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11° Seminario Internacional en Reproducción Animal y Producción de leche
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11° Seminario Internacional en Reproducción Animal y Producción de leche

Diagnóstico de la paratuberculosis bovina en Jalisco, mediante técnicas de biología molecular y estandarizadas

Publicado el: 18/8/2020
Autor/es: Hugo Castañeda Vázquez*1 Martha Alicia Castañeda Vázquez1 Carlos Bedolla Cedeño2 Erika Patricia Salas Castañeda1, Wilfried Wolter 3, Raymundo Ventura Angulo. 1 Padilla Ramirez Francisco J1. 1Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara Jalisco, México. 2Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo Morelia, Michoacán. 3Landesbetrieb Hessisches Landeslabor, Giessen Hessen, Germany.
Resumen

En el presente trabajo analizamos diferentes métodos de diagnóstico, bacteriológico, por PCR y serológico por pruebas de ELISA, tomas de 25 diferentes establos lecheros en la zona de los Altos de Jalisco. Se tomaron 100 muestras de heces fecales directamente del recto de las vacas, estas fueron sembradas utilizando el medio de Herrold con Micobactina J (0.2 μg/ml), e  incubadas a 37° C durante un periodo de 8 a 20 semanas,  obteniendo crecimiento con características de M. paratuberculosis en 23 de los tubos cultivados (23%). De esas 23 muestras se realizó tinción con la técnica de Ziehl-Neelsen, obteniendo resultados positivos en 18 de los casos (18% del total de muestras sembradas). En el caso de la prueba de PCR de 25 cultivos sospechosos, obtuvimos 3 resultados positivos. Y en la prueba de ELISA  de los 25 sueros sospechosos se obtuvo una muestra positiva. Mediante las pruebas diagnósticas realizadas en el presente trabajo, pudimos observar que el problema de la paratuberculosis es una enfermedad infecciosa importante en bovinos lecheros en el estado de Jalisco y por reportes de otros autores en el País. Son necesarios más investigaciones para conocer de forma más detallada la epidemiologia de la enfermedad de Johne.

Palabras clave; Mycobacterium avium subespecies paratuberculosis, Diagnostico, vacas lecheras, reacción en cadena de la polimerasa PCR, prueba de ELISA.

INTRODUCCIÓN
La Paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad infecciosa que se describió por primera vez en Alemania en 1895. La enfermedad causa una enteritis granulomatosa infecciosa específica, principalmente en los rumiantes, que se manifiesta en diarreas persistentes o recurrentes, las que no remiten a los tratamientos, con presencia de bacilos ácido alcohol resistente en las heces.
En el año de 1978 fue descrito por primera vez el aislamiento del microorganismo Mycobacterium avium subesp. paratuberculosis, en el ganado bovino de México.
Ha sido observado que uno de los principales problemas para el control y tratamiento o eliminación de la enfermedad, es la detección diagnóstica de los animales enfermos subclinicamente, estas dificultades limitan el conocimiento de su distribución geográfica.
En el estado de Jalisco no existen estudios que nos muestren la dimensión del problema de Paratuberculosis, y hoy día existe más interés por parte de los médicos veterinarios y los ganaderos productores de leche, por conocer la presencia de la enfermedad y poner en práctica alternativas sustentables para su diagnóstico y control.
Para la Paratuberculosis o Enfermedad de Johne, se han desarrollado pruebas de diagnóstico para identificar el agente causal, sin embargo algunas no son evaluadas en condiciones de campo para relacionar la respuesta inmunológica con los signos clínicos de animales infectados por Mycobacteruim avium subespecie paratuberculosis (bacilo de Johne), y desarrollar un programa de control efectivo.
 Por lo que se plantea la utilización de algunas pruebas como el cultivo de tejidos o fecal, tinción de Ziehl-Neelsen, enzimas inmunoabsorbentes (ELISA) y prueba de reacción en cadena  de la polimerasa en heces (PCR), que han demostrado ser efectivas, aunque no por si solas. El presente trabajo pretende eficientar la combinación de estas técnicas y el esquema de su utilización.
Jalisco es actualmente productor de más de 5 millones de litros de leche diarios y cuenta con más de 400,000 vacas lecheras, lo cual destaca la importancia de esta actividad económica para el Estado. El presente trabajo, plantea, la investigación de M. paratuberculosis en el ganado bovino lechero del Estado de Jalisco, debido a que actualmente se desconoce la epidemiología de la enfermedad, logrando con ello realizar un control adecuado de la misma.
Aislar e identificar el Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, mediante técnicas, bacteriológicas, serológicas y de biología molecular, de muestras de bovinos lecheros en el estado de Jalisco.  Mediante comparación, resaltar el método diagnóstico más efectivo para M. paratuberculosis en ganado bovino lechero.
 
MATERIAL Y MÉTODOS
Toma de muestras
El presente trabajo se realizó en la región de los altos de Jalisco y en el área conurbada de Guadalajara, siendo la primera una de las cuencas lecheras más importantes del País.
Se llevaron a cabo 25 muestreos durante un periodo de seis meses, en el 2008, 20 en el área de los altos de Jalisco y 5 en al área conurbada de Guadalajara.
Tipo de muestras
En cada uno de los 25 diferentes ranchos se tomaron muestras de sangre y heces fecales.
Asépticamente y con el sistema vacutainer, se tomaron en cada establo 5 muestras de sangre de 5 vacas al azar. De las mismas vacas se tomaron 5 muestras de heces fecales réctales.
En cada establo se identificaron a las vacas para enseguida tomar 10 muestras de heces fecales de 10 vacas y enseguida 10 muestras de sangre.
Aislamiento microbiológico
Las muestras de las heces fecales tomadas de vacas lecheras fueron sembradas utilizando el medio de Herrold con Micobactina J (0.2 μg/ml), e  incubadas a 37° C durante un periodo de 8 a 20 semanas.
Técnicas de Biología Molecular
El aislamiento del ADN geonómico se realizó recolectando de 3 a 5 colonias de un cultivo reciente de M. paratuberculosis. Las colonias fueron homogenizadas en 50 μL de solución amortiguadora TE (10 mmol de Tris HCl/L, 1 mmol de EDTA/l, pH 8.0), enseguida se agregó 1 μL de lysostafina (1.8 U/μl). Después de incubar 1 h a 37°C, se añadió 1 μL de proteinasa K (15.1 mg/mL) y la suspensión se re incubó durante 2 h a 56°C. La proteinasa K fue finalmente inactivada mediante la ebullición de la mezcla durante 10 min. Después de centrifugar a 10 000 g durante 5 min, el sobrenadante fue enfriado en hielo para posteriormente utilizarlo en PCR.
Para la amplificación mediante PCR, la mezcla de reacción (20 μL) contendrá 0.7 μL del cebador 1 (10 pmol/μL),  0.7 μL del cebador 2 (10 pmol/μL),  0.4 μL del trifosfato desoxinucleósido (10 mmol/L; MBI),  2.0 μL del amortiguador termofílico 10 x,  1.2 μL de MgCl2 (25 mmol/L),  0.1 μL de la Taq ADN polimerasa (5 U/μL), y 12.9 μL de agua  destilada. Finalmente se agregaran 2.0 μL del ADN preparado a cada uno de los tubos de 0.2 mL.
Primers para la identificación: 5‘TGG ACA ATG AGC GTT ACG GAG GTG G-3‘ y 5‘-GAT CGG AAC GTC GGC TGG TCA GGA T-3‘, fueron diseñados a partir de la secuencia de inserción IS900. Las condiciones de los ciclos son las que se indican a continuación: Desnaturalización inicial 94° C/ 3min; 93° C/ 1 min.; 65° C / 1 min.; 72° C/ 1 min., 30 repeticiones, una extensión final de 72° C por 3 minutos.
Los productos amplificados se corrieron en un gel de agarosa al 2%, siendo los productos finales del amplificado de 453 pares de bases. 
 
RESULTADOS
De las 100 muestra tomadas de heces fecales de vacas lecheras directamente del recto del animal, se realizaron cultivos en medios de Herrold con Micobactina J, previa purificación del excremento,obteniendo crecimiento con características de M. paratuberculosis en 23 de los tuboscultivados (23%).
De esas 23 muestras se realizó tinción con la técnica de Ziehl-Neelsen, obteniendo resultados positivos en 18 de los casos (18% del total de muestras sembradas).
La prueba de ELISA en las 25 muestras de sangre obtenidas dio como resultado únicamente 1 muestra positiva (0.25%)
De 25 cultivos sospechosos de M. paratuberculosis, se les realizó la extracción de ADN para su procesamiento en PCR, obteniendo 3 muestras positivas en la PCR.
 
DISCUSIÓN
Dadas las diferencias significativas obtenidas en los resultados de las cuatro pruebas diagnósticas para Mycobacterium paratuberculosis,  de ganado bovino como agente causal de la Paratuberculosis bovina, concluimos que es necesaria la combinación de todas estas pruebas para realizar un diagnóstico y control más efectivo del patógeno en dicha enfermedad.
 
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Referencias bibliográficas

 
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