Alcaloide cuaternario de benzofenantridina en la expresión de células cd3+, células caliciformes en la mucosa intestinal y células inmunológias en la sangre de pollos

Los alcaloides de la benzofenantridina incluyen principalmente a la sanguinarina y la queleritrina como parte de un grupo de alcaloides de la benzofenantridina y la protopina, que se obtienen de algunas plantas. Algunos estudios (Schmeller et al., 1997) indican que la sanguinarina es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias, afectando diversos puntos de su multiplicación. Es por ello que el objetivo del presente estudio fue evaluar el uso de un producto comercial formado por alcaloides de la benzofenantridina en el agua de pollos de engorde sobre el conteo Salmonella Enteritidis (SE), evaluar las células inmunológicas de la sangre, contar las células CD3+ y las células caliciformes en la mucosa intestinal de pollos desafiados con SE.

Se alojaron 120 pollos de engorde, libres de Salmonella spp., durante los días 1 a 21 de edad divididos en 2 tratamientos, utilizando un diseño experimental completamente al azar, con un tratamiento testigo (T1) sin la adición de antibióticos ni otros aditivos al alimento o al agua, y tratamiento T2 compuesto por un alimento testigo y la adición de 100 g/1,000 l de alcaloides de benzofenantridina (Sangrovit^®, Fitobiotics, Londrina, PR, Brasil) en agua destilada. A los 14 días de edad todos los animales se inocularon oralmente con 1 ml de una solución de SE a la concentración de 10⁵ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Los animales recibieron el aditivo en agua destilada 24 horas después de la inoculación, renovando el agua cada 12 horas.

El día 21 de edad (7 días después de la inoculación con SE), las aves se sometieron a eutanasia y se realizó la necropsia para recolectar buches y ciegos, para análisis de Salmonella sp. Para la realización del procedimiento de conteo de Salmonella, los buches y los ciegos se diluyeron en agua peptonada al 2%, en proporción 1:9. Se retiró 1 ml de la solución de peptonada al 2% y, mediante pipeta, se transfirió a un tubo que contenía 9 ml de agua peptonada al 0.1% y así, sucesivamente, hasta la dilución 10^-3. Posteriormente se retiraron 100 μl de cada dilución para siembra por suplicado en medio XLD, utilizando un asa de Drigalsky para esparcir el líquido en la placa. Las placas se incubaron en una estufa regulada a 35°C por 24 horas (h) y se sometieron a conteo de colonias típicas (método adaptado de Desmidt et al., 1997). La solución inicial de agua peptonada al 2% se incubó a 35°C por 24 h. En caso de no obtener crecimiento de colonias típicas de SE después de 24 h de incubación en alguna muestra, se retiraron 100 μl de la solución inicial en agua peptonada al 2%, que se agregaron a un tubo que contenía 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis, que se incubó en una estufa regulada a 42°C por 24 h para confirmación. Los resultados de los conteos de colonias se expresaron de acuerdo con los Procedimientos para el Conteo de Colonias (Procedimentos de Contagem de Colônia) de acuerdo con la Normativa No. 62 publicada el 26 de agosto de 2003 (MAPA, Brasil, 2003).

También se recolectaron fragmentos de duodeno, yeyuno, íleon y ciego, en formalina amortiguada al 10%, para análisis de células CD3+ por medio de inmunohistoquímica y células caliciformes por medio de histopatología (tinción de Azul Alcian) en la mucosa intestinal. El conteo de células caliciformes y CD3+ se realizó utilizando un microscopio óptico. Para las células CD3+, se leyeron 10 campos por tratamiento y para las células caliciformes se estudiaron 20 vellosidades por tratamiento, utilizando una amplificación de 40X. A los 21 días de edad también se tomaron muestras de sangre de 4 animales por tratamiento para citometría de flujo. Los resultados del experimento se sometieron a análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa de cómputo StatView SAS y las medias se compararon bajo la prueba de Tukey, con el 5% de probabilidad.

El Cuadro 1 presenta los datos referentes al conteo de SE en el ciego y el buche, 7 días después de la inoculación con SE. Se observa que el aditivo a base de alcaloides de la benzofenantridina en el agua mostró ser eficaz en el combate de la colonización con SE en el ciego y el buche de los pollos 7 días después de la inoculación, reduciendo significativamente el recuento de esta bacteria en comparación con el grupo testigo.

Cuadro 1. Conteo de Salmonella Enteritidis (Log10 UFC) en el ciego y el buche de los pollos a los 7 días postinoculación con SE, en los dos grupos

En el Cuadro 2 se encuentran los resultados de las medias y la desviación estándar de los conteos de células caliciformes y CD3+ en la mucosa intestinal del duodeno, yeyuno, íleon y ciego de los pollos de engorde inoculados con SE, 7 días después de la inoculación.

De acuerdo con los resultados, en el duodeno y el yeyuno se observa una mayor cantidad de células caliciformes en el grupo testigo, además de un mayor número de células CD3+ en el duodeno, yeyuno e íleon de este mismo grupo.

Cuadro 2. Conteo de células caliciformes/vellosidad y CD3+/campo en el duodeno, yeyuno, íleon y ciego de los pollos inoculados con SE, a los 7 días PI, en los dos grupos

Las células caliciformes son productoras de glucoproteínas (moco) y tienen funciones de protección de la mucosa intestinal contra agentes abrasivos presentes en la dieta y contra agentes patógenos. También participan en la absorción de nutrimentos. El moco participa en la respuesta inmune inespecífica y, cuando existe una gran expresión de células caliciformes significa que puede haber algún tipo de desafío sanitario que demande una mayor producción de moco. Por el contrario, cuando el moco está en grandes cantidades puede causar perjuicio para la salud del ave, pues aumenta el tránsito intestinal y reduce la absorción de los nutrimentos. Las células CD3+ son linfocitos T que participan en la respuesta inmune específica (Murphy et al., 2010).

El Cuadro 3 presenta los resultados de citometría de flujo. Podemos observar una mayor proporción de células inmunológicas en la sangre (CD4, CD8α, CD8α^Bright, CD8β, TCR αβ Vβ1, CD28) en los animales tratados con la benzofenantridina en el agua de bebida. Estos resultados contrastan con un menor número de células CD3+ y células caliciformes en la mucosa intestinal del yeyuno de las aves de este mismo grupo en comparación con el testigo.

Cuadro 3. Proporciones de células circulantes en la sangre de los pollos de engorde a los 21 días de edad, después de 7 días de la inoculación con SE, de acuerdo con l subpoblación identificada (proporción entre las poblaciones CD4+ e CD8+)

El control de SE demostrado por los alcaloides de la benzofenantridina en el análisis microbiológico, culminó con una respuesta inmune menos intensa del ave (menor presencia de células CD3+ y mayor proporción de marcadores de células inmunes en la sangre de los animales). Gonzales-Begné et al. (2001) asociaron el uso de estos alcaloides con la reducción de gingivitis en seres humanos y asociaron estos resultados con las propiedades antimicrobianas y antiinflamatorias de este compuesto.

El alcaloide de benzofenantridina adicionado en el agua de los pollos de engorde inoculados con SE redujo la presencia de este germen en el buche y en el ciego, así como el número de células caliciformes y CD3+ en la mucosa intestinal, y aumentó la proporción de células inmunes en la sangre a los 21 días de edad. Estos resultados se traducen en un menor gasto metabólico de las aves que recibieron estos alcaloides de la sanguinaria, pues el control de Salmonella que demostró el producto ante el análisis microbiológico culminó con una respuesta inmunológica menos intensa. No obstante, será necesario realizar más estudios para evaluar el uso de estos componentes en pollos de engorde.

Mapa (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). 2003. Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. Instrução Normativa nº62 publicada em 26 de agosto. Brasil.

Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck F. 1998. Serological and bacteriological observations on experimental infection with Salmonella Hadar in chickens. Vet. Microbiol. 60: 259-269.

Gonzalez-Begné M, Yslas N, Reyes E, Quiroz V, Santana J, Jimenez G. 2001. Clinical effect Mexican Sanguinaria extract (Polygonum aiculare L.) on gingivitis. J. Ethnopharmacol. 74:45-51.

Murphy K, Travers P, Walport M. 2010. Imunobiologia de Janeway. Porto Alegre: Artmed.

Schmeller T, Latz-Brüning B, Wink M. 1997. Biochemical activities of berberine, palmatine and sanguinarine mediating chemical defence against microorganisms and herbivores. Phytochemistry 44:257-266.