución de Penicilina G potasica con yodo e hidróxido de yodo en la caja con agar, y agitando suavemente se reparte en toda la superficie; el medio de cultivo se colorea de rojo oscuro. Después de 15 a 30 minutos en las colonias positivas a penicilinasa se forma un área de decoloración, sobre todo alrededor de la macrocolonia. En las colonias negativas a penicilinasa no se forma esa área. En las cepas que reaccionan a la penicilinaza se difunde la enzima en los alrededores de la colonia. Si a ese medio se le agrega una solución de yodo- hidróxido de yodo y penicilina G, y se forma en esa área, por efecto de la penicilinasa en la penicilina G, el acido penicilinico, debido a este aparece una decoloración del complejo yodo almidón alrededor de la zona de la macrocolonia.

TÉCNICAS ACTUALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA EL DIAGNOSTICO DE S. AUREUS.

En el pasado las técnicas de cultivo dominaron la investigación en microbiología médica. El agente patógeno era cultivado e identificado (siempre y cuando se tratase de agentes patógenos bacterianos causantes de enfermedades) con medios de cultivo líquidos o en gel y luego mediante procesos microscópicos, bioquímicas y serologicos. Frecuentemente se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos in vitro.

Hace poco tiempo se comenzaron a utilizar técnicas de investigación de biología molecular para realizar el diagnostico medico microbiológico. Además de la producción de antígenos recombinantes para su aplicación en identificaciones mediante anticuerpos, como la prueba de Enzym-linked-Immunosorbent Assay (ELISA) y en las técnicas de Western blot. También se utilizan la hibridación in vitro y la amplificación in Vitro de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles). En el caso de la hibridación in vitro se utiliza con frecuencia una sonda genética enzimática marcada, para identificar una secuencia especifica de ácidos
nucleicos. Con la PCR se puede detectar el acido nucleico buscado, mediante la amplificación in vitro del acido nucleico y enseguida un proceso adecuado de identificación (electroforesis en gel, hibridación o secuenciación).

En el diagnostico microbiológico tiene un uso mas diseminado la prueba de PCR, debido a que posibilita una identificación mas rápida y sensitiva de los agentes causantes de enfermedades.

Mediante la PCR se puede identificar el patógeno en cuestión de algunas horas, mientras que en los proceso de cultivo para la investigación microbiológica las muestras de leche necesitan cuando menos de 18 a 24 horas. Para esto se obtiene el ADN con una técnica especial de PCR (fig.6).

Las técnicas de diagnostico de biología molecular no podrán en un futuro cercano remplazar con seguridad las técnicas de cultivo bacteriológico para el diagnostico de la mastitis, pero muchas de ellas son aplicables para la complementación y mejora del diagnostico actual de rutina y para aclarar importantes preguntas científicas.

PCR Multiplex. En una prueba llamada PCR_Multiplex están presentes diferentes cebadores específicos de especie en una sola prueba. Con esta metodología se logra la identificación simultanea de S. aureus, St. agalactiae, St. dysgalactiae y St. uberis. La sensibilidad de esta prueba de PCR fue probada mediante la investigación de 117 muestras de cuartos de la ubre, para ser comparada con los métodos de cultivo bacteriológico rutinario. En el caso de S. aureus y St. uberis la sensibilidad a las pruebas de PCR fueron mayores que con los cultivos tradicionales (Lämmler et al. 1998, Phuektes et al. 2001)

Tipificación del S. aureus mediante técnicas de biología molecular.

El S. aureus aislado de casos de mastitis, ha sido estudiado y subdividido usando diferentes métodos, el perfil plasmidico y la tipificación por bacteriófagos, han dado buenos resultados en los
estudios epidemiológicos.

Actualmente las técnicas de biología molecular ayudan de forma considerable para los estudios epidemiológicos del S. aureus aislado de la glándula mamaria de vacas lecheras. En especial el fingerprinting geonómico ha probado en los últimos años ser sumamente útil, para las técnicas modernas de tipificación de aislamientos de S. aureus ya que con ello podemos observar si la misma cepa bacteriana coloniza la glándula mamaria de las vacas.

Se seleccionaron 27 cultivos de S. aureus aislados de vacas con mastitis clínica o subclínica, los cuales fueron identificados mediante las normas de la DVG 2002.

Para la identificación genética todas las 27 cepas fueron sometidas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el primer o cebador especifico 23 S rARN para S aureus. Enseguida todos los cultivos fueron sometidas a la prueba de ADN fingerprinting, un análisis de macro restricción mediante la electroforesis de campos
pulsatiles .

Todos los cultivos fueron positivos a la tinción de Gram, prueba de catalasa, prueba de coagulasa, factor de aglutinación, producción de acetoina, hemólisis, fermentación anaerobia de manitol y β-galactosidasa.

En el caso de la identificación genética de S. aureus con el segmento específico del gen 23 S r ARN, los 27 cultivos investigados fueron positivos, con un amplificado de 1270 pares de Bases, mientras que la cepa control negativo de S. epidermidis no dio ninguna banda en la electroforesis.

En el caso del análisis de macrorestriccion pudo ser confirmado que existen relaciones epidemiológicas entre los establos, así como dentro de cado uno de ellos, había dos patrones diferentes en el número de fragmentos observados, de acuerdo con Goering et al. 1998, esas diferencias pueden ser debidas a inserciones o deleciones en el corte de una secuencia, fuera del área de corte debido a la enzima de restricción SmaI . Entonces la mayoría de los cultivos (17) se observaron dentro del tipo I de patrón de restricción, por lo que se confirma el carácter de muy contagioso del S. aureus. Los restantes10 cultivos pertenecieron a los otros tres tipos de patrones observados.

También el predominio de un tipo de patrón sugiere que se trata muy posiblemente de la misma cepa infectiva, concordando con lo encontrado por Lipman et al. 1996 y Zschöck et al. 2000. La falta de variación de los patrones de macrorestricción sugiere la presencia de cepas similares que infectaron los hatos lecheros y también sugieren la transmisión del agente patógeno durante el ordeño y de una vaca a otra. Las técnicas de biología molecular son muy útiles para poder lograr un establecimiento de las relaciones epidemiológicas en la transmisión del microorganismo patógeno S. aureus.

Ejemplo de detección de factores de virulencia en S. aureus mediante la biología molecular. S. aureus posee varios factores de virulencia asociados con la pared celular y extracelulares, los cuales contribuyen a favorecer la patogenicidad de cada cepa de esta especie (Wolter et al. 2004, Zschöck et al. 2000)(Fig.7). Las proteínas extracelulares secretadas por el S. aureus comprenden, entre otras, la variedad de enterotoxinas estafilocóccicas conocida como enterotoxinas estafilocóccicas (SE) de la A a la Q, las toxinas exfoliativas A (ETA) y B (ETB), la toxina del síndrome de choque tóxico (TSST-1) y una exotoxina similar nueva en el grupo (SET 1-11). La mayoría de esos factores de virulencia extracelulares están codificados por elementos móviles genéticos, como plásmidos, bacteriófagos o islas de patogenicidad, que facilitan la diseminación horizontal de las poblaciones de S. aureus (Omoe et al. 2002, Dinges et al. 2000, Hookey et al. 1998, Annemüller et al. 1999a, 1999b) Fig. 8. La presente investigación fue diseñada para caracterizar genotípicamente al S. aureus aislado de casos de vacas con mastitis clínica y subclínica de una región de México.

Figura 7.- Patrones de fragmentos de restricción del ADN geonómico del cromosoma de S. aureus, generado del tratamiento con la endonucleasa de restricción Sma I, en 27 cepas aisladas de casos de mastitis en diferentes hatos lecheros. M marcador de peso molecular, carril 1 y 2 Patrón I, carriles 3 -6 Patrón II, carriles 7 y 8 Patrón III y carril 9, patrón IV.

Figura 8.- Identificacion de factores de virulencia bacterianos de cultivos mediante PCR: Staphylococcus aureus.

En la presente investigación fueron comparadas genotípicamente 40 cepas de S. aureus aisladas de muestras de leche de vacas con mastitis clínica y subclínica de diferentes establos en la región Occidente de México. Con el fin de detectar genes para diferentes exoproteínas de estafilococos, proteínas celulares de superficie y dos clases del gen regulador accesorio agr, se usaron 62 cebadores oligonucleótidos diferentes y la técnica de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Omoe et al. 2002, Hookey et al. 1998, Cabral et al. 2003). Para el análisis estadístico de los genes investigados fueron utilizadas, la prueba exacta de Fisher y la prueba exacta de Fisher modificada. Los S. aureus investigados fueron uniformemente positivos para el segmento del gen 23S rARN, que codifica una parte específica del S. aureus, y los genes que codifican para la nucleasa termoestable (nuc), el factor aglutinante o clumping factor (clfA), la coagulasa (coa ) y los segmentos de gen que codifican la región repetitiva Xr y el sitio enlazante de la IgG, para la proteína A (spa).

Todas las cepas investigadas fueron positivas además para los genes hla, fnbA, ebpS y setl, y negativas para los genes sbi, sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sej tst, eta y etb. Los genes restantes, incluyendo hlb, feb, cna (dominio A y B), cap5, cap8, agr clase I, agr clase II y sei, fueron detectados en un número variable de aislamientos.

Se pudieron observar diferencias significativas entre cepas de S. aureus aisladas de casos de mastitis clínica y subclínica, en el tamaño del gen clfA, en la distribución del tamaño del amplificado para el gen coa, del segmento codificador del gen Xr del gen spa y en la presencia de los genes hlb, febB, agr clase I y agr clase II, respectivamente.

Los resultados de la genotipificacion, en el presente estudio, dan una primera información acerca de las propiedades genotípicas y de la distribución de los genes de virulencia entre la población de S. aureus en el occidente de México. Lo anterior ayuda al entendimiento de la situación de la Mastitis bovina en México y puede ser la base de estrategias preventivas para erradicar cepas de S. aureus con fuerte potencial patógeno.

Capítulo del libro módulo Jean Monnet de marzo de 2018 de la Ciudad de México.

Avances en las investigaciones de Staphylococcus aureus como agente patógeno causante de Mastitis bovina, mediante biología molecular.

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