Evaluación del comportamiento de la mastitis por efecto del sistema lactoperoxidasa (slpo) activdo. caso cabras.

Publicado el: 17/4/2017
Autor/es: Bracho Espinoza, Chirino Bellmaris. Programa Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda” Coro, Falcón-Venezuela.
Resumen

La lactoperoxidasa (LPO) es una de las principales enzimas proteicas de la leche en todos los mamíferos. Pertenece al grupo de las oxidorreductasas y conjuntamente con los iones de tiocianato y el peróxido de hidrógeno forman el sistema lactoperoxidasa (SPLO). La mastitis es una enfermedad infecciosa que afecta la ubre de la cabra, trayendo como consecuencia entre otras, una reducción en el volumen de producción de leche. En estudios realizados con el SPLO se ha comprobado como un agente bactericida y bacteriostático frente a diferentes grupos de microorganismos patógenos. EL objetivo fue evaluar el proceso inflamatorio de la ubre de cabras frente a la aplicación de infusiones intramamarias con el SLPO activado en leche de cabras. Se usaron cuarenta y un cabras sin patrón racial definido entre tres y seis meses de lactancia provenientes de una  Finca semi-intensiva ubicada en el municipio Colina, estado Falcón. Venezuela.  Se  diagnosticó  mastitis mediante la prueba de California Mastitis Test (CMT) y cultivo bacteriológico. Se  controlaron  factores como: acidez, pH, temperatura en la leche de cabras negativas a mastitis antes y después de la activación. Para determinar la LPO cualitativa se usó el ensayo de Arnold,  para la determinación  cuantitativa de LPO y tiocianato de potasio se usó el método  de Johann  Pütter. En la activación del SLPO se usó muestras de leche de cabras negativas a mastitis. Se aplicó  infusión intramamaria a dieciocho cabras con mitades de ubres positivas a dos y tres cruces al CMT y al cultivo bacteriológico. Los géneros de bacterias encontrados antes del tratamiento fueron Staphylococcus, Bacillus, Enterobacter, Escherichia. Se registró  disminución del proceso inflamatorio de la ubre  en un  54.55 % al aplicar 30 ppp de tiocianato de potasio (SCN) y ninguna respuesta a 15 ppm de SCN, Los resultados se calcularon con el estadístico Wilcoxon (muestras apareadas). En las ubres tratadas con 30 ppm de tiocianato de potasio se observaron diferencias significativas, P=0.04<0.05. Se concluye que SLPO activado con 30 ppm de SCN resulta efectivo contra los patógenos que producen esta enfermedad en cabras.

Palabras clave: Sistema lactoperoxidasa, mastitis, cabras.

INTRODUCCIÓN

El sistema lactoperoxidasa (SLPO) es un mecanismo natural de defensa de la glándula mamaria y es activo en todos los mamíferos incluyendo el hombre. Ha sido demostrado como agente bactericida/bacteriostático frente a microorganismos patógenos Gram positivos y Gram negativos que producen la mastitis.

Las ventajas de la aplicación del SLPO resultan evidentes porque permite una terapia de control de mastitis en cabras secas y en producción, mejora  la calidad de la leche, aumenta  la producción de leche por cabra, contribuye a estabilizar los precios de la leche y además incrementa la calidad de los derivados lácteos.

La mastitis ha sido señalada como una causa del déficit de la producción de leche, ya que es una de las enfermedades más costosas en el ganado lechero, costos que por lo general no son reconocidos, sin embargo son reales y afectan las ganancias netas del productor. Además ésta no sólo provoca disminución del valor nutritivo de la leche, sino que causa importantes efectos en la salud humana como la  transmisión de microorganismos patógenos que pueden provocar enfermedades en el hombre.

Se ha demostrado que el sistema lactoperoxidasa no representa peligro para la salud humana siempre que se use en concentraciones establecidas en las normas internacionales. Por lo tanto, este trabajo de investigación tuvo como fin evaluar el comportamiento del proceso inflamatorio de la ubre de cabras por activación del  sistema lactoperoxidasa

 

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA  

La enzima lactoperoxidasa

La lactoperoxidasa es una de las principales enzimas proteicas de la leche encontrándose en concentraciones medias de 30mg/L, muy superiores a las necesidades biológicas requeridas para una óptima reacción enzimática. (Björck et al., 1975,  Así mismo, pertenece al grupo de las oxidorreductasas, y es responsable de la fase bactericida y bacteriostática durante las primeras horas que se siguen al ordeño (Bracho,  2004).

El Tiocianato:

El tiocianato es un ión ampliamente distribuido en todos los fluidos biológicos de los mamíferos como resultado del metabolismo hepático de los glucósidos y aminoácidos azufrados, reportándose gran variabilidad en la leche, en dependencia de la dieta, factores fisiológicos y raciales (Bracho, 1994).

El tiocianato de sodio es un componente natural de la leche cuya función es la de actuar como inductores de la actividad enzimática y al producir iones de tiocianato reaccionan con componentes específicos de la pared celular de los microorganismos, produciendo una acción bactericida o bacteriostática en dependencias de las características de estos,  Bracho (2004).

El Peróxido de hidrógeno:

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un agente oxidante con efecto bactericida contra E. coli  a concentraciones de 10 – 20 mM. En cambio, sólo se necesitan concentraciones de 0.01 – 0.02 mM para catalizar la oxidación del ión tiocianato, bromuro o ioduro por el sistema lactoperoxidasa (Reiter, 1984). Asimismo este autor cita que la leche no contiene peróxido de hidrógeno, ya que las cantidades del orden de nanomoles generadas por los leucocitos polimorfonucleares y difundidas a la leche son rápidamente inactivadas por acción de la catalasa y peroxidasa.

La adición de concentraciones de tiocianato y peróxido de hidrógeno en proporción con la enzima lactoperoxidasa existente en la leche cruda de cabras, produce un retardo en la acidificación y la inhibición de microorganismos, por lo tanto, mejorando el manejo de leche de cabra a temperatura ambiente (Bracho, 2004).

El Sistema Lactoperoxidasa:

El sistema lactoperoxidasa se encuentra de forma natural en la leche de todos los mamíferos, como parte de los mecanismos intrínsecos para la conservación y protección de las crías así como en otros fluidos biológicos como la sangre, saliva, jugo gástrico, linfa y orina. (Bracho, 2004). En la leche la concentración o volumen de actividad enzimática registra variaciones por lactancia o partos, período de lactancia, en el calostro y por la dieta  (Bracho, 1994).

El sistema Lactoperoxidasa (SLPO) está compuesto por la enzima lactoperoxidasa en concentraciones de 30 g/ mol de leche, tiocianato de 0.02 – 0.025 mg/l y peróxido de hidrógeno 0.4 nM, cuyas fuentes en la leche puede ser por vía enzimática mediante el sistema glucosa/ glucosa oxidasa, por acción microbiana de Lactobacillus en el abomaso y por adicción directa (Mullan et al., 1980). El peróxido de hidrógeno puede ser adicionado en diferentes concentraciones, seleccionando la de mejor efectividad y en cuanto al volumen de actividad enzimática (Bracho, 1994; FAO-OMS, 2005).

Importancia tecnológica:

El efecto antimicrobiano  ha sido ampliamente demostrado y el SLPO se ha comprobado como un agente bactericida/ bacteriostático frente a diferentes grupos de microorganismos como bacterias patógenas y esporulados, virus, micoplasmas, levaduras, hongos, parásitos (Jacob et al., 2000; Ragurtol y Torres 2012; CIEPE-INN-Venezuela 2014). Esto r concuerda con lo reportado  por Marshall et al. (1986), cuyos experimentos mostraron que las secreciones de las glándulas mamarias recogidas 14 días antes y 7 días después del secado, así como tras el parto, inhibían el crecimiento de Streptococcus uberis. Sin embargo, las secreciones recogidas 21 días después del secado no eran inhibitorias frente a este microorganismo. Parece que el sistema lactoperoxidasa juega un papel, en vivo, a la hora de proteger la glándula mamaria lactante de la infección por Streptococcus uberis, volviéndose ineficaz  cuando ésta involuciona. El sistema lactoperoxidasa se ha mostrado efectivo contra Streptococcus agalactiae, patógeno que produce mastitis (Mickelson, 1976; Meneses 2009).

Los microorganismos Gram negativos y catalasa positiva mueren en presencia del sistema lactoperoxidasa, si el peróxido de hidrógeno se suministra química o enzimáticamente. Esta acción bactericida depende del pH del medio, del tiempo de incubación y de la temperatura (Björck et al., 1975).

Se ha establecido que la lactoperoxidasa y los sustratos activadores no representan peligro para la salud humana siempre que se use en concentraciones establecidas en las normas internacionales (Kamau y Pruitt, 1991).

El SLPO es promocionado por la FAO como medio efectivo de extensión de la vida de almacenamiento de la leche cruda en los países en vías de desarrollo, donde razones técnicas, económicas y/o prácticas  no permiten el uso de facilidades de enfriamiento para el mantenimiento de la calidad de la leche cruda. El uso del sistema lactoperoxidasa en áreas en las cuales falta actualmente una adecuada infraestructura para la recolección de leche líquida, aseguraría la producción de leche como un producto alimentario completo y saludable, que de otra manera hubiera sido virtualmente imposible (Zapico, 1993; Bracho, 2004;  FAO y OMS, 2005).

Características de la mastitis:

La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria, caracterizada por cambios físicos y químicos de la leche y por alteraciones patológicas del epitelio glandular. Es el resultado de la interacción  de varios factores tales como: manejo e higiene de los animales durante la ordeña, susceptibilidad, características ambientales y la presencia de microorganismos (Castro et al., 2006; Bedolla et al.,  2012).

Es una enfermedad infecciosa contagiosa causada por agentes bacterianos diversos, virus y hongos que inflaman la ubre y ocasionan hinchazón, calor, dolor y congestión del tejido mamario, además se acompaña de alteración en la cantidad, textura y composición de la leche y apareciendo elementos extraños tales como: sangre y pus que originan cambios en el color y producción de la misma. (Philpot, 1999). Más del 95 % de los cuadros de mastitis clínica y subclínica son causados sólo por un pequeño grupo de bacterias contagiosas, entre ellas Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus disgalactiae y Streptococcus uberis.

Sánchez et al. (1999); Bedolla, (2016);  Jimenez, et al., (2016) mencionan que la falta de adiestramiento de los ordeñadores incide en la presentación de la enfermedad; además citan que el orden del ordeño no se puede realizar como en la vaca, ya que su ejecución presenta dificultades debido a que la mayoría de los animales se encuentran en el mismo lote.

La mastitis es ocasionada por organismos microscópicos que penetran la ubre a través del orificio del pezón. La penetración puede ocurrir por multiplicación, movimiento mecánico, propulsión durante el ordeño o por una combinación de factores (Pinzón, 1989; Pyörälä 2011). Así mismo, ha sido señalada como una causa de la deficiencia de la producción de leche y también una de las más subestimadas. Es una de las enfermedades más costosas en el ganado lechero, por las  pérdidas que por lo general no son reconocidas; sin embargo,  son reales y afectan las ganancias netas del productor (Ávila et al., 1993; Básicos Lecheros 2014).

La mastitis es el problema fundamental de la industria láctea en el mundo, debido a los cambios que provoca en el valor nutritivo de la leche y sus derivados por disminución del contenido en lactosa, caseína, grasa y, además un aumento de elementos no deseables como lipasa, cloruros,  con  la consiguiente afectación en el proceso de elaboración de derivados lácteos, lo que se traduce en mermas en la producción y calidad de la leche y sus derivados Zecconi, (2000); Cruz, (2015) y Peña, (2016).

La mastitis no solo provoca disminución del valor nutritivo de la leche, pues la enfermedad posee importantes efectos en la salud humana, como: transmisión de microorganismos patógenos que pueden provocar enfermedades en el hombre: endocarditis, meningoencefalitis, enteritis y artritis así como los riesgos relacionados con la presencia de antimicrobianos en la leche, que pueden ocasionar reacciones alérgicas y resistencia a las drogas utilizadas. (Calvinho, 1992; Escobar, 2010).

La mastitis es una de las enfermedades de mayor impacto económico para la actividad lechera, especialmente la subclínica, que transcurre desapercibida en la mayoría de los casos, por lo menos un 70 % de las pérdidas económicas  se expresan en mermas en producción de leche y eliminación de la leche procedente de animales enfermos.

La mastitis subclínica es difícil de detectar, dado que la enfermedad transcurre sin provocar una inflamación glandular visible, ni cambios organolépticos de la leche, pero sí afecta su calidad fisicoquímica. Para la confirmación del diagnóstico se requieren análisis de laboratorio y de calidad de la leche que detecten la presencia de microorganismos causantes o el recuento de células somáticas en el fluido lácteo  ( Philpot, 1999).

Método de diagnóstico de la mastitis:

La reacción inflamatoria dentro de la glándula se descubre solamente por medio de pruebas como California Mastitis Test (CMT), la de Wisconsin y los contadores celulares electrónicos, los cuales se emplean a intervalos para determinar los recuentos celulares somáticos de la leche (Merck, 2000).

El CMT es una prueba de campo económica, sencilla y rápida, que detecta con buena sensibilidad y especificidad el estado de salud de la ubre, mediante una estimación  gruesa el contenido de células somáticas. En Venezuela, la prueba ha sido evaluada y ampliamente recomendada como una herramienta útil en los programas de control y vigilancia de mastitis, especialmente cuando se aplica y registra cada mes. Su principal desventaja es subjetividad implicada en la lectura de los resultados (Scaramelli y González, 2005).

El método CMT en leche de cabra, en general de ubres no infectadas rendirán una reacción 0, trazas o una cruz; mientras que la reacción 2 o 3 cruces son representativas de mastitis. Los valores están relacionados ampliamente con el número de células somáticas en la leche tendiendo a incrementarse durante el ordeño y permanecer alto poco tiempo después. Para confiar en esos resultados (CMT cabras) debería ser realizada justo antes del ordeño después del descarte de los dos primeros chorros (Harris, 1993; Escobar 2010).

El uso del CMT en el rebaño entero a intervalos mensuales puede ser muy útil en la detección de mastitis subclínica. Las infecciones por cuartos individuales y totales pueden ser determinadas y con los registros, vigilar la prevalencia. Esta prueba rinde la información que puede ayudar para la determinación de procedimientos o de la función del equipo de ordeño defectuoso, la eficacia del sellado del pezón y de los programas de secado de vacas (Rice, 1999).

Interpretación de la prueba California Mastitis Test (CMT):

Contreras (1992) cita que una vez que se aplica esta prueba, los resultados se pueden interpretar de la siguiente manera:

Negativo: la muestra se conserva líquida, pero sin indicio de formación de precipitado alguno. Rango es de: 0 – 200.000 Leucocitos/m.;   0 – 25% de polimorfonucleares.

Trazas: se forma un leve precipitado. La reacción tiende a desaparecer al movimiento del líquido. Rango es de: 150.000 – 500.000 Leucocitos/m.; 30 – 10% de polimorfonucleares.

+ Débil: se forma en precipitado definido sin tendencia a formación de gel al continuar moviendo la paleta, el precipitado puede desaparecer. Rango es de: 400.00 – 1.500.000 Leucocitos/m.;  40 – 60% de polimorfonucleares.

Claramente ++: la  mezcla se espesa inmediatamente con algún asomo de formación de gel. A medida que se hace girar la mezcla, el gel tiende a desaparecer hacia el centro dejando descubierto el fondo del borde exterior de taza. Cuando cesa el movimiento, la mezcla se nivela y cubre el fondo de la taza. Rango es de: 800.000 – 5.000.000 Leucocitos/m.; 60 – 70% de polimorfonucleares.

Fuertemente +++: se forma un gel que hace que la superficie se ponga convexa. La viscosidad es bastante evidente y la masa se adhiere al fondo de la taza. Rango es más de 5.000.000 Leucocitos/m.

El número de células somáticas en la leche, indicativo de respuesta inflamatoria, se encuentra elevado al igual que el número de bacterias, lo que va acompañado de una disminución del nivel de producción de secreción láctea, así como la alteración de la composición de dicho producto.

Una explotación con un bajo Contaje de Células Somáticas (CCS) es una explotación libre de problemas, ya que en muchas ocasiones la leche procedente de las mastitis clínicas no va a tanque. Por esta razón además del CCS como indicador de los procesos subclínicos, hay que realizar un seguimiento de los procesos clínicos, anotándolos y diagnosticándolos. Por ejemplo, una explotación con un CCS medio de 300.000 leucocitos/m.  Pudiera  tener un grave problema de mastitis gangrenosa por Staphylococcus aureus (Aparicio y Pérez,  2001).

Tratamiento de la mastitis:

El tratamiento químico terapéutico se recomienda usarlo en casos de mastitis clínica sobreaguda, aguda o subaguda, y en los casos recientes o crónicos. El fármaco ideal para el tratamiento de la mastitis subclínica deberá tener un espectro apropiado, alcanzar concentraciones antimicrobianas sin afectar otros sistemas, ser altamente liposoluble y unirse poco a proteínas plasmáticas. La terapia con antibióticos se basa principalmente en el uso de antibióticos β – lactámicos como la penicilina y las cefalosporinas (Castro et al., 2006).

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación geográfica del área de estudio:

Las muestras utilizadas para el estudio fueron tomadas en unidades de producción semi intensiva,  municipio Colina del estado Falcón. Latitud: 11.3987º. Longitud: 69.6147º. Altitud: 30 msnm.

Características Agroecológicas:

El área de estudio está ubicada en la Zona de Vida Bosque muy Seco Tropical, con características que lo ubican en la provincia humedad semiárida, con las siguientes características climáticas: promedios anuales de precipitación entre 500 y 1000 mm, con promedios de precipitación muy altos que exceden a la precipitación. Las lluvias en esta provincia ocurren en forma de fuertes aguaceros que contribuyen a la erosión muy extendida. En  relación a la vegetación de esta zona de vida consiste en un bosque de dos estratos con alturas entre 8 y 18 metros, cuyos representantes están compuestos principalmente por los siguientes géneros: Capparis, Bulnesia  sp (vera), Platymiscioum, Phitecelobium, Tabebuia, y entre árboles se encuentran dispersos Cactáceas columnares y arbustos menores como Jatropha (picapica), Lonchocarpus y acacias (Ewel y Madriz, 1968).

Según COPLANARH (1975), esta unidad de tierras (H-122), corresponde a la planicie del Rio Coro, con relieves planos (entre 0-1%), pertenecientes originalmente a la geomorfología de la planicie de desborde de Río Seco del pleistoceno superior. El uso actual de la tierra es con cultivos hortícola y frutales bajo riego, permaneciendo gran parte de la vegetación natural xerofítica ociosa, se aprovecha para la explotación caprina extensiva y no controlada. Los suelos pertenecen al grupo de Carborthids medios, profundos  de texturas medias, bajo contenido de materia orgánica y moderadamente alcalinos.

Población y muestra:

En esta investigación se evaluó un rebaño de cabras, sin patrón racial definido en producción en una explotación semi-intensiva, ubicada en el municipio Colina del estado Falcón. Se seleccionaron 41cabras; con períodos de lactancia entre 3 y 6 meses, en donde se realiza un ordeño manual/día, alimentándose a pastoreo además de alimento concentrado; en dicha unidad de producción no se aplica ningún tipo de práctica higiénico- sanitario, antes, durante o después del ordeño.

Análisis Estadístico:

Se procedió a la utilización de métodos estadísticos no paramétricos, ya que los datos solo se pueden clasificar en categoría de escala nominal (casos). Estas pruebas no paramétricas son aquellas cuyo modelo no especifica las condiciones de los parámetros de la población de la cual se obtuvo la muestra, es decir es imposible especificar la forma de la distribución poblacional (Bravo, 1992).

Se utilizó el paquete estadístico “INFOSTAB” de Windows, para realizar las pruebas correspondientes con la  Prueba de Wilcoxon (muestras pareadas) a fin  de establecer variación de los signos y síntomas del proceso inflamatorio de la ubre.

 

FASE DE CAMPO:

1. Recolección de muestra:

Se tomaron  muestras de leche para cultivo bacteriológico provenientes cabras que resultaron positivo a dos y tres cruces al CMT al recolectar la leche en el ordeño de  la mañana como lo describe Wolter et al. (2003), efectuándose lavado de los pezones con agua de chorro luego se procedió a la desinfección  con alcohol al 70% y previa eliminación de los primeros chorros de leche. Posteriormente se recolectaron las muestras de leche de cada mitad de la ubre en recipientes para muestras de orina debidamente identificados con el número del animal y la mitad de ubre respectiva   derecha e izquierda. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas inmediatamente al laboratorio.

2. Prueba California de Mastitis (CMT): 

Esta prueba se realizó antes del ordeño de la mañana, en donde se tomaron muestras de leche por pezones  individuales siguiendo el procedimiento señalado por Martínez (2004). Se utilizó una paleta plástica específica para la prueba y el reactivo (alkilaril sulfonato de sodio y un indicador de pH, el púrpura de bromocresol) identificando los medios de la ubre como derecho e izquierdo; descartando los primeros chorros de leche depositando cierta cantidad en la paleta y colocando la misma en posición casi vertical para enrasar dejando aproximadamente 2 cc de leche y luego añadiendo 2cc de reactivo diluido 1:7 en cada compartimiento. Luego se procedió a dar movimientos circulares cortos y realizar la lectura e interpretarla según la Tabla 1 establecida por Wolter et al. (2003).

 

Tabla 1.  Interpretación de la prueba del california mastitis test (CMT)

 

FASE DE LABORATORIO:

El procesamiento de las muestras para cultivo bacteriológico se llevó a cabo en el Laboratorio Clínico Bacteriológico MICBIOLAB, y  la activación del Sistema Lactoperoxidasa (SLPO) se realizó en el Laboratorio de Tecnología de los Alimentos del CITEC- UNEFM.

 

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO:

El procedimiento de siembra  se realizó siguiendo los criterios propuestos por Brown et al. (1969), I.D.F. (1981), Poutrel y Reinard, (1981) en donde se utilizó un asa de platino calibrada, que permitió tomar un volumen aproximado de la muestra de 0,01 ml; el cual se inoculó por agotamiento sobre placas de Petri contentivas de los medios de cultivo agar McConkey, agar Manitol, agar sangre y agar Levine.

Luego fueron sometidos a incubación a 37ºC, en atmósfera de CO2 por un período de 24 a 48 horas, transcurrido el tiempo se procedió a verificar el crecimiento bacteriano  y caracterizando microscópicamente las colonias presentes y proceder a la identificación inicial de los microorganismos  aplicando los siguientes criterios: Características de la colonia. Características morfológicas y tintoriales observadas al examen microscópico mediante frotis coloreados por la técnica de Gram. Prueba de oxidasa. Prueba de catalasa, obtenida al colocar una pequeña porción de colonia frente a una gota de peróxido de hidrógeno al 3% (Brown et al., 1969; I.D.F., 1981). Luego de este procedimiento se efectuaron pruebas bioquímicas con la finalidad de identificar género de microorganismos. Utilizando técnicas descritas (Björck et al., 1975; I.D.F. 1981; Adegoke y Oyo, 1982).

Identificación del Género Staphylococcus: Prueba de coagulasa en tubo

Identificación del Género Enterobacter: Citrato de Simmons, Triple Sugar Iron TSI, motilidad.

Identificación del Género Echerichia: Triple Sugar Iron (TSI)

Identificación del Género Bacillus: morfología, técnica de Gram.

 

PROCESO DE ACTIVACIÓN DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA:

El control de factores se realizó en la leche de cabra negativa a mastitis para luego realizar el proceso de activación del sistema lactoperoxidasa (SLPO):

Determinación de la acidez titulable ( Covenin 658-97)

Determinación de pH: Método Instrumental.

Determinación Cualitativa de lactoperoxidasa: Método de Arnold

  • Se usa una solución de guayacol al 10% en acetona (preparada 2 – 3 días antes de su empleo).
  • Se coloca con una pipeta 10 ml de la muestra preparada en un tubo de ensayo.
  • Se adicionan 2 – 3 gotas de solución de H2O2 al 3%.
  • Se colocan 8 gotas de solución de guayacol al 10 % por las paredes.
  • La formación de una banda color rojizo en la zona de contacto es el indicativo de la presencia de peroxidasa.

Determinación cuantitativa de lactoperoxidasa:

Se usó el método de Pütter (1974), en el cual se utiliza un Buffer fosfato (0,1 m; pH 7) compuesto de fosfato de potasio monobásico (HM2PO4) y dibásico (K2HPO4H2O) además solución de guayacol (20.1 mM) y solución de peróxido de hidrógeno (12.3 mM).

Se introduce en una cubeta 3 ml de Buffer fosfato (0,1 m); 0,05 ml de solución de guayacol (0.3 mM), 0.10 ml de muestra de leche y 0.03 ml de solución de peróxido de hidrógeno (0,1 mM).

Se agita y se deja reaccionar dos (02) minutos a 25 º C (Linden et al., 1982). Se realiza la lectura de la extinción de la solución en el espectrofotómetro a 436 nm de longitud de onda.

Fórmula para la determinación del volumen de actividad de  la LPO:

                        Vol. Actividad = V / ml. x AE x 1000   

                                                        E x d AT x 0,1  

V= Volumen de solución en la celda del espectronic.

AE= Cambio de densidad óptica medido (Absorbancia).

E= Coeficiente de extinción de Guayacol (435nm= 639 Cm2/μmol).

d= distancia de 1 cm. (paso de luz en la cubeta).

AT= Tiempo requerido para la reacción (2 minutos).

0,1= Coeficiente de incremento de extinción.

1000= Conversión a litro.

El resultado se expresa en unidades enzimáticas por ml de leche (U/ml).

Determinación de tiocianato en leche:

  • 10 ml de leche
  • 10 ml de ácido tricloroacético al 20 %
  • La mezcla se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10 minutos.
  • Filtrar el supernadante en papel filtro Whatman No. 2.
  • Un milímetro de filtrado se adiciona a 5 ml de reactivo sorbo (10 gr. de Fe (NO3)3.9H2O disueltos en 200 ml de HNO3 y se lleva a un litro de agua destilada, se deja la mezcla en reposo por 4 minutos y se mide la absorbancia a 460nm.
  • La curva de calibración es hecha con una solución de tiocianato estandarizado.

Activación del sistema lactoperoxidasa (SLPO):

La activación del sistema LPO se hizo en muestras de leche de cabra negativa a mastitis, éstas se tomaron en condiciones asépticas  a fin de aplicar la infusión intramamaria del sistema LPO a las cabras a tratar. Se usaron envases de vidrio estériles para activar el sistema LPO. Se usó 0.06% de H2O2, (Bracho, 2004), 15 y 30 ppm de tiocianato de potasio (I.D.F, 1988), éstas se adicionaron en 150 ml de leche fresca con una acidez de 17 ml NaOH 0.1 N/10 en ml de muestra y con pH de 6,8. Para las dos concentraciones de tiocianato se adicionaron 3 ml de hidróxido de sodio (H2O2), para la de 15 ppm, seadicionó 0.00225 gr. de tiocianato de potasio y para la de 30 ppm se le agregó 0.0045 de tiocianato de potasio.

 

APLICACIÓN DE LA INFUSIÓN INTRAMAMARIA:

Se realizó una sola aplicación de la infusión intramamaria a 36 mitades de ubre después del ordeño de la mañana, pertenecientes a dieciocho animales que resultaron positivos, a la prueba CMT con dos y tres cruces. A los animales con mitades positiva con dos cruces a la prueba CMT se les aplicó una concentración de peróxido de hidrógeno de 0,06% y una de 15 ppm de tiocianato de potasio, y para las mitades de ubre con tres cruces se utilizó una concentración de peróxido de hidrógeno de 0,06% y una de 30 ppm de tiocianato de potasio (Bracho, 2004). Para la aplicación de la infusión se utilizaron  sondas intramamarias estériles número 16 con inyectadoras desechables de 10 ml (dosis única), por cada mitad de ubre diagnosticada con mastitis sub – clínica; luego de aplicada la terapia química se realizó un masaje al pezón  de abajo hacia arriba para distribuir mejor la infusión.

 

EVALUACIÓN POST TRATAMIENTO:

Siete días después de la aplicación de la infusión intramamaria del sistema LPO, se evaluó el grado de inflamación de las ubres a través de la prueba de CMT para verificar la evolución de la enfermedad post tratamiento.

Con el paquete estadístico “INFOSTAB” de Windows, se realizó la  Prueba de Wilcoxon (muestras pareadas) a fin  de establecer variación de los signos y síntomas del proceso inflamatorio de la ubre; interpretándose así: P: <0.05 hay diferencia significativa.   P: >0.05  no hay diferencia significativa

 

RESULTADOS

Después de haber realizado la prueba de CMT a 41 cabras en producción, como lo indica la Tabla 2,  se encontró que tenían los siguientes grados de infección: a 3+ el 40.24%, a 2 + el 32.93, y a 1 + 12.2% y con posible infección (trazas) 4.8%, mientras que las cabras que aparecieron negativas fueron 9.75%.


Tabla  2.  Resultados porcentuales de la prueba California Mastitis Test (CMT) realizado en cabras en producción de leche.


Los resultados del control de factores de las propiedades físico-químicas de la leche cruda de cabra sin activar el sistema lactoperoxidasa (SLPO) (Tabla 4) fueron: pH 6,8Meq/L, Temperatura 20ºC, Densidad 1.032g/L Acidez 17ml Na OH 0.1 N/10, Peroxidasa Cualitativa Positivo, Tocianato 1.023mg/L, Peroxidasa Cuantitativa 2.086µ/L. En la leche activada con el SLPO fueron: pH 6,8Meq/L, Temperatura 20ºC, Densidad 1.032g/L, Acidez 17ml Na OH 0.1 N/10, Peroxidasa Cualitativa Positivo, Tocianato 1.048mg/L, Peroxidasa Cuantitativa 2.086µ/L y en la leche activada con el SLPO en el campo fueron: Acidez 17ml Na OH 0.1 N/10, Peroxidasa Cualitativa Positivo.

 

Tabla 4. Control de factores físicos-químicas de la leche cruda de cabra que guardan relación con el Sistema lactoperoxidasa y su activación.


Al revisar los resultados del análisis bacteriológico (Tabla 5) se encontró que los géneros de bacterias presentes en la muestra de leche por mitad de ubres derecha, son: Bacillus y Staphylococcus, ambas con un porcentaje de infección  de 40%, Escherichia en 20% y Enterobacter 0%.  En las mitades de ubre izquierda se consiguió la presencia del género Enterobacter en un 40%, Staphylococcus,  Bacillus y Escherichia  en un 20% respectivamente. En la ubre con ambas mitades, los resultados para Bacillus y Staphylococcus fueron del  30% y para Escherichia  y Enterobacter del  20% respectivamente.

 

Tabla 5. Resultados del cultivo bacteriológico realizado a un rebaño de cabras en producción de leche positivas a mastitis subclínica mediante la prueba de California Mastitis Test en mitades de la ubre.

 

En la población de cabras no tratadas con el Sistema lactoperoxidasa (Tabla  6) se encontró que para la fecha del 10/09/08 trece mitades de ubre eran positivas a 2+ y once eran positivas a 3+. Mientras que para la fecha 18/09/08 catorce mitades de ubre eran positivas a 2+ y diez eran positivas a 3+.  Cuando se aplicó la prueba de CMT al grupo control de 12 cabras, en fechas consecutivas (Tabla 7) se encontró que 41.7% permanecieron igual a dos cruces, 45.8% igual a tres cruces y el 12.5% subieron el nivel de infección

 

Tabla  7. Porcentaje de cabras no tratadas con Sistema lactoperoxidasa (SLPO). Resultados de la Prueba California Mastitis Test (CMT).

 

En los resultados de la prueba California Mastitis Test después de aplicar infusión intramamaria con el Sistema lactoperoxidasa (SLPO) (Tabla 8), se observa que el tratamiento uno correspondiente a 30 ppm de tiocianato de potasio (SCN), donde se trataron a 22 mitades de ubre, los resultados fue el siguiente 2 bajaron a 0, es decir mejoraron totalmente, 1 bajó a trazas, 1 disminuyó a una cruz, 8 bajaron a dos cruces, 5 siguieron igual a tres cruces y 5 se secaron. El tratamiento dos correspondiente a 15 ppm de tiocianato de potasio (SCN), y donde fueron tratadas 14 mitades de ubre, el 12 permanecieron igual y 2 aumentaron a tres (3) cruces.

El tratamiento uno correspondiente a 30 ppm de tiocianato de potasio (SCN) (Tabla  9), de 22 ubres, fue como sigue 9.09% bajaron a 0 es decir mejoraron totalmente, 4.55% bajaron a trazas y 4.45% a una cruz, 36.36% bajaron a dos cruces, 22.73% siguieron igual a tres cruces y 22.73% se secaron.

 

Tabla 9. Resultados después de la terapia de control con 30 ppm de Tiocinato de Potasio (SCN)

 

El tratamiento dos correspondiente a 15 ppm de tiocianato de potasio (SCN) (Tabla 10), de 14 mitades de ubre,  85,71 % permanecieron igual y 14,29 % aumentaron a tres (3) cruces.


Tabla  10: Resultados  después de la  terapia de control con 15 ppm de Tiocinato de Potasio (SCN)

 

Con la prueba de Wilcoxon (muestras pareadas)  los resultados fueron los siguientes (Tabla 11) en  las mitades de  ubre tratadas con 30 ppm tiocianato de potasio se observaron diferencias significativas, P: 0.04<0.05 entre los individuos con grado de infección 4. En el tratamiento de 15 ppm de tiocianato de potasio  hubo diferencia significativa de <0,0001< 0.05


Tabla  11: Resultados  de la  Prueba de Wilcoxon (muestras pareadas) para la aplicación de la terapia con 15 y 30 ppm de Tiocinato de Potasio (SCN)en cabras positivas a dos y tres cruces de mastitis mediante el California Mastitis Test (CMT).

 

DISCUSIÓN

De las cabras que participaron de este estudio, el 73.17%   resultaron   con  mitades de ubre positivas a dos y tres cruces en  la prueba CMT,  coincidiendo con lo reportado  por Zambrano y Sánchez, (1998), quienes  consiguieron una infección de dos rebaños de cabras en producción de leche, uno con 66.6% y 50.42% de mastitis subclínica detectada a través de la misma prueba. 

Se determinó la presencia de los géneros de bacterias Bacillus (30%), Staphylococcus (30%) Escherichia (20%). y Enterobacter  (20%). Estos resultados fueron comparados con  las bacterias encontradas por Clavijo et al. (2002), en un estudio realizado en dos fincas caprinas del estado Falcón, donde reportaron la presencia de dos especies  Staphylococcus (62% y 10 %), Escherichia  (10,3%), Enterobacter  (6,8%) además de dos especies de Streptococcus  (10,3% y 6.8%),  y Mycoplasma sp. (3,4%).

 A pesar que en el trabajo de Clavijo et al.,  2002,  no establece exactamente el municipio donde se realizó el trabajo, según los datos de clima corresponde a  una región mucho más húmeda (1528 mm de precipitación/año), contra 957 mm del municipio Colina, de donde se  puede inferir que esta diferencia climática condicione la presencia   de microorganismos en el ambiente que puedan infectar las ubres de las cabras en producción.

Se estableció  que el tratamiento con 30 ppm de Tiocianato de Potasio aportó  mejores resultados en la reducción de niveles de infección de las mitades de la ubre  de las cabras con mastitis,  lográndose  una disminución del proceso inflamatorio  en las cabras  tratadas en un  54.55%; a  pesar de ser esta terapia química una prueba piloto en control de mastitis subclínica en cabras.

Al realizar la prueba aplicando el estadístico de  Wilcoxon (muestras pareadas), en las mitades de ubre tratadas con 30 ppm tiocianato de potasio,  se observaron diferencias significativas P = 0.04<0.05 entre las cabras  con diagnóstico de mastitis subclínica  grado de infección 4. Con el tratamiento de 15 ppm de tiocianato de potasio  hubo diferencia significativa de <0,0001< 0.05 entre las cabras y algunas  agravaron su condición al pasar de grado 3 a grado 4.

La terapia con antibióticos se basa principalmente en el uso de antibióticos β – lactámicos como la penicilina y las cefalosporinas, tal como lo señaló Castro et al., (2006), En este trabajo de investigación se pone en evidencia  una alternativa importante utilizando el sistema lactoperoxidasa activado para el control mastitis sub-clínica, disminuyendo el uso de antibióticos y la oportunidad de disminuir las trazas de los antibióticos en la leche, que constituye un problema de salud pública al ocasionar problemas de resistencia a la antibióticoterapia en humanos.


CONCLUSIONES

En el diagnóstico del proceso inflamatorio de la ubre mediante el método indirecto California Mastitis Test (CMT), realizado a  cuarenta y un (41) animales  resultaron positivos a dos y tres cruces sesenta mitades de ubre (73. 17%), a una cruz  diez mitades (12.2%), trazas cuatro mitades  (4.88%) y negativo ocho mitades (9.75%).

Los microorganismos encontrados en el análisis bacteriológico previo al tratamiento del Sistema Lactoperoxidasa activado fueron los géneros  Staphylococcus, Bacillus, Enterobacter y Escherichia.

Luego de la aplicación de la infusión intramamaria con el SLPO activado, en  dieciocho (18) cabras, se realizó  la prueba de CMT, observándose  que el tratamiento que resultó efectivo fue el de 30 ppm de Tiocianato de Potasio, ya que hubo una disminución del proceso inflamatorio de la ubre en el 54. 55% de las mitades de ubre;  15 ppm de tiocianato de potasio no hubo mejora en los individuos tratados.

 Al realizar la prueba estadística Wilcoxon (muestras pareadas) en las mitades de ubre tratadas con 30 ppm tiocianato de potasio se observaron diferencias significativas, p: 0.04<0.05 entre En el tratamiento de 15 ppm de tiocianato de potasio  hubo diferencia significativa de <0,0001< 0.05

El Sistema lactoperoxidasa es efectivo en el control de mastitis subclínica en cabras en concentraciones adecuadas.


RECOMENDACIONES

  1. Realizar los ensayos con mayor número de repeticiones, otras concentraciones de Tiocianato de potasio, para establecer el efecto sobre esta enfermedad en los animales tratados.
  2. Realizar análisis bacteriológicos post tratamiento para identificar con exactitud los géneros de  microorganismos, sobre los que el SLPO ejercen la acción bactericida  y/o bacteriostática.
  3. Seleccionar rebaños de cabras  con manejos semi-intensivo e intensivo en período de secado,  para establecer  diferencias en cuanto a los resultados, después de aplicada la terapia de control con el  SLPO activado.
  4. Implementar programas de educación sanitaria y de control de mastitis, en donde se involucre al ganadero y a los ordeñadores,  que incluya, limpieza de los corrales, mejora de la rutina de ordeño, higiene de pezones, eliminación de animales crónicos, modificación del orden de ordeño, y tratamiento de secado.
  5. Realizar estudios más exhaustivos para determinar el contaje de células somáticas presentes en la leche de cabras y con el aporte de estos estudios ayudar a clarificar las diferentes opiniones que tienen los investigadores en el contaje real de estas células en la leche de cabras.


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Autor/es
Docente Investigador. Programa Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional Experimental "Francisco de Miranda. Coro- Falcón- Venezuela.
 
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