Introducción
El Staphylococcus aureus es causa común de infecciones superficiales y profundas en vacas lecheras y humanos(4,15,21). En vacas lecheras, es una de las bacterias que con mayor frecuencia causa mastitis, lo que la convierte en potencial contaminante para el ser humano si no se siguen las medidas sanitarias en el ordeño, manipulación y esterilización de la leche (11). Aunque hay 137 especies de microorganismos causantes de mastitis, el S. aureus es uno de los patógenos más frecuentes, no solo en vacas, sino en ovejas, cabras y cerdos (1,8,16). Además, la mastitis provoca grandes pérdidas económicas a los productores de leche a nivel mundial (20). En Brasil de 165 cepas aisladas de Staphylococcus sp., 48,1% fueron identificadas como S. aureus (17). Por el contrario, se han encontrado bajas prevalencias de S. aureus en vacas lecheras en Etiopía, 16,2% (1) y también en Colombia, donde se evaluaron 484 cuartos pertenecientes a 121 vacas, utilizando la prueba de mastitis de California (CMT) y se encontró que el 5,8% de los cuartos fueron positivos para S. aureus (19). Mientras otro estudio en Colombia en 2008 en donde se analizaron 2854 vacas, encontrándose una prevalencia de 29,1% de mastitis por S. aureus, constituyéndose en el principal agente etiológico (2). Dada la situación actual, ante la necesidad de mejorar la calidad de la leche y sus productos, se propuso como meta estimar mejor la prevalencia utilizando el método Bayesiano del aislado de S. aureus a partir de muestras de leche de vacas en el Valle del Cauca.
Materiales y métodos
Aval ético
Esta investigación fue aprobada por el comité de ética en investigación de la Universidad Libre - Cali, Colombia (Acto número 3, junio de 2015). los sujetos de estudio son animales y la única intervención es la recolección de la muestra de leche que se realiza durante el proceso normal de ordeño, sin que implique ningún tipo de daño al animal. Las explotaciones lecheras consideradas para la muestra trabajan en programas de mejora de la calidad de la leche, la mayoría de ellas pequeños productores con menos de 50 vacas. Se invitó a los productores a participar de manera voluntaria y se llenó una autorización con la empresa recolectora de leche, informando al administrador o propietario o representante legal de la asociación de productores de manera clara sobre los riesgos, beneficios del tipo de trámite y sobre el alcance de los resultados. La información y los resultados obtenidos fueron manejados con confidencialidad en los hatos lecheros donde se llevó a cabo la investigación y son de gran ayuda para la empresa recolectora de leche y a los productores lecheros para aplicar correctivos.
Tipo de estudio
Se realizó un estudio observacional, transversal y descriptivo. Se tomaron 1070 muestras de leche de vacas especializadas en la producción de leche. Se contó con una población de 2.584 vacas lecheras, perteneciente a 43 hatos lecheros, de las cuales se obtuvo una muestra de 273 vacas, perteneciente a 17 hatos lecheros. Se seleccionaron, utilizando un método de muestreo aleatorio estratificado que asumió la vaca como unidad muestral. Para estimar el tamaño de la muestra se tomó como referencia una prevalencia de 28,48%; este valor fue la prevalencia de varios estudios realizados previamente en Colombia (2,13,18). El tamaño de la muestra se calculó asumiendo una proporción (prevalencia) como parámetro a estimar, junto con su intervalo de confianza al 95% y un error de estimación del 5%. Las regiones (conglomerados) estaban formadas por agrupaciones de explotaciones lecheras en regiones geográficas establecidas dividiendo la provincia según los puntos cardinales. Los hatos se estratificaron en dos grupos según el número de animales que tenían, en cada región tenían tanto hatos lecheros pequeños (estrato uno), como hatos grandes (estrato dos). La muestra final de animales estuvo conformada por 273 vacas, así: 130 vacas que pertenecían a los hatos lecheros del estrato uno y 143 vacas pertenecientes a los hatos lecheros del estrato dos. Los hatos de la muestra se seleccionaron mediante números aleatorios en la hoja de cálculo Excel 2010.
Localización del estudio
La investigación tuvo como objetivo hatos lecheros afiliados a una empresa recolectora de leche de toda la provincia del Valle del Cauca, ubicada en un Valle interandino en el suroeste de Colombia, cuyas coordenadas son 3° 25´ 00 N y 76°31´00 O.
Variables
La recolección de datos en campo se realizó antes, durante y después del ordeño. La información sobre las variables raza, edad, etapa de lactancia, número de partos, producción de leche por día, tamaño de la lechería y recuento de células somáticas en tanque de carga se tomó de los registros de la lechería. Aspectos como el sistema de ordeño, la higiene del ordeño, la desinfección de los pezones antes del ordeño, la desinfección de los pezones después del ordeño y el uso de ropa adecuada se evaluaron directamente mediante inspección visual en el lugar.
Toma de muestras de leche
Se recolectaron muestras de todos los cuartos mamarios de 273 vacas lecheras. Para la recolección y transporte de las muestras de leche se utilizaron tubos estériles de un solo uso de 15 ml, con 8 ml de medio triptona (Becton, Dickinson and Company, Le Pont de Claix, Francia), como medio de transporte y conservación de la muestra. Cada tubo estaba debidamente etiquetado con el nombre o número de la vaca, la fecha y el nombre del hato. Las muestras se recolectaron siguiendo las instrucciones del laboratorio Handbook of bovine mastitis del U.S. National Mastitis Council (12). Posteriormente, se realizó la Prueba de Mastitis de California (CMT) (Novalfarm Ltda., Bogotá. D.C., Colombia), como prueba indirecta para la detección de mastitis. Una vez obtenidas las muestras de leche, se refrigeraron a 4ºC en una hielera de poliestireno, sellándola con cinta adhesiva y transportándola al Laboratorio de la Universidad Libre en un tiempo no mayor a 24 horas para su cultivo.
Cultivo de Staphylococcus aureus
Se homogeneizaron las muestras de leche y se esparció un volumen de 200 microlitros en la placa de Petri estéril en todas las direcciones en Chapman (agar sal manitol) (Becton, Dickinson and Company, Loveton circle, Spaks, MD, EE. UU.), un medio selectivo para S. aureus. La incubación se realizó a 37 °C en condiciones aeróbicas, con 5% de CO2, durante 24 a 48 horas en una incubadora REVCO, de acuerdo con las instrucciones del Manual de laboratorio de mastitis bovina del Consejo Nacional de Mastitis de EE.UU., 2005. Para las muestras, con resultado positivo para el género Staphylococcus, se identificó el género y la especie aureus mediante tinción de Gram y prueba de coagulasa en tubo. La cepa de control S. aureus ACT25923 se utilizó como control de calidad en el cultivo.
Análisis de los datos
Se estimó la prevalencia de infección para cada región, hato lechero y vaca. Dado que los tamaños de muestra se reducen bastante al pasar por los diferentes estratos, se decidió utilizar procedimientos de inferencia bayesiana para obtener estimaciones estables. Los métodos bayesianos son muy útiles para estimar los parámetros desconocidos cuando los tamaños de muestra son pequeños o no es posible garantizar la absoluta aleatoriedad de la muestra. Este paradigma utiliza como supuesto teórico de intercambiabilidad en las observaciones, que es más flexible que el supuesto independiente e idénticamente distribuido utilizado por el paradigma clásico de la estadística. Se asumió como caso de infección el animal que tenía al menos una de las muestras de leche positivas para S. aureus (se tomó una muestra por pezón). En todos los casos se asumió como parámetro de interés la proporción de casos infectados, y como distribución de probabilidad previa una distribución Uniforme (0,1), lo que indica que antes de obtener los datos en campo se esperaba que todos los valores de prevalencia tuvieran la misma probabilidad de ser observados. Además de la estimación puntual, se calculó una región de credibilidad del 95% (3,9) .
Resultados
Características de los Hatos lecheros
La mayoría de los hatos lecheros incluidos en la muestra (52,94%) están ubicados en la región central de la provincia del Valle del Cauca (Figura 1).
Figura 1. Ubicación de los hatos seleccionados para la encuesta de Staphylococcus aureus.
La mayoría de las vacas eran de la raza Holstein + Gyr en los hatos grandes y mestizas en los hatos pequeños. La mediana de edad fue (seis años) en ambos estratos y el número de nacimientos es aceptable, según las características de producción en Colombia. La mayoría de las vacas incluidas en la muestra se encontraban en el primer y segundo trimestre de lactancia. Después de la desinfección de los pezones antes del ordeño en todas las vacas, se realizó el secado con el periódico en el 96,3% y con papel bond en el 3,7%, materiales que vuelven a contaminar el pezón. Se observó que la mayoría de los pezones están sanos. Al realizar el análisis de todas las muestras de leche en el 64,6% de los casos, la Prueba de Mastitis de California (CMT) arrojó resultado positivo para la presencia de mastitis subclínica. De las 1.070 muestras de leche obtenidas de 273 vacas lecheras, 87 de ellas (31,9% de los casos) se presentó la infección por S. aureus.
Prevalencia de infección por Staphylococcus aureus
Las estimaciones de prevalencia para la provincia, en general, y para las regiones (en la misma zona), se obtuvieron asumiendo una distribución previa menos informativa (principio de La Place), es decir, el modelo estadístico desarrollado para aproximar los valores de prevalencia de infección a partir del supuesto de que todas las estimaciones de prevalencia posibles para la provincia y sus regiones tienen la misma probabilidad de ocurrir (Tabla 1).
Tabla 1. Prevalencia de infección por Staphylococcus aureus por vaca obtenida mediante métodos de estimación bayesianos.
Al comparar las estimaciones de prevalencia por regiones, se observó que entre las regiones centro y norte, la diferencia no es estadísticamente significativa; mientras que la región sur tiene una prevalencia de infección que tiende a ser menor que la observada en las otras dos regiones; esta diferencia fue estadísticamente significativa (factor de Bayes igual a 2,87).
La prevalencia estimada para los hatos lecheros clasificados como grandes fue de 0,179 IC del 95% (0,157-0,246); mientras que para los hatos lecheros clasificados como pequeños, la estimación fue de 0,478 IC del 95% (0,448-0,563). Estos resultados sugieren que la prevalencia de S. aureus en las vacas lecheras es significativamente mayor en los hatos lecheros pequeños, en comparación con los hatos lecheros grandes (Tabla 2).
Tabla 2. Prevalencia bayesiana de infección por S. aureus de vacas lecheras según tamaño y ubicación de la explotación lechera.
Estimación de las proporciones de infección por S. aureus considerando el cuarto mamario muestreado.
Se estimó la proporción de cuarto mamario infectado para la provincia, región y hato lechero. Entre las 1070 muestras de leche que se estudiaron, 168 tuvieron un cultivo positivo para infección por S. aureus, lo que representa una proporción de 0,157, IC 95% (0,151-0,181) de los cuartos mamarios. En los hatos lecheros clasificados como pequeños, se observaron 501 cuartos mamarios, de los cuales 118 estaban infectados por S. aureus, por lo que la proporción estimada de cuartos mamarios infectados fue 0,24, IC 95% (0,226-0,278) (Tabla 3).
Al evaluar la distribución de cultivos con resultado positivo por la ubicación del cuarto mamario en la ubre de la vaca, 39 (23,2%) cuartos mamarios infectados fueron los anteriores izquierdos; 43 (25,6%) los cuartos mamarios anteriores derechos; 42 (25%) infecciones se habían presentado en los cuartos mamarios posteriores izquierdos; y 44 (26,2%) eran vacas que tenían sus glándulas posteriores derechas infectadas por S. aureus (Tabla 3).
Tabla 3. Estimación de la proporción de cuartos mamarios afectados por región.
Discusión
La prevalencia de infección en vacas lecheras por S. aureus fue de 31,9%, superior a la informada en Finlandia 21% (23); y mucho más alto que lo reportado en el noreste de África, 16,2% y 13,7% en Jordania (1,6). La diferencia del presente trabajo con el informe de los anteriores autores es que tomaron muestras de leche solo de las vacas que dieron positivo a la prueba tamiz cualitativa de CMT y vacas con mastitis clínica, dejando muchas vacas con mastitis subclínica sin cultivos bacterianos, por lo que podrían resultar en falsos negativos. Además, en Finlandia el mayor patógeno causante de mastitis es el Staphylococcus coagulasa negativo con 43%, seguido del S. aureus y Streptococcus uberis, contrario a lo reportado en estudios en Colombia (2,7); Finlandia tiene un programa nacional de vigilancia de la calidad de leche que incluyen registros de todos los hatos y las vacas del país en cuanto a producción de leche, grasa, proteína y recuento de células somáticas en leche. Por otro lado, la investigación realizada en la región de Etiopia en África ha reportado baja prevalencia del patógeno S. aureus, en concordancia con otras investigaciones en la misma región y en la investigación realizada en Jordania solo se tuvo en cuenta para aislar el patógeno vacas con mastitis clínica y vacas que eran llevadas al sacrificio. Mientras que la prevalencia encontrada fue menor a la reportada en México, 58,8%, donde las vacas presentaban mastitis clínica al momento de recolección de las muestras (14) ; también, prácticas deficientes de higiene en el ordeño como la falta de sellado de los pezones, mala higiene en los pisos, no separar al momento del ordeño los animales sanos de los enfermos de mastitis; y en Arauca (Colombia), la prevalencia tan alta 43,72%, debido a que las vacas eran encerradas desde la noche anterior en corrales, lo que facilita la transmisión del patógeno por el estrecho contacto entre los animales, también inadecuada limpieza de utensilios de ordeño, así como inadecuada limpieza en las manos (7) .
Es bien sabido que la bacteria, después de instalada en un hato lechero, es bastante persistente y difícil de erradicar; y en muchos casos, es el principal microorganismo causante de mastitis (10). A pesar de ser hatos lecheros especializados, no se cumplen los protocolos de ordeño al 100% , es así que en algunos hatos faltan prácticas de higiene complementarias, como el uso de guantes y mascarillas, la desinfección de las ubres antes y después del ordeño, el secado de las ubres, las ubres con toallas desechables, contaminación por estiércol en la sala de ordeño de algunos hatos lecheros y esto genera alta prevalencia de patógenos ambientales y contagiosos como es el caso del S. aureus.
Los hatos lecheros de la región Sur presentan la menor prevalencia por vaca, 24%; en comparación con la región Norte y Central, con 33 y 34%, respectivamente. Esta baja prevalencia en la región Sur coincide con el bajo recuento celular de estos hatos lecheros, además de contar con instalaciones adecuadas como lo son zonas sucias con piso en cemento antiresbaladizo donde las vacas permanecen 2 horas antes de cada ordeño y son bañadas del barro y la suciedad, estas zonas son cubiertas con polisombra para evitar estrés por calor en el caso que permanezcan mucho tiempo en el corral, luego las vacas pasan al área limpia o zona de ordeño con un pasillo central y cubículos laterales para el ordeño, donde los operarios correctamente vestidos con peto, guantes y botas les realizan las prácticas de despunte, presellado, limpieza , colocación de pezoneras, ordeño y posterior sellado, para evitar la contaminación y después del ordeño las vacas salen a potrero o a un corral con comida. También se puede observar que la prevalencia de S. aureus en vacas lecheras es significativamente mayor en los hatos pequeños que en los hatos grandes, con porcentajes del 48% y 18%, respectivamente; los hatos pequeños en el presente estudio contaban con buen protocolo de ordeño, pero presentaban potreros y corrales con poco espacio y en muchos casos se presentaba hacinamiento, lo que favorece la transmisión del patógeno por contacto directo entre las vacas; además los hatos pequeños presentaban mayor porcentaje de vacas de raza Holstein en un 24,6%, mientras los hatos grandes presentaban 11,2%, como sabemos el factor racial es importante en la susceptibilidad a la mastitis, también los factores de estrés afectan más a esta raza, más si se encuentran en el trópico bajo con temperatura promedio de 22,7°C como en este estudio (13); La gran mayoría de las vacas en los hatos grandes son de raza Gyrolando 39,2%, resistentes a condiciones de altas temperaturas y humedad. Contrario a los hallazgos de Palacios, quien reportó una mayor prevalencia del patógeno en los hatos grandes; este resultado puede deberse, según el autor, a las características propias de los diferentes establos del estudio, donde en los establos no separaban las vacas sanas de las vacas enfermas de mastitis para el ordeño lo que condujo a diseminar la enfermedad (14). Por el contrario, el resultado de nuestra investigación está de acuerdo con la alta prevalencia de mastitis asociada con la presencia del patógeno en los hatos lecheros en China, 46,2%, donde las vacas son manejadas en forma intensiva, y existe contacto estrecho entre las vacas (24) .
En Colombia, se ha encontrado una menor prevalencia de S. aureus en hatos pequeños: 18,9%; y 10,3% en la zona este de la Provincia de Antioquia; estos resultados difieren porque Ruiz utilizó un método de muestreo estratificado más preciso, pero de las muestras que dieron positivo en la prueba CMT; mientras que Trujillo realizó un muestreo no probabilístico (18,22). De las 1.070 muestras de leche cultivadas, 902 (84,30%) resultaron negativas y 168 (15,70%) positivas; Estos resultados concuerdan con los de Ramírez (2001), quien reportó 18,9% de crecimiento en cultivo, pero menor a lo encontrado por Calderón (2008), en el altiplano Cundiboyacense (en las Provincias de Cundinamarca y Boyacá), quien obtuvo 29,9% del crecimiento del patógeno en sus aislados; Palacios, 29,60% (2017); Ruiz, 29,6% (2011); y Zutic, 39,6% (2012) (25). Todas las muestras recolectadas en este estudio fueron sometidas a una prueba subjetiva de cribado conocida como CMT, arrojando una prevalencia de mastitis subclínica del 64,65%, considerando trazas; y 45,88%, sin considerar trazas, mostrando grandes diferencias con respecto a los obtenidos por cultivo, posiblemente por la presencia de otros microorganismos que no son cultivables fácilmente como el Mycoplasma spp., Leptospira spp., Brucella spp. y otras micobacterias, también por mastitis no infecciosas como son traumatismo, estrés, temperaturas (5,14). Un gran error que se encontró en la mayoría de los hatos lecheros (96,3%) es secar la ubre con un periódico después de la desinfección, se sabe que el uso de elementos adecuados como toallas desechables disminuye la transmisión del patógeno entre el ordeñador y las vacas, así como el lavado de manos (13) .
Conclusiones
Si tenemos en cuenta que la mitad de la leche que se consume en Colombia no es pasteurizada, debemos entender que esto genera un alto impacto en la salud pública debido a una posible contaminación por el patógeno.
Como se describe en este estudio, la mayoría de los hatos lecheros son pequeños y están ubicadas en la región central de la provincia del Valle del Cauca, que también tiene la mayor población de ganado; por lo tanto, tiene un mayor riesgo de transmisión del patógeno, debido al mayor intercambio comercial entre los ganaderos, mayor cantidad de visitas de trabajadores, comerciantes, veterinarios en los hatos de la zona.
Se puede mejorar el nivel sanitario de los productores de leche visitados, con medidas higiénicas como el uso de guantes, mascarillas, selladores adecuados y papeles desechables, con el fin de reducir la presencia de S. aureus.
Se requiere investigación a nivel de hatos pequeños, además de identificar genéticamente las cepas clonales que están afectando los hatos lecheros.
Una de las dificultades del presente estudio fue el costo de recolectar las muestras y transportarlas desde las diferentes regiones geográficas.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses con respecto al trabajo presentado en este informe. La investigación recibió ayuda económica de la Universidad Libre, seccional Cali.
