Utilización de flavonoides de residuos de la industria citrícola para la prevención de la contaminación por micotoxinas en maíz
El estudio de productos naturales para inhibir el crecimiento de hongos y/o la acumulación de micotoxinas en el almacenamiento de maíz se centra en el uso de flavonoides que pueden ser aislados con bajo costo a partir de residuos de la industria citrícola. Estudios previos realizados a escala laboratorio con naringina, neohesperidina y hesperidina, muestran que es posible utilizar dichas flavanonas para reducir la acumulación de micotoxinas. Continuando con esta línea de trabajo se incorpora el estudio del efecto de un flavonol, quercetina, debido a su promisorio efecto antifúngico y antimicotóxico. Se formulan mezclas en diversas concentraciones entre las sustancias mencionadas aplicando el diseño estadístico de Box-Behnken con superficies de respuesta y optimización de múltiples respuestas mediante la función deseabilidad, con foco en la reducción de micotoxinas típicas en el maíz. Se evaluaron modelos para minimizar fumonisinas, producidas por Fusarium verticillioides y aflatoxinas producidas por Aspergillus flavus y A. parasiticus. Los mismos se probaron a dos actividades de agua, aw 0,95 y 0,98, dando una mezcla óptima para cada una de las condiciones, las cuales inhibieron la acumulación de micotoxinas en maíz entre un 50 y 100% según el caso. El mecanismo de acción de los flavonoides y sus mezclas fue evaluado en la ultraestructura mediante microscopía electrónica de transmisión, evidenciando el daño en las membranas y organelas celulares fúngicas producido por estos compuestos. Estos tratamientos presentarían distintos beneficios: además de minimizar la presencia de micotoxinas en maíz y sus productos de alto consumo, tendría un impacto sobre el ambiente al disminuir los residuos generados por las industrias citrícolas, agregándoles valor, y mejoraría la aceptación por parte de los consumidores, los cuales ven la eliminación de aditivos sintéticos y su reemplazo por aditivos naturales como un avance tanto desde el punto de vista de la calidad como de la inocuidad de un alimento.
Palabras clave: Flavonoides, aflatoxinas, fumonisinas, maíz, poscosecha.
ABSTRACT
The study of natural products in order to inhibit mycotoxigenic fungi growth and/or mycotoxin accumulation during maize storage is focused on the use of flavonoids, which can be obtained at low cost from residues of citrus industries. Studies carried out at laboratory scale using naringin, hesperidin and neohesperidin show that it is possible to use these flavanones to reduce mycotoxin accumulation. Continuing with this line of work, the study of the effect of a flavonol, quercetin, is incorporated due to its promising antifungal and antimycotoxin effect. The use of these compounds will be investigated preparing different mixtures following a Box-Behnken statistical design with response surface methodology and optimization of multiple responses through the desirability function, with focus on the reduction of typical mycotoxins in corn. The models were evaluated in order to minimize fumonisins, produced by Fusarium verticillioides and aflatoxins produced by Aspergillus flavus and A. parasiticus in maize, which were tested at two water activities, 0.95 and 0.98 aw, giving an optimal mix for each of the conditions, reducing mycotoxin accumulation between 50 and 100%. The mechanism of action of the flavonoids and their mixtures was evaluated in the ultrastructure by transmission electron microscopy, evidencing the damage in the membrane and fungal cell organelles produced by these compounds. These possible treatments could present several benefits, besides minimizing mycotoxin presence in maize and highly consumed maize products, such as decreasing the environmental impact generated by the residues of citric industries, and would improve consumer acceptance, who consider the elimination of synthetic additives and its replacement with natural additives an asset in the terms of food quality and safety.
Keywords: Flavonoids, aflatoxins, fumonisins, maize, postharvest.
Actualmente alrededor de un tercio de los alimentos producidos a nivel mundial se pierden o se desperdician por esta problemática. En cuanto a las materias primas agrícolas, estas sufren 40% de merma debido a problemas relacionados con la infraestructura para el manejo de las mismas, a lo que se le suman los remanentes y subproductos luego de que esa materia prima es procesada.
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) incluyó dos puntos relacionadas a estas problemáticas entre sus Objetivos para el Desarrollo Sostenible (ODS): el ODS 2, llamado Hambre Cero, el cual contempla proveer a la humanidad de suficientes alimentos con calidad e inocuidad para lograr la seguridad alimentaria, y el ODS 12 que incluye garantizar modalidades de consumo y producción sostenibles, mediante las cuales los productores logren cultivar alimentos reduciendo el impacto ambiental negativo como la pérdida de suelo, agua o nutrientes contenidos en los alimentos desperdiciados o descartados (FAO, 2011).
Es por estos motivos que la reducción de los desperdicios y la preservación de alimentos son dos desafíos clave para las generaciones siguientes y en ellos se enfoca el trabajo de esta tesis titulada " Utilización de flavonoides de residuos de la industria citrícola para la prevención de la contaminación por micotoxinas en maíz" que forma párte de la tesis presentada por Paula Sol Pok para obtener el título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial
Encontrar compuestos naturales que puedan inhibir el crecimiento de hongos toxicogénicos y/o la acumulación de micotoxinas, con el fin de reemplazar el uso de fungicidas sintéticos comúnmente usados durante el almacenamiento de materias primas. Para esto la investigación se abocará a estudiar el efecto de ciertos flavonoides, que pueden ser obtenidos a partir de residuos de la industria citrícola, en la acumulación de micotoxinas y la posible capacidad de los mismos para inhibir el crecimiento fúngico en maíz. La utilización de los descartes de la industria procesadora podría mejorar la ecuación económica de la cadena citrícola argentina al avanzar en el diseño de productos innovadores y presentaría un beneficio extra ya que se podría disminuir el impacto al ambiente de los desperdicios generados por dichas industrias.
Objetivos Específicos
- - Determinación de la capacidad toxicogénica de cepas posibles productoras de micotoxinas.
- - Identificación morfológica y molecular de las especies fúngicas micotoxigénicas.
- - Evaluación del crecimiento de las cepas seleccionadas en medio de cultivo conteniendo flavonoides.
- - Determinación experimental de la concentración óptima entre las flavanonas naringina y neohesperidina y el flavonol quercetina necesaria para minimizar la acumulación de micotoxinas producidas por especies de Fusarium y Aspergillus en maíz, en condiciones que podrían ser alcanzadas durante su almacenamiento, mediante un modelo estadístico para optimizar su aplicación.
- - Evaluación del efecto de la actividad de agua en la acción de dichos flavonoides.
- - Verificación de la existencia de una combinación de flavonoides que sea eficaz en la inhibición de la acumulación de varias micotoxinas simultáneamente.
- - Evaluación del efecto de los tratamientos con flavonoides en la ultraestructura celular de los mohos mencionados, con el fin de aportar conocimiento sobre su mecanismo de acción.
CONCLUSIONES
Se logró seleccionar cepas micotoxigénicas capaces de contaminar el maíz y acumular distintas micotoxinas, de las especies Fusarium verticillioides, F. graminearum, F. poae, Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. carbonarius. Se confirmó la identificación morfológica por técnicas moleculares.
El tratamiento con la concentración máxima de los flavonoides en medio PDA no afectó el crecimiento radial y, en algunos casos, éste se incrementó más rápidamente que los controles, pudiéndo deberse a un crecimiento menos compacto del micelio, siendo pertinente la evaluación del crecimiento fúngico por una metodología diferente a la medición del crecimiento radial.
Se contribuyó al conocimiento del comportamiento de A. flavus, A. parasiticus y F. verticillioides ante el tratamiento con las flavanonas NAR y NEO y el flavonol QUER mediante la aplicación de la metodología de superficies de respuesta utilizando el diseño de Box
Behnken, a fin de encontrar rangos de concentración de mezclas en los que su aplicación fuera la más efectiva para disminuir la acumulación de micotoxinas (aflatoxinas y fumonisinas).
El diseño de Box-Behnken con optimización de múltiples respuestas permitió el cálculo de distintas mezclas óptimas de flavonoides, basado en pocos puntos experimentales.
El modelo propuesto demostró ser significativo en términos estadísticos y permitió una reducción de entre el 50 y el 100% de la acumulación de micotoxinas en maíz, con la aplicación de las mezclas seleccionadas para las distintas condiciones de aw estudiadas (aw
0,95 y 0,98).
En el caso de A. parasiticus a aw 0,95 la optimización de múltiples respuestas dada por el enfoque de deseabilidad en las condiciones de aw 0,95 permitió encontrar una mezcla eficiente en la reducción de AFB1 y AFG1, compuesta por NAR 0,39 mM, NEO 0,24 mM y QUER 0,4 mM, que inhibió su acumulación en proporciones mayores al 85%, logrando además la reducción total de AFB2 y AFG2.
Por otro lado, la mezcla óptima propuesta para A. parasiticus a aw 0,98 predijo una acumulación de AFs superior al límite máximo establecido por las regulaciones nacionales, aunque si se comparan con los valores de contaminación del control sin tratamiento correspondientes al modelo, se observa que representarían disminuciones de más del 95% para AFB1, AFG1 y AFG2. Dada que dicha mezcla (NAR 0,4 mM, NEO 0,4 mM y QUER 0,4 mM) estaba constituida por los valores máximos de concentración de cada flavonoide; sería de interés la necesidad de estudiar mayores concentraciones de los mismos.
Al evaluar los resultados obtenidos para las dos condiciones de aw se observa que la mezcla propuesta para aw 0,98 también mostraría resultados promisorios a aw 0,95, como puede verse en las superficies de respuesta correspondientes.
En el caso de los diseños aplicados para A. flavus a aw 0,95, la optimización de las respuestas AFB1 y AFB2 dada por el enfoque de deseabilidad permitió encontrar una mezcla para A. flavus en maíz a aw 0,95 que fue efectiva, lográndose una inhibición del 84% para AFB1 y del 94% para AFB2, con concentraciones obtenidas luego de los tratamientos comparables a las predicciones teóricas.
Las mezclas óptimas propuestas para A. flavus a aw 0,98 predicen reducciones de AFs mayores al 85% si se compara con los valores de contaminación de AFs del control sin tratamiento utilizado para el modelo. En este caso es notable que la adición de concentraciones mayores de QUER (con una concentración máxima de 0,6 mM) no mejoró la predicción de la disminución de las mismas respecto al uso de 0,4 mM.
En el caso de A. flavus, el análisis y comparación de los resultados obtenidos no permitió encontrar una mezcla útil de flavonoides que pudiera ser efectiva al aplicarse a ambas aw ensayadas. Por lo tanto se propone continuar con el ensayo de las mezclas óptimas para A. flavus obtenidas a aw 0,98 (NAR 0 mM, NEO 0,4 mM y QUER 0,6 mM y NAR 0,4 mM, NEO 0,1 mM y QUER 0,2 mM) a fin de evaluar su eficacia a esta condición de aw.
En el caso de F. verticillioides a aw 0,95, la optimización de múltiples respuestas dada por el enfoque de deseabilidad en las condiciones de aw 0,95 permitió encontrar de manera gráfica una mezcla eficiente en la reducción de FB1 y FB2, compuesta por NAR 0,4 mM, NEO 0,16 mM y QUER 0,37 mM, que inhibió su acumulación en proporciones mayores al 52%. También se obtuvieron otras mezclas, mediante distintos criterios de optimización, que no lograron reducir tan significativamente la acumulación de estas fumonisinas, posiblemente porque en la optimización no fue utilizada FB3.
Por otro lado, la mezclas óptimas obtenidas con distintos criterios para F. verticillioides a aw 0,98 resultaron en una inhibición de más del 80% de FB1, FB2 y FB3, sin diferencias significativas entre las mismas. Es por esto que se selecciona la mezcla dada por NAR 0,4 mM, NEO 0,16 mM y QUER 0,37 mM que fue obtenida gráficamente y que es la que mejores resultados presentó a aw 0,95. Es decir que para el caso de F. verticillioides se llegó a la obtención de una mezcla eficaz en la reducción de la acumulación de fumonisinas en maíz con dos aw distintas, 0,95 y 0,98.
Los flavonoides afectaron distintos blancos en la ultraestructura de A. parasiticus, A. flavus y F. verticillioides. Los mismos fueron función del tratamiento aplicado y del moho seleccionado. En general se indujeron modificaciones en: a) la pared celular, que en algunos casos se volvió más dúctil y/o mostró episodios de ruptura, permitiendo la pérdida de contenido citoplasmático, b) la membrana celular y el sistema de endomembranas, que se mostraron degradados y/o fragmentados conduciendo a la formación de vesículas, y c) distintas organelas que se alteraron por la desaparición de sus membranas, entre otros. También se observó que los distintos impactos en la estructura fueron anacrónicos, indicando la heterogeneidad de la población.
Para un mejor conocimiento de la relación estructura-producción de micotoxinas debiera analizarse su acumulación en los mismos medios de cultivo utilizados para el desarrollo de los mohos destinados a los estudios de microscoía eletrónica de transmisión.
Estos resultados sugieren que NAR, NEO y QUER pueden disminuir efectivamente la producción de micotoxinas por distintos mecanismos. La utilización de mezclas de flavonoides como aditivo inhibidor de micotoxinas puede proporcionar un método amigable con el medio ambiente, ya que estos compuestos se pueden extraer de los desechos de las industrias de cítricos, como una estrategia alternativa para reemplazar los fungicidas químicos para el maíz almacenado agregando valor a estos residuos, y demostrando su potencial para ser aplicado en la industria alimentaria.
Se requieren futuros estudios de almacenamiento para conocer la degradación de los flavonoides en la matriz alimentaria y la posible respuesta de adaptación de los mohos estudiados.
