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Detección de Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodisenteriae y Brachyspira pilosicoli en materia fecal mediante PCR multiplex. Estudio transversal en 6 granjas intensivas

Publicado el: 10/11/2014
Autor/es: Estefania Perez (Becario PICT-FONCyT - Laboratorio de Patología Especial Veterinaria); C Zubia; y Chavez F (Becario CIC); L Alarcon (Clínica de grandes animales); Hernan Barrales (Becario UNLP y Clínica de grandes animales); M Lozada (Laboratorio de Patología Especial Veterinaria y Becario UNLP); Fabiana Moredo (Cátedra de Microbiología, Facultad de Ciencias Veterinarias); Javier Cappuccio (Clínica de grandes animales); Mariana Machuca, María Alejandra Quiroga; Dr. Carlos Perfumo (Laboratorio de Patología E
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INTRODUCCIÓN
Lawsonia intracellularis (LI), Brachyspira hyodysenteriae (BH) y Brachyspira pilosicoli (BP) se asocian frecuentemente a la presentación de  diarrea en cerdos de desarrollo y engorde (1). Diversos estudios sugieren que la infección subclínica por LI provoca  pérdidas productivas tales como menor ganancia diaria de peso (GDP) y mayor conversión alimenticia (2), lo que podria ocurrir también con los otros agentes mencionados. El diagnóstico en la presentación subclínica es complejo y requiere la confirmación de laboratorio. La técnica de PCR multiplex es un método rápido, sensible y diferencial que puede ser usado con muestras de materia fecal, siendo apta para la evaluacion de cuadros subclínicos (1).
Los objetivos de este trabajo fueron: 1) detectar la eliminación de LI, BP y BH en animales con y sin  diarrea, en 6 granjas intensivas, mediante la técnica de PCR; 2) relacionar las características de la materia fecal con la detección de agentes.

MATERIALES Y MÉTODOS
Participaron en este estudio 6 granjas de ciclo completo de 400 a 2000 madres. Las muestras de materia fecal (MF) se obtuvieron de cerdos de 8, 11, 14, 17, 20 y 24 semanas de vida (10 animales sin diarrea y 10 con diarrea)  y se recolectaron  en bolsas plásticas. La MF  se caracterizó en grados (G) de acuerdo a la consistencia: G0 normal, G1 semi-sólida sin sangre, G2 acuosa sin sangre, G3 heces sin forma y con sangre, G4 diarrea franca con sangre digerida. Además se registró el contenido de sangre fresca, digerida y moco (5). Se consignó el porcentaje de animales con diarrea identificados en la inspección clínica y se obtuvo información sobre el uso de antibióticos.
Las muestras de MF se procesaron para la extracción del ADN (ZR Fecal DNA MiniPrep, ZymoResearch Corp, Irvine,CA, USA), realizándose posteriormente, la técnica de PCR multiplex (1).

RESULTADOS
En las 6 granjas se detectó LI en MF. En la tabla Nº 1 se muestra la relación entre la consistencia de la MF y el resultado obtenido mediante PCR para dicha bacteria. En la tabla Nº 2 se presentan los resultados de la PCR para LI en animales con y sin diarrea, en cada granja y en las distintas edades de muestreo. Solamente se detectó BH en la granja 6, en 7/11 animales con diarrea, de 11 semanas de vida y con MF grados  1, 2 y 3. Todas las muestras resultaron negativas para BP.
Tabla Nº1: Relación entre la consistencia de la materia fecal (MF) y la detección de Lawsonia intracellularis (LI)
 
Grados de Consistencia MF
 
PCR Li
      0
       1
      2
     3
     4
Total
Neg
355
168
85
     7
     2
617
Pos
40
36
33
     0
11
120
Total
395
204
118
     7
13
737
DISCUSIÓN
En las granjas evaluadas, la MF con grados 1 y 2 fueron frecuentes. Además, casi el 64% de los animales positivos a LI presentaron MF grados 0 y 1. En la presentación crónica y en los cuadros subclínicos de  Enteropatía Proliferativa (EP), la materia fecal suele ser normal o “floja” (4). Hay relación entre la cantidad de bacterias eliminadas y la GDP aun en cerdos sin diarrea, lo que indica el efecto de la infección subclínica por LI (2).
Tabla Nº2: detección de Lawsonia intracellularis (LI) en materia fecal de animales con y son diarrea según edad de muestreo y granja evaluada.
 G
S 8
 
S 11
 
S 14
 
S 17
 
S 20
 
S24
 
% total
 
%cd
%sd
%cd
%sd
%cd
%sd
%cd
%sd
%cd
%sd
%cd
%sd
1
0,0
0,0
0,0
0,0
72,7
25,0
37,5
0,0
0,0
0,0
45,5
10,0
15,9
2
0,0
0,0
0,0
0,0
20,0
0,0
0,0
0,0
60,0
20,0
40,0
0,0
10,7
3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
54,5
36,4
7,7
4
0,0
0,0
0,0
0,0
44,4
18,2
100,0
80,0
40,0
6,7
77,8
63,6
34,7
5
27,3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
33,3
27,3
70,0
20,0
15,0
6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
9,1
10,0
10,0
77,8
30,0
20,0
27,3
14,8
G: granjas. S: semana de muestreo. %cd: porcentaje de animales con diarrea. %sd: porcentaje de animales sin diarrea.
La escasa detección en este estudio de BH y BP coincide con la baja prevalencia de estos agentes en  granjas intensivas en nuestro país, registrada en un trabajo previo (3). Tanto las prácticas de bioseguridad externas como las internas son fundamentales para evitar el ingreso de dichos agentes (4). La granja 6, única con detección positiva de BH, no cumplía con dichas normas, constatándose el ingreso de otras especies animales a los galpones, falta de vacío sanitario y deficiente limpieza y desinfección.
Estudios previos sugieren que la detección de LI en materia fecal ocurre principalmente entre las 13 y las 16 semanas de vida (4). En el presente trabajo, todas las granjas registraron la mayor detección a las 20 y 24 semanas en animales con y sin diarrea, encontrándose, en 3 granjas positivas a LI,  diarrea con sangre digerida (grado 4). El contacto con LI en animales de esta edad puede desencadenar la presentación hemorrágica de la EP con alta mortalidad (4).
Las diferentes tasas de excreción de LI en las  granjas podrían estar asociadas con la eliminación intermitente  de los agentes, el uso de antibióticos, la respuesta inmune del huésped, la microflora intestinal y factores medioambientales de  cada granja (2, 4). La granja 4 tuvo el mayor porcentaje de excreción de LI asociado a un aumento de la mortalidad y a un elevado porcentaje de diarrea grados 2 y 4, con diagnóstico de EP por histopatología. En las demás granjas, si bien no presentaron cuadros clínicos compatibles con EP,  se obtuvieron resultados PCR + en muestras de animales con y sin diarrea. La PCR de materia fecal es una importante herramienta para el monitoreo de enfermedades entéricas en cerdos de desarrollo y engorde, resultando un complemento de la inspección clínica poblacional. En granjas donde no hay brotes de diarrea es útil para detectar los agentes que pueden estar presentes en las diarreas de grados 0 y 1.

BIBLIOGRAFÍA
  1. T. La y col.  2006.Lett. Appl. Microbiol;42, 284–288.
  2. Collins y col. 2014.Vet Microbiol 168; 455-458.
  3. Illanes, N. 2008. IX CNPP. Pag 198
  4. McOrist S et al 2012. Diseases of swine 10th.811-82
  5. Winkelman, N. 1997. Proceedings 28th Annual Meeting AASV. 353-358.

AGRADECIMIENTOS 
Este trabajo fue realizado con fondos del PICT 2010-0961 y la secretaria de ciencia y técnica, UNLP. y recibió una mención al mejor trabajo científico del congreso

 
Autor/es:
DMV, PhD Profesora Asociada. Laboratorio de Patología Especial Veterinaria, Fac. de Ciencias Veterinarias, U.N.L.P.
 
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