Efectos positivos del Bacillus amyloliquefaciens en pollos de engorde bajo desafío entérico de patógenos

Se estima que la enfermedad por enteritis necrótica causa una pérdida anual de $6 billones para la industria avícola a nivel mundial (Wade y Keyburn, 2015). Esta enfermedad inicia por lesiones en la mucosa del intestino causadas por coccidias y se agrava por el crecimiento de cepas de Clostridium perfringens productores de toxinas NetB en el intestino (Keyburn et al., 2008).

Los antibióticos promotores de crecimiento (AGP, por sus siglas en inglés) se han utilizado para controlar bacterias patógenas y mejorar el rendimiento y salud; sin embargo, el uso extensivo de AGP y el desarrollo de bacterias patógenas resistentes a los antimicrobianos resultaron en la prohibición de AGP en algunas regiones. En consecuencia, el uso de probióticos ha recibido especial atención como alternativas potenciales para reemplazar los AGP debido a que pueden proporcionar una mejora similar en el rendimiento, así como el potencial de modular la microbiota del intestino.

Los probióticos son microorganismos vivos proveídos en el alimento, los cuales pueden reducir la carga de patógenos por exclusión competitiva y pueden mejorar la salud y absorción de nutrientes en el huésped. Ecobiol® es un producto probiótico que contiene la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940, la cual es una cepa con características de crecimiento rápido y una alta tolerancia a las secreciones gástricas y biliares. Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 puede mejorar la tasa de conversión alimenticia y reducir las bacterias patógenas en el intestino como se demostró anteriormente (De Oliveira et al., 2019). Por lo tanto, se realizó este estudio para evaluar la eficacia de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) en pollos de engorde sometidos a un desafío de patógeno entérico leve. Esta prueba fue realizada por el Dr. Shubiao Wu en la Universidad de Nueva Inglaterra en Australia.

Cuatrocientos ochenta pollitos Ross 308 de un día de edad de nacidos con un peso inicial promedio de 42.0 ± 0.1 g fueron asignados aleatoriamente a uno de los cuatro tratamientos de dietas con ocho réplicas de 15 aves por corral. Las dietas basales compuestas principalmente de trigo, sorgo y harina de soya fueron formuladas para cumplir con las recomendaciones de aminoácidos de Evonik (AMINOChick® 2.0) para las fases de inicio (días 1-10), crecimiento (días 11-24), y finalizador (días 25-35) con dietas proporcionadas en forma de pellets. Los tratamientos consistieron en: 1) grupo no desafiado recibiendo una dieta basal sin probióticos; 2) grupo no desafiado recibiendo una dieta basal con 0.5g/kg Ecobiol 500® (1 x 106 UFC/g de B. amyloliquefaciens CECT 5940); 3) grupo desafiado recibiendo una dieta basal sin probióticos; y 4) grupo desafiado + 0.5g/kg Ecobiol 500® (1 x 106 UFC/g de B. amyloliquefaciens CECT 5940). El desafío consistió en la inoculación de 1mL Eimeria (5,000 ooquistes esporulados de E. maxima y E. acervulina y 2,500 de E. brunetti) al día 9 y 1ml de C. perfringens (108 UFC) a los días 14 y 15. Se proporcionaron alimento y agua ad libitum durante el período experimental.

Se registraron el peso corporal y el consumo de alimento en el día 35 para el cálculo de ganancia de peso y tasa de conversión alimenticia. La causa, fecha y peso de aves muertas se registraron diariamente. En el día 16, cuatro aves por corral fueron escogidas aleatoriamente y pesadas. Estas aves fueron aturdidas eléctricamente, y se recolectaron muestras de sangre y se separó el suero para análisis de ácido úrico. Se utilizaron muestras de 1ml de contenido cecal agrupado para la extracción de ADN de acuerdo al proceso de Kheravii et al. (2017).

La muestra cecal restante fue utilizada para la evaluación de ácido graso de cadena corta (SCFA, por sus siglas en inglés) de acuerdo al método descrito por Jensen et al. (1995). Las muestras de digesta ileal recolectadas el día 35 se liofilizaron a -50°C y se molieron finamente. Las muestras de dieta y de digesta liofilizadas se analizaron para el contenido total de aminoácidos (AA) en el laboratorio AMINOLab® de Evonik en Singapur. El coeficiente de digestibilidad ileal aparente de los AA fue calculado con la siguiente fórmula: CDIA = (100 – (100 × Id × AAdc/Idc × AAd))/100; donde: Id = contenido del indicador (TiO2) en materia seca (DM, por sus siglas en inglés) de la dieta, AAdc = contenido de aminoácidos en DM de la digesta, Idc = contenido de TiO2 en DM de la digesta, AAd = contenido de aminoácidos de DM de la dieta. El día 35, aproximadamente 1 kg de cama fue recolectada aleatoriamente para evaluar la humedad al secar en el horno a 105°C por 24 h. El día 35, cuatro aves por corral fueron seleccionadas, sacrificadas y realizado cortes de pechuga, muslo y grasa abdominal, mientras que la almohadilla plantar fue evaluada por puntajes de 0 a 4 de acuerdo al nivel de gravedad (Welfare Quality, 2009). Los datos fueron analizados mediante el paquete estadístico SPSS versión 22. Los valores medios de los tratamientos fueron comparados mediante la prueba de Tukey. La significancia estadística fue declarada en una P < 0.05.

Los resultados de los parámetros de desempeño y los rendimientos de corte se presentan en la Tabla 1. No se observaron diferencias significativas entre el desafío y la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 en mortalidad, desempeño y rendimientos de corte (P>0.05). El desafío inducido disminuyó significativamente la ganancia de peso corporal, consumo de alimento y rendimiento de carne de pechuga, mientras que la tasa de conversión alimenticia aumentó significativamente (P<0.05). Por otro lado, la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 aumentó significativamente la ganancia de peso corporal, consumo de alimento, rendimiento de carne de pechuga y mejoró significativamente la tasa de conversión alimenticia (P<0.05) independientemente del desafío. No se observaron efectos significativos del desafío o la suplementación de probióticos en mortalidad ni en rendimientos de muslo o grasa (P>0.05).

Los resultados observados en el presente estudio van acorde con De Oliveira et al., 2019, los cuales mostraron que la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 mejoró significativamente la TCA y el rendimiento de carne de pechuga en pollos de engorde que también fueron desafiados con Eimeria y C. perfringens. Se observó que los pollos de engorde con una mejor TCA probablemente fueron más eficientes a usar los nutrientes para la deposición de músculo con “prioridad” en la deposición de carne de pechuga.

Los coeficientes calculados de digestibilidad ileal aparente de aminoácidos se presentan en la Tabla 2. No se observaron interacciones entre el desafío y suplementación de Ecobiol® para los coeficientes de digestibilidad (P>0.05). No hubo afecto del desafío en los coeficientes de digestibilidad de aminoácidos (P>0.05), probablemente debido a que la recolección fue tardía en relación al periodo de desafío (d9) permitiendo a las aves recuperarse. La suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 aumentó significativamente los coeficientes de digestibilidad de AA, especialmente cistina, valina, glicina y serina (P<0.05) independientemente del desafío. El aumento en la digestibilidad ileal aparente podría estar relacionado con la disminución de las pérdidas endógenas de AA. Otra posible razón sería la mejor integridad del intestino promoviendo la actividad enzimática en las microvellosidades.

Los resultados de los análisis qPCR se presentan en la Tabla 3. No se observaron interacciones entre el desafío y la suplementación de Ecobiol® para todos los grupos bacterianos (P>0.05). Clostridium perfringens y Bacteriodes spp. se incrementaron con el desafío, mientras que Bacillus, Bifidobacterium y Ruminococcus spp. disminuyeron significativamente (P<0.05). Por otro lado, Bacillus y Ruminococcus spp. aumentaron significativamente con la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940, pero no hubo cambios en los otros grupos bacterianos.

Como se observó en el estudio anterior, la inducción de enteritis necrótica disminuyó significativamente la frecuencia relativa de Ruminococcus y Ruminococcaceae y aumentó la frecuencia relativa de Bacteroides (Bortoluzzi et al., 2019), pero la suplementación de B. subtilis DSM 31325 pudo restaurar la microbiota. En el presente estudio, se demostró que la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) también puede aumentar la frecuencia de Ruminococcus.

Los resultados de la cuantificación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) se presentan en la Tabla 4. No se observaron interacciones entre el desafío y la suplementación de Ecobiol® para los SCFA cuantificados (P>0.05). La concentración de ácidos acéticos y butíricos disminuyó con el desafío mientras que el ácido láctico aumentó significativamente (P<0.05). La suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) aumentó significativamente la concentración de ácido butírico, probablemente debido al aumento en la familia Ruminoccocus spp. observado en el ciego (Tabla 3). El butirato tiene beneficios en el desarrollo del tracto gastrointestinal (GIT, por sus siglas en inglés) y la salud intestinal, lo que también explicaría las mejoras observadas en el rendimiento de crecimiento y la composición de la canal (Bedford y Gong, 2017).

Los resultados del ácido úrico (UA, por sus siglas en inglés) sérico medidos al día 16, la evaluación de la dermatitis de la almohadilla plantar (FPD, por sus siglas en inglés) y humedad de la cama al día 35 se presentan en la Tabla 5. No se observaron interacciones entre el desafío y la suplementación de Ecobiol® para el UA, FPD o humedad de la cama (P>0.05). Hay una reducción significativa en el UA sérico con el desafío (P<0.05), lo cual podría ser una respuesta a la reducción en el consumo de alimento, y consecuentemente, a la reducción de los consumos de proteína y aminoácidos. Además, el desafío aumentó significativamente el puntaje promedio de la FPD (P<0.05). No se observaron diferencias con la suplementación de Ecobiol® en el UA, FPD o humedad de la cama (P>0.05). Nuestro estudio anterior demostró que la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) puede mejorar los puntajes de calidad de la cama y FPD (De Oliveira et al., 2019), pero en el estudio actual, los puntajes fueron mucho menores a aquellos reportados por De Oliveira et al. (2019), reduciendo la posibilidad de encontrar diferencias significativas.

En general, la inclusión en la dieta de Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) aumentó significativamente el consumo de alimento, ganancia de peso, digestibilidad de aminoácidos (Cys, Val, Gly y Ser) y rendimiento de carne de pechuga, además de mejorar la tasa de conversión alimenticia, independientemente de la condición del desafío. Además, las poblaciones de Bacillus spp. y Ruminococcus spp. aumentaron significativamente en el área cecal con la suplementación de B. amyloliquefaciens CECT 5940, independiente de la condición de desafío, lo cual potencialmente contribuyó al aumento significativo en la producción de ácido butírico en el ciego, reflejando el rendimiento mejorado.