Introducción

La Resistencia de antibióticos es reconocido actualmente como un problema de salud pública.

La comisión europea estima que para EU la Resistencia de los antibióticos son responsables de 25000 muertes de pacientes cada año. De igual manera, directa e indirectamente los costos y las pérdidas anuales de productividad están estimados en 1.5 billones de euros. Por consecuencia algunos países han tomado medidas implementado planes para la reducción de uso de antibióticos en el área de medicina veterinaria. Para lograr este objetivo, la estimulación de la inmunidad del pollo de engorda mediante macro algas o extractos de algas, parece ser una de las primeras líneas en investigación. Existen muchos estudios en cerdos y granjas acuícolas que demuestran el interés de los extractos de alga para este propósito. (Castro et al., 2006; Isnansetyo et al., 2016; Leonard et al., 2011). Sin embargo, no existen resultados para el pollo de engorda. Aquí fue la acción de un extracto de Ulva armoricana rica en polisacáridos sulfatados, evaluada in vitro en heterófilos y monocitos aviares.

Materiales y Métodos

1.1 Recolección de células

Los heterófilos y monocitos fueron purificados de sangre periférica de pollos (Ross 308) a los 28 días de edad criados en condiciones comerciales con la misma dieta y programas profilácticos. Un veterinario asesoro los riesgos sanitarios antes de la toma de muestras y monitoreo hasta el matadero. Incluyo mediciones –(mortalidad, ganancia de peso diario, y consume alimenticio) y controles normales en la granja. Las células fueron purificadas como se describe antes. (Farnell et al., 2003). Las células rojas fueron extraídas mediante centrifugación con metilcelulosa. Las células mononucleares se obtuvieron por centrifugación sobre un gradiente discontinuo de Histopaque 1.077-1.113, como se describió (Farnell et al., 2003). Los heterófilos fueron lavados con DPBS, y resuspendidos en medio RPMI-1640 suplementado con HEPES 10 mM. Se usaron inmediatamente para los experimentos y su viabilidad controlada por tinción con azul tripán. Además de un control visual, se evaluó el método de purificación utilizando RT-qPCR para mieloperoxidasa, fosfatasa alcalina y mRNAs de catalasa, ya que la ausencia de estas enzimas es característica de los neutrófilos aviares (Stewart et al., 2013, Kaiser P. 2012). La viabilidad celular fue típicamente> 95%. Las células mononucleares se adhirieron al plástico 2 horas a temperatura ambiente. Las células no adherentes se eliminaron y las células adherentes se enjuagaron para eliminar los trombocitos, antes de la incubación en medio RPMI-1640 suplementado con HEPES 10 mM (He et al. 2003, He et al., 2011, Arsenault et al).

1.1.2 Aislamiento del extracto de alga

Ulva armoricana fue cosechada en Bretaña (Francia). El extracto se obtuvo después de enjuagar, triturar y ultrafiltrar en membranas adecuadas y adicionalmente desmineralizar (Patente No. FR 61909). La falta de endotoxinas se verificó usando un kit dedicado (E-toxateTM, Sigma) cuyo umbral de detección fue de 0,01 unidades de endotoxinas / ml. El extracto se disolvió en DPBS y se realizaron diluciones adicionales en medio RPMI-1640.

1.1.3 Activación de las células

Como se describió previamente (Kogut et al., 2005), se incubaron 8 106 heterófilos en un volumen de 100 \ mu l a 41ºC con 5% de CO _ {2}. A medida que la activación de los neutrófilos da como resultado la liberación de glucuronidasa (Genovese et al., 2013), se cuantificó su actividad en los medios condicionados para demostrar la activación. Cuando se incuba 4 horas a 41 ° C, la glucuronidasa escinde un precursor no fluorescente (4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido, Sigma). Esto da como resultado la producción de belliferona, que puede cuantificarse espectrofotométricamente, como se describió previamente (Kogut et al., 2005). Paralelamente, se produce una variación en la concentración intracelular de especies de radicales libres (ROS) durante la activación de los heterófilos, como parte del estallido oxidativo (Swaggerty et al., 2006). Las células se preincubaron durante 30 min con el sustrato no fluorescente (diacetato diclorofluoresceína, 10 μg / ml) antes de la adición del extracto. La explosión induce la escisión del sustrato y conduce a la fluoresceína (Swaggerty et al., 2006).

Para monocitos, la concentración de óxido nítrico (NO) en medios condicionados se determinó con el reactivo de Griess (He H., 2003). Se cultivaron en un medio de glucosa RPMI-1640 a 41 ° C con 5% de CO2, como se describió previamente (He et al., 2003, He et al., 2011, Arsenault et al. Al., 2013).

Todos los experimentos se llevaron a cabo con glucógeno como control negativo (10 μg / ml) y LPS como positivo (10 μg / ml) como se describió previamente (He H. 2003, Farnell et al., 2003, St Paul et al., 2013).) El glucógeno se eligió control para garantizar que la presencia de cualquier polisacárido no da como resultado la activación de las células .

2. Resultados y discusión

2.1. Características del extracto

El contenido de proteínas en la materia seca fue del 8,9%, como se evidencia con el método BCA (Smith et al., 1985). No se pudieron detectar ácidos grasos cuando se cuantificaron de acuerdo con la regulación CE152 / 2009, con un umbral de sensibilidad de 0,5 g / 100 g. El contenido promedio fue: 40.2 +/- 0.7% para azúcares neutros (según el método de Dubois, Dubois et al 1956), 32.2% +/- 0.8% para ácidos urónicos (según Blumenkrantz'one, Blumenkrantz et al., 1973) , 8.3 +/- 0.3% para sulfatos ligados a azúcar (cuantificación Azure A, según Jaques et al. 1968).

La composición de monosacáridos se determinó mediante cromatografía de gases de derivados de trimetilsililo, después de una metanolisis ácida durante 4 h en 3 ml de mezcla de MeOH / HCl a 100 ° C (de acuerdo con el método de Montreuil Montreuil et al., 1986). Este análisis evidenció una composición habitual de ulvano con, ramnosa, xilosa, ácido idurónico y ácido glucurónico. El análisis de protones NMR mostró un perfil muy cerrado al obtenido con un ulvano tratado con ácido y valida la presencia en la muestra de oligosacáridos con una estructura tipo ulvano mayoritaria.

2.2. Activación de heterófilos

Los heterófilos son los equivalentes de los neutrófilos de mamíferos, una parte integral de las defensas innatas de las aves contra las infecciones microbianas. El extracto de algas (MSP) lleva a los heterófilos a liberar glucuronidasa de una manera dependiente de la dosis y del tiempo, como lo hace el LPS (control positivo) pero no el glucógeno (control negativo). Como se observó para LPS (10 μg / ml), la liberación máxima ocurre cuando las células se incuban durante 3 h, con 50 μg / ml de MSP (figura 1A). La glucuronidasa degrada el ácido glucurónico presente en la pared y la membrana plasmática de las bacterias, lo que reduce su capacidad de supervivencia (Genovese et al., 2013, Stewart et al., 2013). Además, y de la misma manera, la MSP también induce un estallido oxidativo de heterófilos, como se evidencia por la liberación de fluoresceína (Figura 1B).

2.3. Monocitos

La segunda célula líder en inmunidad innata es el monocito, especialmente de acuerdo con su capacidad para producir NO que muestra actividad bactericida, pero también porque es un puente con inmunidad adaptativa (Kaiser 2012). Cuando se incuban con la MSP, los monocitos secretan cantidades estadísticamente significativas de NO (figura 2). Como se observó anteriormente con heterófilos, la secreción depende del tiempo y de la dosis, con un efecto máximo a 50 μg / ml de la MSP (figura 2).

Extracto de ulva sp. estimula el sistema inmune innato in vitro en pollo de engorda - Image 1

Figura 1. El MSP activa heterófilos. Cada punto representa la media +/- SEM de 5 repeticiones. * significa p <0.05, ** p <0.01. A: Cuantificación de la liberación de belliferona como resultado de la actividad enzimática de la glucuronidasa. Los medios acondicionados se incubaron 4 horas a 41 ° C como se describió previamente (Kogut et al., 2005). B: estallido oxidativo como se evidencia por la liberación de fluoresceína (Swaggerty et al., 2006). Las células se incubaron con un precursor no fluorescente y la variación de fluorescencia de la fluoresceína liberada se midió espectrofotométricamente.

Extracto de ulva sp. estimula el sistema inmune innato in vitro en pollo de engorda - Image 2

Figura 2. Los monocitos incubados con MSP producen NO. Cada punto representa la media +/- SEM de 5 experimentos independientes. * significa p <0.05, ** p <0.01. El reactivo de Griess se utilizó para cuantificar NO

Conclusión

Las células clave de la inmunidad del pollo, es decir, heterófilos y monocitos, se activan in vitro a las pocas horas con la MSP. Se está trabajando para identificar sus mecanismos de acción involucrados tanto in vitro como in vivo, ya que este MSP se ha incluido en un producto comercial (Searup®) que ha demostrado mejorar los desempeños zootécnicos en granjas avícolas (Bussy et al., 2015).

Referencias

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Extracto de ulva sp. estimula el sistema inmune innato in vitro en pollo de engorda