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Desarrollo de una vacuna viva contra el virus de newcastle que contiene interleuquina-2 para disminuir la reacción post-vacunal y potenciar la respuesta inmune en pollos

Publicado el: 11/8/2015

Introducción

Enfermedad de Newcastle (EN)
La Enfermedad de Newcastle es una enfermedad causada por el Virus de la EN (NDV), que en aves no vacunadas puede llegar a causar una mortalidad del 100%. Además, NDV es capaz de infectar a más de 200 especies de aves, aunque la severidad de la enfermedad depende tanto de la cepa, como del hospedero (OIE, 2012).

NDV tiene un genoma RNA de cadena negativa que codifica 6 proteínas estructurales: Nucleoproteína (NP), Fosfoproteína (P), Matriz (M), Fusión (F), Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN) y proteína Larga (L).


La Interleuquina-2 (IL-2) 
La IL-2 es una citocina del sistema inmune, de un peso molecular de 15 kDa. En mamíferos y aves actúa como factor de crecimiento de los linfocitos T, induce todos los tipos de subpoblaciones de linfocitos y activa la proliferación de linfocitos B. IL-2 es necesario para el establecimiento de la memoria inmunitaria celular, así como para el reconocimiento de autoantígenos y antígenos foráneos; factor de crecimiento, supervivencia y proliferación de los linfocitos T.


OBJETIVOS:

1. Potenciar la vacuna viva de NDV.
2. Disminuir la reacción post-vacunal.


Metodología

Para alcanzar estos objetivos, hemos utilizado un método para incorporar la IL-2 a la superficie de células derivadas de fibroblasto de pollo (DF-1), lo que permitirá que cuando NDV las infecte tome parte de la membrana de la célula y con ella a la IL-2.


Diseño experimental:

1. Desarrollo de una línea celular modificada que expresa IL-2 en su superficie.
1.1 Diseño del gen
1.2 Clonamiento
1.3 Transfección
1.4 Selección
1.5 Ensayo de proliferación

2. Obtención de partículas de NDV con IL-2 en superficie.

3. Evaluación de la patogenicidad.
3.1 Cálculo del Índice de Patogenicidad Intracerebral (IPIC).
3.2 Patogenicidad en aves de diferentes edades vía óculo-nasal.

4. Ensayo de vacunación


Resultados

Obtención de células que expresan IL-2 en su superficie: Transfección y selección El plásmido pcDNA3.1(+) – HNIL2, que expresa el gen HNIL2 (IL-2 modificada para expresarse en la superficie celular y viral), fue transfectada en células DF-1. Luego de hacer 5 pasajes en medio de selección, se realizó una selección clonal, obteniéndose 60 clonas resistentes a la geneticina que fueron evaluadas para determinar cuál expresa la proteína quimérica HNIL2 en su superficie.


Ensayo de proliferación de linfocitos

Para verificar la correcta expresión de la IL-2 en la membrana de las células, se realizó un ensayo de proliferación de linfocitos, el cual se basa en la capacidad de la IL-2 para inducir a que los linfocitos preactivados se multipliquen. La prueba consistió en la adición de CellTrace Violet a esplenocitos de pollo que fueron colocados tanto en células DF-1 que expresaban IL-2 en su superficie, como en DF-1 wild type. La medición de la prueba fue hecha por citometría de flujo. Finalmente, se obtuvo que las células DF-1 que expresan IL-2 son capaces de inducir mayor proliferación en linfocitos preactivados, que las DF-1 wild type.
 
 

Patogenicidad en aves de 1 y 7 días

Se evaluó el efecto de la IL-2 en la patogenicidad de un NDV virulento. Para esto, se inoculó 2000 UFP/pollo en aves SPF de 1 y 7 días de edad, un NDV de ICPI 1.6 crecido en células DF-1 con IL-2 o en DF-1 wild type. Se obtuvo que la IL-2 disminuyó la patogenicidad del virus en aves de 7 días, mientras que en aves de 1 día la patogenicidad no se vio afectada y todas las aves murieron.
 
 

Ensayo de vacunación

Programa de vacunación en pollos SPF:

Los resultados mostraron que los grupos con IL-2 tuvieron mejor protección al desafío letal. Entre los grupos que recibieron una sola dosis se observó que el grupo con IL-2 tuvo un 91.7% de supervivencia, mientras que el grupo sin IL-2 tuvo un 84% de supervivencia. En los grupos con dos dosis, el grupo de aves vacunadas con NDV/IL-2 tuvo una supervivencia del 100%, sin muestras de síntomas post-desafío. Por otro lado, el único grupo donde se detectó excreción viral fue el grupo con una sola dosis de vacuna sin IL-2 (ver el siguiente cuadro).
 

Tabla de Supervivencia y Secreción viral post-desafío. Se observa que los grupos vacunados con NDV más IL-2 obtuvieron mejor protección que los grupos equivalentes sin IL-2 (igual número de dosis). Además, se observó que solo en el tratamiento al que se le aplicó una sola dosis con la vacuna sin IL-2 y en control negativo (C-) se pudo detectar excreción viral en hisopados traqueales.
* No aplicable, debido a que las aves estaban muertas.
 
 

Conclusiones
  • Se obtuvo una nueva línea celular derivada de células DF-1, capaz de expresar IL-2 funcional en su superficie y al ser infectada por NDV, la IL-2 se incorpora en el virus. 
     
  • La IL-2 es capaz de potenciar la respuesta inmune contra NDV cuando es co-administrada por una ruta natural (óculo-nasal). 
     
  • La IL-2 tiene un efecto en la respuesta inmune dependiente de la edad del ave. Es decir, mientras más maduro sea el sistema inmune del ave, mejor será la efectividad de la IL-2 como inmunoadyuvante. 
     
  • La vacuna desarrollada puede ser usada tanto como primera vacuna, como también como vacuna refuerzo sin reacción postvacunal.
 
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