Efecto de los ácidos grasos omega3 (n-3) incorporados a las dietas de gallinas sobre la composición del huevo

4.1 Objetivo general:
Obtener huevos enriquecidos con ácidos grasos omega-3 mediante la utilización de aceites de vísceras de calamar de origen argentino.

5.1. Descripción del ensayo en vivo
Lugar: INTA – EEA Pergamino, Sección Avicultura.
Aves - Tipo: Ponedoras Hy-Line W-36;
Cantidad: 144 aves
Alojamiento: Jaulas de 30 cm de frente x 45 cm de profundidad.

Diseño experimental: Arreglo factorial 3 x 2 (3 aceites y 2 niveles de vitamina E). Cada tratamiento contó con un lote (6 jaulas con 4 gallinas) de 24 aves de las cuales se tomaron 78 huevos para evaluar los distintos parámetros considerados (ver toma de muestras, tabla 5.1.2). Los resultados fueron sometidos a análisis de varianza utilizando el software SAS y las diferencias entre medias se analizaron mediante el Test de Duncan.

Inicio: Julio 2 de 2013 con 32 semanas de vida cumplidas.

Duración: Un período de 28 días.

Parámetros evaluados: Después de 25 días de suministrar las dietas experimentales se evaluó:

Toma de muestras ensayo Omega 3: se realizó según la descripción de la tabla 5.1.2


5.1.2 TABLA. Descripción de los días en que se realizó la toma de muestra

Se realizaron seis (6) tratamientos usando tres (3) fuentes de aceite y la incorporación de vitamina E en dos niveles 0-100ppm de acetato de αa-tocoferol. La descripción del mismo se puede observar en la tabla 5.1.2.

Las dietas fueron formuladas para ser isoenergéticas e isoproteicas (Tabla 6.1.).

6.1. TABLA. Descripción de los tratamientos.

6.1.1. TABLAS Composición de las diferentes dietas: Materias primas utilizadas y nutrientes.

6.2. Determinaciones analíticas en las dietas/alimentos
Se evaluó el perfil lipídico de los aceites utilizados para la suplementación de los alimentos en ácidos grasos n-3 en el Instituto de Tecnología Alimentaria, INTA, Castelar (ITA).

6.2.1. Perfil lipídico de los aceites
Los lípidos fueron extraídos usando la metodología de Folch y col. (1957). Los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAME) fueron preparados de acuerdo al protocolo descripto por Pariza y col. (2001). Una muestra alícuota de 1 mg de aceite fue transesterificada con una solución de ácido clorhídrico 4% (v/v) en metanol. Los metil ésteres de los ácidos grasos fueron cuantificados utilizando un cromatógrafo de gases con un detector de ionización de llama Chrompack CP900S (Chrompack International – Middelburg, Países Bajos). En el mismo se utilizó una columna capilar modelo CP-SIL 88 (Chrompack International – Middelburg, Países Bajos) de 50m x 0,25mm de diámetro interno recubierta y nitrógeno como gas de transporte. La temperatura fue programada a 70°C por 4min, luego se incrementó a 170 °C a 13 °C.min-1, de 170 °C a 200°C la temperatura subió 1°C.min-1. La temperatura del inyector y del detector fue mantenida a 250 C. Los ácidos grasos fueron identificados por comparación con los tiempos de retención de los ácidos grasos estándares (PUFA-3 Animal Source, Supelco, Bell Fonte, PA, USA). Los resultados se expresan como porcentaje del total de ácidos grasos por 100 g de grasa utilizando estándar externo. 

6.3.1: Análisis físico de los huevos
Los análisis de peso, altura de albúmina, resistencia al quiebre, color y Unidad Haugh se realizaron utilizando un Equipo automático marca Navel, modelo DET6000 de la firma DSM.

6.3.2. Perfil de ácidos grasos
Los lípidos totales fueron extraídos con cloroformo: metanol (2:1, v/v) mediante una adaptación del procedimiento de Folch y col. (1957).

6.3.3. Sustancias reactivas al ácido tiobarbiturico (TBARS)
La determinación de TBARS se realizó por triplicado según el método de extracción ácida (Descalzo et al., 2005). Se tomaron alícuotas de 2 g de yema y se colocaron en tubos falcon que contenían 6 mL de una solución de ácido tricloroacético (TCA) 10% p/v y 6 mL de agua. Las muestras se homogeneizaron durante 3 minutos. Posteriormente se realizó el filtrado de la muestra en papel Whatman N°2 (Schleicher&Schuell, Dassel; Germany). Se mezclaron iguales cantidades de sobrenadante y solución de ácido 2-tiobarbitúrico (ICN BiomedicalsInc, Ohio, USA) en una concentración de 0,02M incubándose luego las mismas durante toda la noche hasta el desarrollo de un color rosado.

Se determinó el desarrollo de color a 530nm en un espectrofotómetro UV-Visible Lambda Bio-20 (Perkin Elmer Corp. – Norwalk, CT, USA) y los valores se compararon con los de una curva estándar realizada con 1,1,3,3 tetraepoxipropano, TEP (Sigma, Stéinheim, Germany). Los resultados fueron expresados en mg demalonaldehído, MDA/ kg de yema.

6.3.4. Vitamina E
Las vitaminas αa-tocoferol y g-tocoferol se determinaron por cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), de acuerdo a la metodología modificada de Butriss & Diplock (1984). Se tomó 1 g de yema de huevo AGROINDUSTRIA CAENA que fue homogeneizada con buffer fosfato de potasio pH 7,7. Luego las muestras se atemperaron por 2 minutos a 70 °C. Luego se agregaron 0.9 mL de hidróxido de potasio 10 N y se llevó a cabo la saponificación por 30 min a 70 °C con hidróxido de potasio 10 N. Después de enfriar se agregó 3 mL de agua destilada a todos los tubos más 12 mL de n-hexano y se agitaron durante dos minutos con vórtex a fin de facilitar la extracción de los compuestos liposolubles en la fase orgánica. Se extrajo el sobrenadante y se realizó otra extracción con 6 μL de hexano. Posteriormente, las fases orgánicas se juntaron en un tubo de vidrio y fueron evaporadas a sequedad bajo flujo de nitrógeno, resuspendidas en 500 μl de etanol absoluto y filtrado previamente a la inyección con una jeringa a través de una membrana de nylon de 0,45 mm de tamaño de poro.

Las muestras fueron analizadas en un HPLC de fase reversa equipado con una bomba cuaternaria modelo P4000 (Thermo Separation Products Inc. – Piscataway, NJ, USA) con un desgasificador y un bucle de inyección manual de 20 ml y conectado a una columna Alltech® Alltima® C18 (250mm x 4,6mm) y tamaño de partícula 5μm.

El detector electroquímico Decade (Antec Leyden – Zoeterwoude, Países Bajos) fue equipado con una célula de flujo con Ag/ AgCl y carbón cristalino como electrodos de referencia y trabajo respectivamente. La fase móvil para la detección electroquímica fue modificada de acuerdo a la técnica descripta por Rijkeet al. (1997).El flujo fue de 1 μL/min y las células de referencia fueron programadas a +700μV. La recuperación de αa y g-tocoferol rondó el 98%. Se trazaron curvas de calibración con estándares de DL aα-tocoferol y g-tocoferol (Sigma, Saint Louis, USA) diluidos en etanol absoluto.

6.3.5. Análisis Sensorial
Se realizó en el Centro de Agroindustria, CNIA-Castelar Instituto Tecnología de Alimentos CC 77(1708) Morón, Buenos Aires. El ensayo se llevó a cabo considerando dos series de huevos, cada una compuesta por muestras provenientes de los tres tratamientos sin vitamina E suplementaria y la segunda serie con los tratamientos que tenían 100 ppm de vitamina E.

Los huevos se cocinaron según la metodología de Caston y Leeson (1990). Una vez cocidos, se mantuvieron en baño termostático a 37ºC aproximadamente hasta el momento de su presentación a los consumidores.

La prueba se realizó con un total de 84 evaluadores, cuya composición fue la siguiente: 57% de mujeres y 43% de hombres, con un promedio de edad de 37,5 años.

A cada uno de los evaluadores se le presentaron ambas series de muestras de huevo de a mitades, codificadas con números de 3 dígitos y acondicionadas en contenedores térmicos con tapa de modo de mantener una temperatura de aproximadamente 35 ± 0,5ºC. Además, se proveyó agua mineral natural y galletitas de agua sin sal que sirvieron como carrier.

Se solicitó a los evaluadores probar las muestras tal cual presentadas de izquierda a derecha (de a una serie por vez) y luego registrar en la planilla de evaluación otorgada.

Los datos recolectados se sometieron a una análisis estadístico mediante el Test de Friedman (aα=0,05).

7.1. Determinar el costo de producción del producto a obtener.
La estimación del costo se realizó en base a un dólar de 15 pesos argentinos, suponiendo un valor promedio de conversión por kg de huevo y el peso promedio del huevo en base al trabajo de Antruejo y col. (2010) considerando para tal fin el valor promedio de los tratamientos control, aceite de lino y aceite de chía debido a que los mismos no afectaron significativamente dichos parámetros de producción y son aceites al igual que se usó en este estudio. La producción de huevos enriquecidos con omega-3, considerando un huevo de 65g tendría en costo alimenticio de la dieta con omega-3 de 30 % más cara que la dieta con aceite de soja y si se le incorporara además vitamina E el valor se incrementaría en un 31,4% (tabla 7.1.1) 

7.1.1 TABLA. Impacto de la inclusión de fuente de omega-3 y vitamina E sobre el costo de la ración
 

8.1. Análisis de los aceites y dietas
El aceite de calamar presentó una concentración de ácidos grasos omega -3 de CL de 26,22% y el aceite de lino una concentración de ALA de 42,93% (Tabla 8.1 ).

Según estudios realizados y evaluados por Cornejo y col. (2008) algunos de estos valores son el resultado de la progresiva mayor proporción de AGPI que poseen estos productos, y exponen las variables productivas en la Tabla 8.1 se aprecia que los tratamientos que incluían lípidos de origen marino en las dietas mostraron valores superiores (P < 0,05) al control, MS: TI .

Cabe destacar que para todas las variables productivas no se produjeron diferencias entre los tres tratamientos con insumos de origen marino (P > 0,05). La sola excepción fue el PH (peso del huevo), donde el grupo HPALK (harina de pescado y Alkitol®) fue estadísticamente semejante (P > 0,05) al control MS y a su vez, inferior (P < 0,05) a los tratamientos HPO (harina de pescado y oleína) y HPACP (.harina de pescado y aceite de pescado)

El indicador MH (masa de huevo), evaluado solamente como promedio general para todo el período experimental, mostró diferencias significativas (P < 0,05), sólo entre el control (MS) y el grupo HPO. 

8.1 TABLA: Indicadores productivos totales de gallinas en en el ensayo. Cornejo.et al 2008.

Al observar los resultados económicos en la tabla 8.1, fue el tratamiento 1 el que presentó el menor MB y mayor costo alimentario; en cambio, el tratamiento 2 mostró el mejor MB con el menor costo alimentario por kilo de huevos.

En general, durante el ensayo, y a partir de la segunda semana, los tratamientos que incluían lípidos de origen marino fueron superiores en CA, PP, ECA y PV, al control. En el transcurso de la sexta semana del ensayo hubo una declinación de los indicadores, exceptuando el PV en los tratamientos HPO, HPACP y HPALK.

Esta menor respuesta estuvo asociada a la vacunación contra Salmonella enteritidis, efectuada al final de la quinta semana. La mortalidad fue marginal alcanzando a cuatro aves (1,85%) del total de las alojadas en el galpón.

Los resultados de las evaluaciones químicas efectuadas a insumos y dietas fueron los esperados para alimentos con altos porcentajes de AGPI, entre ellos, la presencia de un alto nivel de peróxidos en ALK. Estos insumos lipídicos altamente insaturados tienen un gran riesgo oxidativo y deben ser “protegidos”, con la incorporación de antioxidantes (por ejemplo vitamina E)

Las respuestas productivas de las gallinas (Tabla 8.1) no fueron afectadas negativamente, al compararlas con el grupo control, por la inclusión de hasta un 6% de aceites marinos en sus dietas (HPACP y HPALK), y los resultados son coincidentes con lo informado por Hargis y col. (1991) y por Van Elswyk y col. (1992).

Estos autores en el mismo trabajo (Cornejo et al, 2008), aportaron datos de la evaluación sensorial realizada afirmando que ninguna de las preparaciones culinarias de los huevos de los tratamientos utilizados fue rechazada para las variables analizadas.

El análisis estadístico confirmó estos resultados al no evidenciar diferencias significativas entre los cuatro tratamientos (P > 0,05). Más aún, casi todos los valores obtenidos se ubicaron en la zona de “aceptación” (puntajes entre 8 y 15 cm).

8.2. TABLA Perfil lipídico de los aceites utilizados (g/100 g de grasa)

8.2. Perfil lipídico de las dietas
La incorporación en las dietas de aceite de lino o calamar se vió reflejada en la composición de las mismas (Tabla 8.2.1). El porcentaje de omega-3 de CL en la dieta con aceite de calamar fue de 5,75 y en la dieta que tenía lino la concentración de ALA fue de 16,64%. 

8.2.1 TABLA Perfil de lípidos de las dietas analizadas (g/100g de grasa)

8.3.1. Calidad interna de los huevos. Efecto de la fuente de omega tres y el agregado de vitamina
Se observó solo un efecto significativo de fuente de omega-3 sobre la altura y las Unidades Haugh (UH) (Tabla 8.3.1.1). Debido a la interacción que aparece entre vitamina y aceite sobre la variable resistencia, se estudiaron los seis tratamientos independientemente (Tabla 8.3.1.2.) observándose que los huevos del tratamiento 3 y 4 fueron diferentes estadísticamente a los huevos control. 

8.3.1.1. TABLA Efectos principales sobre la calidad interna de los huevos

8.3.1.2. TABLA Efectos de los diferentes tratamientos.

En la variable peso no se observaron diferencias con respecto a los diferentes tratamientos, sí con respecto a la altura donde es más significativamente mayor en el caso de la adición de aceite de calamar y vitamina E, al igual que en relación a la UH. No así en el caso del color ni tampoco en la resistencia.

8.4. Perfil lipídico de los huevos
Se observó un impacto significativo de las diferentes fuentes de omega-3 sobre los AGPI n-3 y n-6 (Tabla 6.3.1.). Por otro lado, la concentración de Ácidos Grasos Saturados (AGS); AGPI y Ácidos Grasos Monoinsaturados (AGMI) no fueron diferentes estadísticamente entre tratamientos. La inclusión de aceite de lino a la dieta produjo un incremento en la deposición de ALA respecto a las aves alimentadas con la dieta control (2,48% vs 0,66 %). Esta respuesta también fue observada por Bentancour y Díaz (2009), con valores mayores cuando usaron semilla de lino al 10% debido a que el aporte de ALA a la dieta fue prácticamente el doble que el realizado en esta experiencia (2,48 % vs 4,70 %). Por otro lado, Antruejo y col. (2011) encontraron que la incorporación de aceite de lino al 6% produjo una deposición de 6,49 % de ALA en huevos. En este estudio la inclusión de aceite lino al 2% en la dieta condujo a una deposición de 2,49 % de ALA en el huevo.

La fuente de aceite de vísceras de calamar produjo un incremento significativo de EPA (0,24 % vs 0,05 %) y DHA (3,25 % vs 1,0 %) respecto a la dieta control. Similar respuesta fue encontrada por Baucells y col. (2000) cuando usó aceite de pescado al 4 % y evidenció una deposición de DHA de 3,18 % en huevo utilizando aceite con 6,13% de DHA, similar a los niveles utilizados en esta experiencia (6% de DHA). 

8.4. 1. TABLA Perfil de lípidos de las yemas de huevos (g/ 100g de grasa) en las distintas dietas con las diferentes fuentes de aceite.

Considerando que un huevo contiene aproximadamente 4,6 g de grasa (Antruejo et al, 2011) el contenido promedio de omega-3 fue de 90 mg para a un huevo comercial estándar, mientras que la inclusión de aceite de lino y aceite de calamar proporcionó 229 y 207 mg de omega-3 (Tabla 8.4.2).

En el caso que la fuente fue el aceite de lino la suma de EPA Y DHA corresponde a un 41% del total de omega-3, por otro lado la incorporación de aceite de calamar la suma de EPA Y DHA corresponde al 84% del total de omega-3 de cadena larga.

8.4.2. TABLA Aporte de omega-3 por huevo (mg/huevo)

8.5. Estabilidad oxidativa
Los tratamientos con aceite de lino o pescado tuvieron mayores valores de TBARS. Por otro lado, se observó un efecto significativo (p<0,05) de la vitamina E sobre los valores de TBARS (Tabla 8.5.1.). Posiblemente se deba a que al aumentar el grado de insaturación de los lípidos aumenta la factibilidad de oxidación (Rimer & Givens, 2010).

Las aves alimentadas con vitamina E tuvieron huevos con menores valores de TBARS. La disminución en el status oxidativo con el uso de vitamina E no fue observado por Galobart y col. (2001) en huevo fresco, pero sí en huevo deshidratado. Es importante destacar que los niveles de malondialdehido (MDA) fueron muy bajos, ya que se ha establecido para carnes y subproductos que niveles superiores a 0,5 mg/kg de MDA se consideran parcialmente oxidados (Coetzee & Hoffman, 2001). 

8.5.1. TABLA Estabilidad oxidativa: TBA (mg de MDA/Kg de yema), en huevo crudo.

8.6. Contenido de vitamina E en huevo
Debido a que los resultados de contenido de vitamina E no poseen una distribución normal de datos y las varianzas no fueron homogéneas, se analizaron las dos poblaciones utilizando el programa Epidat 3.1, utilizando la inferencia de datos sobre dos poblaciones, permitiendo concluir que ambas son diferentes estadísticamente (p>0.05), Tabla 8.6.1.

La incorporación de 100 mg/kg de alfa tocoferol acetato en la ración permitió obtener huevos con un valor promedio de 107 µg de α tocoferol /g de yema mientras que los tratamientos en los que no se agregaron los 100 mg/kg dl alfa tocoferol acetato, los huevos tuvieron un promedio de vitamina E de 14 µg α tocoferol /g de yema. El incremento de vitamina E en el huevo cuando se suplementa la dieta con vitamina E también fue observado por Jiang y col. (1994) y por Gjorgovska y col. (2016).

Los valores de vitamina E encontrados en los huevos, en esta experiencia, fueron similares a los valores reportados por Galobar y col. (2001).

Considerando un huevo con 18 g de yema, el aporte por huevo sería de 1926 µg versus 252 µg de vitamina E. Esto está demostrado en la Tabla 8.6.1: contenido de vitamina E (aα-tocoferol) en huevo (microgramos /g yema). 

8.6.1. TABLA Contenido de Vitamina E (α- tocoferol) en los huevos de gallinas alimentadas con y sin suplementación de Vit. E.

8.6.2. TABLA Contenido de vitamina E expresado como alfa tocoferol (microgramos /g de yema).

Analizando los valores de vitamina E de las gallinas que no estuvieron suplementadas las dietas con vitamina E, los huevos de los tres tratamientos no presentaron diferencias significativas (p>0.05) en el contenido de vitamina E. Por otro lado, en los huevos provenientes de las gallinas alimentadas con la dieta suplementada con 100 ppm de vitamina E, el tratamiento 2 fue levemente superior al tratamiento 1 (p<0.05) y no diferente del tratamiento 3.

8.7. Análisis Sensorial
Serie 1: Las muestras 1 y 2 son equivalentes en preferencia con la población ensayada, mientras que las muestras 3 son preferidas en menor grado pero en equivalencia con las muestras 1 (Tabla 8.7.1 ).

En esta serie no se identificó diferencia significativa entre los huevos del lote suplementado con aceite de lino y los de aquel suplementado con aceite de soja, ni entre los huevos del lote suplementado con aceite de soja con aquellos del lote suplementado con aceite de pescado. Sí se identificó una diferencia significativa entre los huevos del lote suplementado con aceite de lino y los del lote suplementado con aceite de pescado.

Serie 2: las muestras 4 y 5 son equivalentes en preferencia con la población ensayada. Las muestras 6 son preferidas en menor grado.

No se hallaron diferencias significativas entre las muestras del lote suplementado con aceite de lino + Vit. E y el suplementado con aceite de soja + Vit. E. Mientras que sí se hallaron diferencias significativas entre estos y las muestras provenientes del lote suplementado con aceite de pescado y Vit. E. Por lo tanto, concluimos que la suplementación utilizada en el presente ensayo incide en los atributos sensoriales de los huevos. 

8.7.1: TABLA Resultados del análisis sensorial de las dos series estudiadas

^{Medias con diferente supraindice son diferentes estadísticamente (p<0.05)}