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Desarrollo de un nuevo test de neutralización para la enfermedad de newcastle (NDV) basado en un NDV recombinante que expresa la proteína verde

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Resumen

Introducción: La enfermedad de Newcastle es una de las enfermedades infecciosas más importantes de la industria avícola, y es causada por el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). Este virus está distribuido en todo el mundo y puede causar pérdidas graves en la economía de la industria de aves debido a los brotes recurrentes en pollos vacunados y no vacunados. La protección contra el NDV en pollos ha sido asociada con el desarrollo de la respuesta humoral. Aunque el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) y el ELISA no corroboran la presencia de anticuerpos neutralizantes (nAbs); ellos son usados para medir la protección y respuesta inmune contra NDV.

Métodos: En este estudio, establecimos un sistema de recuperación para un NDV recombinante (rLS1) a partir de un clon de cDNA, que es capaz de aceptar genes exógenos en las posiciones deseadas. Un gen conteniendo la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP) fue diseñado en la primera posición del genoma y generamos un NDV recombinante que portaba la eGFP. El virus reportero NDV-GFP se utilizó para desarrollar una prueba de neutralización basada en la eGFP (eGFP-NT), en la que los títulos de nAbs fueron expresados como el título recíproco de la dilución más alta que expresaba la eGFP.

Resultados: La eGFP-NT dio resultados concluyentes en 24 h sin usar ningún procedimiento de tinción adicional. Un total de 57 las muestras de suero fueron analizadas mediante neutralización convencional (NT) y eGFP-NT. Además, el HI y un kit de ELISA comercial se evaluaron con el mismo conjunto de muestras. Aunque el HI (R2 = 0.816) y el ELISA (R2 = 0.791) mostraron correlaciones sustanciales con la NT convencional, la eGFP-NT mostró una correlación más alta (R2 = 0,994), indicando que la eGFP-NT es un método más preciso para cuantificar nAbs.

Conclusiones: En general, la prueba de neutralización desarrollada aquí es un método simple, rápido y confiable para la cuantificación de nAbs específicos para NDV. Es adecuado para evaluación de vacunas y ensayos diagnósticos.

Palabras clave: Virus de la enfermedad de Newcastle, Neutralización del virus, Suero, eGFP.

Introducción

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y mortal que afecta a las aves de corral y otras especies de aves en el mundo [1]. Cepas virulentas de NDV son capaces de causar una alta mortalidad (hasta 100%) en pollos no vacunados [1]. NDV es un miembro del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae en el orden de Mononegavirales [2]. Este virus tiene un genoma no segmentado de ARN de cadena simple de sentido negativo, que contiene una secuencia 3'-leader y una secuencia 5'-trailer, esenciales para la transcripción y replicación de virus, y sigue la regla de seis [3]. NDV posee seis genes estructurales: Nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), matriz (M), fusión (F), hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y polimerasa grande (L) [4]. De estas proteínas, las proteínas N, P y L forman el complejo ribonucleoproteico (RNP), que es responsable de la transcripción y la replicación viral [5]. Las proteínas HN y F están ancladas en la envoltura viral como glicoproteínas de superficie: La HN es responsable de la unión del virus al receptor de la célula huésped, y la F media la fusión de la envoltura viral con la membrana de la célula huésped [6]. La proteína F es escindida proteolíticamente a F1 y F2 para la actividad de fusión y la presencia de un motivo polibásico en el sitio de escisión es una principal determinante de la virulencia [6, 7]. Ambas proteínas HN y F son capaces de inducir anticuerpos neutralizantes (nAbs) [8-12]

La inmunidad humoral juega un papel esencial en la protección contra la infección de NDV. Pollos con altos títulos de anticuerpos usualmente están protegidos. Por ejemplo, pollos jóvenes con altos títulos de anticuerpos maternos están protegidos contra un desafío con una cepa virulenta durante los primeros días [12]. Protección contra el virus ha sido descrita para pollos pasivamente inmunizados con yema de huevo o antisuero de aves hiperinmunizadadas contra todo el virión. Anticuerpos monoclonales contra las proteínas HN y F son capaces de neutralizar el virus, tanto in vitro como in vivo [13-15]. Aunque, los anticuerpos contra F y HN tienen un potencial sinérgico [14]. Recientemente, altos niveles de anticuerpos específicos no solo han sido relacionados con la protección contra la mortalidad, sino también con la reducción de replicación y secreción viral [16]. Por lo tanto, medir los nAbs contra NDV es altamente esencial para evaluar la eficacia de una vacuna.

Usualmente, el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI) y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) son usados para medir los anticuerpos específicos contra NDV, pero no necesariamente nAbs. El test de neutralización convencional (NT) es laborioso, lleva mucho tiempo y puede ser susceptible a la parcialidad del operador. Por lo tanto, un ensayo de NT rápido, de alto rendimiento y confiable es necesario para la evaluación de nAbs de NDV.

En los últimos años, algunos investigadores han demostrado que virus genéticamente modificados que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) o la GFP mejorada (eGFP) pueden ser utilizadas para la determinación rápida de títulos de nAbs de virus o actividades antivirales [17-21]. La eGFP expresada por estos virus permite la visualización directa de la infección bajo un microscopio de fluorescencia o su automatización, usando una placa de lector de fluorescencia. Estas características hacen del eGFP-NT un método adecuado para superar los inconvenientes de una NT convencional.

En este reporte, describimos la generación de un NDV genéticamente diseñado para expresar la eGFP, a partir de un clon de cDNA, y el desarrollo de un ensayo de NT basado en la eGFP (eGFP-NT) para la rápida detección de nAbs. Nuestros resultados muestran que este método es tan preciso como un método de NT convencional pero una mejor alternativa en términos de ser rentable y eficiente.

Métodos

Líneas celulares

Dos líneas celulares en este estudio fueron utilizadas, DF-1 (derivado de fibroblastos de pollo) y Vero (células de riñón de mono), las cuales fueron adquiridas de ATCC (Manassas,VA, EE. UU.). Ambas líneas celulares fueron mantenidas en medio DMEM F12 (HyClone) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 2.5% de suero de pollo (SChk) (Sigma-Aldrich), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.

Construcción de un clon completo de NDV

Basados en la secuencia de nucleótidos de la cepa lentogénica de NDV publicada en el GenBank (Número de acceso Y18898) [22], un clon de longitud completa de NDV (pFLC-LS1) fue ensamblado en el vector modificado pCI (pCI/-SnaBI) a partir de tres fragmentos superpuestos. La figura 1 muestra la secuencia de subclonaciones de los tres fragmentos dentro del vector, cada uno en sitios de únicos de restricción, denominados NheI-EagI, BssHII-SgrAI y SnaBI-SapI, respectivamente.

Los fragmentos -1 y -2 fueron sintetizados químicamente (GenScript, New Jersey, USA) y contienen secuencias de NDV, y el fragmento -3 se tomó del clon de longitud completa  pNDV-PE18 previamente recuperado [23], el cual se derivó de la cepa LaSota. El fragmento -1 (4387 nt) que incluye las secuencias (de 5' a 3 ') de la ribozima cabeza de martillo (HHRz), y los genes N, P y parte del M, entre los sitios de restricción NheI y EagI. La secuencia de la HHRz 5'-CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC TAT AGG AAA GGA ATT CCT ATA GTC-3` fue incluida inmediatamente en el upstream de la secuencia leader del virus. El fragmento-2 (5865 nt) consiste del gen parcial M, el gen F, el gen HN y parcialmente el gen de la proteína L y la ribozima del anti-genoma del virus de la hepatitis delta (HDVRz). La secuencia de la HDVRz 5'-GGG TCG GCA TGG CAT CTC CAC CTC CTC GCG GTC CGA CCT GGG CAT CCG AAG GAG GAC AGA CGT CCA CTC GGA TGG CTA AGG GAG AGC CA-3' se insertó inmediatamente al downstream de la secuencia de trailer del virus [24]. El fragmento -3 (4989 nt) contiene la secuencia restante del gen L (4769 nt upstream) entre los sitios de restricción SnaBI y SapI. Todos los cambios de nucleótidos debido a la creación o la eliminación de sitios de restricción en el clon son mostrados en la Tabla 1. Finalmente, la secuencia del genoma de NDV (15,186 nt) se obtuvo en el plásmido resultante pFLC-LS1 (19,319 pb). El ADN de este plásmido fue completamente secuenciado por secuenciación de Sanger (Macrogen Inc., Corea) para verificar su integridad.

Construcción de plásmidos de soporte

Los plásmidos de soporte fueron generados a partir del vector pFLC-LS1 usando los cebadores Nfor, Nrev, Pfor, Prev, Lfor y Lrev (Tabla 2). Los marcos de lectura abiertos (Open reading frames: ORFs) fueron amplificados a partir de los genes de la proteínas N, P y L y luego fueron clonados en el vector pCI. Los plásmidos resultantes pCI-N, pCI-P y pCI-L fueron utilizados para la recuperación de los virus recombinantes. Los ORFs de las proteínas N y P se amplificaron mediante PCR usando cebadores específicos para los genes que contienen los sitios de restricción EcoRI y NotI, mientras que el ORF de L fueron amplificados utilizando los cebadores Lfor y Lrev, que a su vez poseen los sitios de restricción SpeI y NotI, respectivamente. El ORF del gen L fue clonado entre NheI y NotI, lo que resultó en la eliminación del sitio de restricción NheI/SpeI. Todos los cebadores forward contenían la secuencia de Kozak GCCACC inmediatamente arriba del codón de inicio (ATG).

Fig.1 Construcción del clon de longitud completa rLS1. Los tres fragmentos que contienen todo el genoma del NDV se ensamblaron mediante ligaciones sucesivas en el plásmido pCI/SnaBI modificado. Los fragmentos 1 y 2 se sintetizaron químicamente, mientras que el fragmento 3 se escindió del plásmido pNDV-PE18. El fragmento-1 contiene la ribozima HHRz en el extremo 5', la secuencia leader y los genes N, P y el gen parcial M. El fragmento-2 contiene los genes parciales M, el gen F, el gen HN y parcialmente el gen de la proteína L, la secuencia trailer y la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDVRz). El fragmento-3 contiene la porción restante del gen L. Los sitios de restricción tachados; SnaBI y BbvCI fueron destruidos con respecto a sus secuencias originales.

a La numeración de a posición del nucleótido es relativa a la secuencia de referencia de NDV (GenBank Y18898)

b Las regiones intergénicas entre F y HN o entre los genes HN y L, respectivamente

c Las diferencias en la secuencia de cDNA fueron causadas por la introducción/destrucción de sitios de restricción artificiales (en los fragmentos-1 y -2) o per se de la secuencia del genoma (en el fragmento-3)

Construcción del plásmido pFLC-LS1-1eGFP

Para insertar el gen de la eGFP en el clon completo de NDV, el fragmento A fue sintetizado químicamente (GenScript, New Jersey, USA). El fragmento A esta flanqueado por los sitios de restricción  AsiSI y PciI y contiene la secuencia de ribozima HHRz, secuencia leader, el cassette del gen de la eGFP flanqueado por el inicio y el término del gen N e inmediatamente después el gen terminal y un segundo gen de inicio que será parte del cassette del gen N como se muestra en la Fig. 2. Para lograr altos niveles de expresión, el casete de la eGFP se insertó en el sitio más proximal 3' [25] entre los sitios AsiSI y BbvCI del clon por ligación con el fragmento-B (Fig. 2). El fragmento-B contiene los genes N y P flanqueados por los sitios de restricción PciI y BbvCI. Este fragmento fue obtenido por amplificación de PCR con los cebadores NDV116_F y NDV3211_R (ver Tabla 2), usando pFLC-LS1 como template. Ambos fragmentos fueron clonados simultáneamente en pFLC-LS1 entre los sitios AsiSI y BbvCI (Fig. 2). El plásmido resultante fue designado como pFLC-LS1-1eGFP, el cual contiene el genoma del NDV y el gen de la eGFP y tiene 16.182 nt de longitud, cumpliendo con la regla de seis. El ADN de este plásmido fue completamente secuenciado para verificar su integridad mediante secuenciación de Sanger (Macrogen Inc., Corea).

aLas secuencias de los sitios de restricción están subrayadas

bLa secuencia de Kozak se muestra en negrita

cLas posiciones a las que se unen los cebadores están de acuerdo con la secuencia publicada de NDV (GenBank numero de acceso Y18898)

dEste cebador se tomó de Wise et al.(26)

eNo aplicable

Transfección y recuperación de virus

Alta calidad de ADN plasmìdico fue obtenido a partir de pFLC-LS1, pFLC-LS1-1eGFP y de los tres plásmidos de soporte usando el kit Plasmid Midi (Qiagen). Las células Vero fueron crecidas al 80% de confluencia en una placa de 12 pocillos y luego se cotransfectaron con 1 μg de pCI-N, 0,5 μg de pCI-P, 0,2 μg de pCI-L y 2 μg de pFLC-LS1 o pFLC- LS1-1eGFP, utilizando  Lipofectamina ™ LTX y plus reagent (Invitrogen, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los plásmidos fueron diluidos en 400 μl de medio Opti-MEM (Invitrogen, USA). A continuación, la lipofectamina fue añadida y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células Vero fueron lavadas con la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y luego se añadió la mezcla de plásmido-Lipofectamina a la monocapa. Después de 4 h de incubación a 37 °C, las células transfectadas se lavaron y luego se mantuvieron en DMEM que contiene 5% de SFB a 37 °C y 5% de CO2. Al día siguiente, se añadio fluido alantoideo (FA) a una concentración final de 5% y las células fueron incubadas durante 4 días más. El sobrenadante celular se recolectó, se sedimentó a alta velocidad y se inoculó en huevos embrionados de pollos SPF de 8 días de edad y se incubó durante 4 días. Las FAs se recolectaron, se clarificaron y se tomaron alícuotas y fueron almacenados a -80 °C. La recuperación de los virus se confirmó primero mediante el ensayo de hemaglutinación (HA). Para virus parental (rLS1), la presencia de proteína específica de NDV fueron evaluadas mediante inmunofluorescencia y confirmadas por marcadores genéticos mediante RT-PCR y digestiones con enzimas de restricción. Para confirmar la recuperación del virus rLS1-1eGFP, células DF-1 infectadas fueron observadas bajo un microscopio de fluorescencia.

Fig. 2 Estrategia de clonación para incorporar el gen eGFP en el clon de NDV de longitud completa rLS1. Se realizó una reacción de ligación de tres fragmentos para insertar el gen eGFP en el genoma de rLS1 entre los sitios de restricción AsiSI y BbvCI. El fragmento-A que contenía el casete de la eGFP se sintetizó químicamente, mientras que el fragmento-B se amplificó por PCR usando el clon pFLC-LS1 como template. Ambos fragmentos se clonaron simultáneamente en el pFLC-LS1 para generar el pFLC-LS1-1eGFP. El constructo final incluye la eGFP (ORF), flanqueada por el inicio y el extremo del gen N, insertado en la posición más proximal 3' del genoma de NDV.

Inmunofluorescencia de rLS1

Células DF1 infectadas con el virus rLS1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.01 por 48 h. Después de descartar el sobrenadante, las células fueron lavadas con DPBS por 3 veces (como todas las etapas de lavado en esta sección) y se fijaron con paraformaldehído al 4% en DPBS por 15 min a temperatura ambiente. Células fijadas fueron lavadas, permeabilizadas con 1% de SDS en DPBS por 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente. Células permeabilizadas fueron bloqueadas con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich) en DPBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Células fueron incubadas por 2 h con un anticuerpo monoclonal contra la ribonucleoproteína NDV (RNP) (cat. N ° ab138719, Abcam, USA) a una concentración final de 3,85 μg/mL en una solución de 5% de BSA en DPBS. Después del lavado, las células fueron incubadas por 1 h con un anticuerpo policlonal de cabra anti IgG de ratón etiquetados con Alexa Fluor 594 (cat n ° ab150116, Abcam) a una concentración final de 1 μg / ml en una solución de BSA al 5% en DPBS, y luego lavados. 

Los núcleos fueron teñidos con DAPI durante 5 min. Las células se examinaron bajo el microscopio de fluorescencia Observer.A1 (Carl Zeiss, Alemania). Las imágenes de la señal fluorescente se tomaron a 400X aumentos con la cámara AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Alemania).

RT-PCR y confirmación de marcadores genéticos

La identidad de los marcadores genéticos en NDV recombinantes se confirmó después de la amplificación por RT-PCR a partir del ARN genómico y la secuenciación de los fragmentos de ADN. Dos marcadores genéticos fueron evaluados; la creación del sitio BssHII en el gen M y destrucción del sitio BbvCI en el gen L (Ver Tabla 1). Brevemente, se extrajo ARN vírico de las poblaciones de FA usando el mini kit QIAamp Viral RNA (Qiagen) y se generó cDNA usando el kit de síntesis de ADNc First Strand Proto-Script® II (New England Biolabs Inc). Las reacciones de PCR se realizaron con los cebadores M+4100 [26] y NDV4394_R para amplificar la región que contiene el sitio BssHII, y cebadores NDV14035_F y NDV15003_R para el sitio BbvCI que se destruyó (Ver la Tabla 2). El análisis de restricción de los productos de PCR se llevó a cabo en un gel de agarosa al 2%.

Ensayo de placa

Las células DF-1 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1,5 × 105 células en 1 mL de DMEM F12 por pocillo, un día antes del ensayo. Al día siguiente, se realizaron diluciones seriadas de 1:10 mezclando 25 μL de virus con 225 μL de DMEM F12 libre de suero. Después de lavar la monocapa de células DF-1 con DPBS, se añadieron diluciones (0,2 mL / pocillo) a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% para la absorción viral. Posteriormente, se extrajo el inóculo y cada pocillo se cubrió con 1 mL de un medio de recubrimiento que consistía en DMEM suplementado con 0.5% de agarosa, 5% de FA y 30 mM de MgCl2 [27]. El medio de recubrimiento se dejó solidificar colocando las placas en una superficie nivelada a temperatura ambiente durante 15 minutos, las placas se incubaron durante 5 días a 37 ° C y a 5% de CO2. Las placas fueron fijadas y teñidas con una mezcla de 0.2% de cristal violeta (Sigma-Aldrich) y 3.2% de paraformaldehído durante la noche a temperatura ambiente [28]. Las placas se enjuagaron con agua del grifo, se secaron, se observaron y se fotografiaron por el EliSpot (EliSpot Reader versión 7.0). Los títulos de NDV se reportaron como unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL).

Curvas de crecimiento de virus en células DF-1

Se sembraron cultivos de monocapas de células DF-1 a una confluencia del 50-60% en placas de 12 pocillos y se infectaron con virus rLS1 o rLS1-eGFP a una (MOI) de 0.05. Las células se cultivaron con DMEM que contenía 1% de SFB y 5% de FA con 5% de CO2 a 37 °C. Los sobrenadantes fueron recolectados 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h después de la infección (h.p.i.). Los sobrenadantes recogidos se cuantificaron en células DF1 mediante ensayo de placa como se describió anteriormente.

Muestras de sueros

Se usaron muestras de suero obtenidas de 57 pollos para los experimentos. Se colectaron 37 muestras de suero de pollos vacunados en campo de diferentes granjas. Seis sueros de pollo comercialmente disponibles (Laboratorio de Charles River), correspondientes al virus de la enfermedad del suero anti-Marek (MDV), adenovirus anti-aviar tipo 1, virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), anti NDV, otro suero anti-NDV (cat. N ° ab34402, Abcam), y un suero de un pollo SPF se incluyeron como control negativo. Las 13 muestras de suero restantes se obtuvieron de pollos SPF inoculados con una dosis de la vacuna LaSota a 1 día de edad y se tomaron sus sueros a la 4ta semana. Todas las muestras de suero se inactivaron por calor (56 °C durante 30 min) y se almacenaron a -20 ° C [29].

Pruebas de neutralización

NT convencional y NT-eGFP se llevaron a cabo para cuantificar nAbs en sueros de pollo. Para ambos ensayos, las muestras de suero se titularon por duplicado, usando placas de cultivo de poliestireno no pirogénico de fondo plano de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.). Un día antes del ensayo, se sembraron 1 x 104 células de DF-1 por pocillo en 0,1 ml de DMEM F12 suplementado con FBS al 5%. Las muestras de suero se diluyeron en serie 2 veces (comenzando desde 1: 2) con medio libre de suero DMEM F12, complementado con FA y SFB a concentraciones finales de 5% y 1%, respectivamente. Las diluciones de suero se mezclaron con 100 UFP de virus (rLS1 o rLS1-1eGFP, respectivamente). Cada dilución se evaluó por duplicado. Para NT convencional, las células DF-1 se infectaron con mezclas de suero de virus. Después de 4 días de incubación a 37 °C en CO2 al 5%, las células se lavaron con DPBS. A continuación, las células se fijaron y se tiñeron con una mezcla de 0,2% de violeta cristal y 3,2% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Los títulos de nAb de NDV se determinaron como el recíproco de las diluciones más altas que ambas réplicas presentaron un ECP claro. Para NT-eGFP, una vez que las células DF-1 se infectaron con mezclas de las células del suero del virus, las células se incubaron durante 48 h y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia y se determinaron los títulos de nAb de NDV como el recíproco de las diluciones más altas que no expresaban el eGFP en ninguno de los duplicados. Los pocillos con uno o más focos fluorescentes se consideraron positivos [30].

Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)

El IH se realizó de acuerdo con el manual terrestre de la OIE [31]. Brevemente, se dispensaron 25 μL de PBS por pocillo en placas transparentes con fondo en V de 96 pocillos, luego se colocaron 25 μL de suero en el primer pocillo, se realizaron diluciones al doble de 25 μL de la suspensión de suero a través de toda la placa. Luego, se añadieron 25 μL de virus diluido que contenía 24 unidades de hemaglutinación (UHA) del virus rLS1 a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 25 μL de glóbulos rojos de pollo (RBCs) al 1% a cada pocillo y se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente. La titulación se determinó como la dilución más alta de suero que causa IH completa.

Elisa

Se realizaron ELISAs contra NDV (laboratorios IDEXX, EE. UU.) en todas las muestras de suero a temperatura ambiente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se dispensaron 100 μl de cada muestra de suero (diluido 1: 500 en DPBS) y 100 μl de las muestras de control positivo y negativo fueron dispensadas en pocillos por duplicado y se incubaron durante 30 min. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con 100 μl de conjugado por pocillo durante 30 min. Los pocillos se lavaron tres veces y luego 100 μl de la solución sustrato se añadió a cada pocillo, se incubó en la oscuridad durante otros 30 minutos, después de lo cual se añadieron 100 μl de solución de parada inmediatamente. Las placas se leyeron usando un lector de microplacas Epoch 2 (Biotek, EE. UU.) a 450 nm. Los datos obtenidos se analizaron y se calculó la proporción de muestra a positiva (S/P).

Análisis estadístico

La prueba de t-student se realizó para comparar el título promedio de cada tiempo de la curva de la cinética de crecimiento. Se realizaron regresiones lineales para el análisis de la correlación entre títulos de la NT y la eGFP-NT, el IH y el ELISA. Todos los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Resultados

Construcción y caracterización del rLS1 recombinante NDV

El clon de NDV de longitud completa pFLC-LS1 se ensambló en tres fragmentos a través de varios sitios de restricción, como se representa en la Fig. 1. Usamos un sistema de promotor de ARN polimerasa II para recuperar el virus, como se reportó previamente para NDV [32, 33], lo que permitió que el virus se rescatara en un modo independiente de ARN polimerasa T7. Sitios únicos de restricción creados o destruidos por mutaciones silenciosas en el clon de longitud completa como marcadores genéticos (véase la Tabla 1) se verificaron mediante la secuenciación del ADN. Este clon de longitud completa, junto con los plásmidos de soporte, se usó para transfectar células DF-1. Tres días después de la transfección, se observó el efecto citopático (ECP) y se recuperó rLS1 recombinante a un título alto después del primer pase en huevos de gallina (1 x 108 PFU / mL). El ensayo de inmunofluorescencia de las células infectadas fue positivo cuando se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal específico de NDV contra el complejo RNP, confirmando la presencia de NDV (Fig. 3a). Para verificar la identidad del virus rLS1 y descartar cualquier posible contaminación por otra cepa de NDV, es decir, LaSota, dos de los marcadores genéticos se evaluaron mediante RT-PCR y digestión con enzimas de restricción (Fig. 3b). La ausencia de sitio BssHII y la eliminación del sitio de restricción BbvCI se verificaron mediante RT-PCR, seguido de digestión con enzimas de restricción, usando la cepa LaSota como control (Véase la Fig. 3b). Además, se realizó la secuenciación de estos fragmentos de ADN amplificados con el fin de confirmar la existencia de marcadores genéticos, lo que demuestra que el virus rLS1 se derivaba ciertamente del plásmido pFLC-LS1.

Construcción y caracterización del reportero rLS1-1eGFP NDV

Para obtener altos niveles de expresión del eGFP, insertamos el casete eGFP en la primera posición dentro del genoma del NDV. La construcción pFLC-LS1-1eGFP se ensambló correctamente, tal que se verificó por secuenciación completa del plásmido, y se usó para la transfección de células DF-1.

Fig. 3 Identificación del virus recuperado rLS1. a Células DF-1 infectadas con rLS1 a una MOI de 0,01. Después de 48 h, las células fueron fijadas y se detectó la presencia de NDV usando un anticuerpo monoclonal específico contra la ribonucleoproteína. Las células infectadas mostraron fusión celular y formación de sincitios (flecha amarilla) × 200. b Confirmación  de la recuperación del virus rLS1 mediante RT-PCR y digestión con enzimas  de restricción. El ARN genómico aislado del virus recuperado rLS1 y de LaSota se amplificó mediante RT-PCR con cebadores específicos que cubren los sitios de restricción creados (carriles 1 y 3) o destruidos (carriles 2 y 4) y los productos fueron analizados en un gel de agarosa al 2%. Carril M: marcador de tamaño molecular de 50 pb; carril 1: BssHII para rLS1 (192 pb y 103 pb); carril 2: BbvCI para rLS1 (969 pb); carril 3: BssHII para LaSota (295 pb); carril 4: BssHII para LaSota (573 pb y 396 pb)

El sobrenadante de transfección que contenía el virus rLS1-1eGFP luego se pasó en huevos embrionados con SPF. La recolección de FA contenía un título de 4.8 × 108 PFU /mL, similar al virus parental. Los embriones de pollo infectados con rLS1-1eGFP observados bajo un transiluminador mostraron altos niveles de expresión de eGFP en el cordón umbilical (Fig. 4a). También se ha informado de la replicación en células madre del cordón umbilical para otros virus como Influenza, hepatitis B y virus del herpes simplex [34-36]. Para NDV, dado que el cordón umbilical de pollo está conectado con la membrana corioalantoidea, es posible que las células madre de cordón umbilical permitan la replicación del virus en niveles altos y luego las liberen en el fluido alantoideo.

Comparación de la cinética de crecimiento de los virus recuperados, realizaron en células DF-1 a una MOI de 0,05. Ambos virus exhibieron características de crecimiento similares. Sin embargo, rLS1-1eGFP mostró títulos significativamente más bajos que rLS1 (p <0,01) a las 24 y 36 h.p.i. (Fig. 4b). Los títulos más altos logrados en cultivo celular para ambos virus fueron aproximadamente 106 UFP /ml (figura 4b), mientras que los títulos en FA recolectados de huevos embrionados SPF fueron de al menos 108 UFP / mL (datos no mostrados).

La correlación entre el nivel de expresión de eGFP y la eficacia de la replicación viral se evaluó mediante la infección de células DF-1 a diferentes MOI con rLS1-eGFP, y el registro de estas células cada 12 h. La intensidad y el número de células que expresan eGFP aumentaban de una manera dependiente del tiempo y de la dosis (Fig. 4c). La expresión de eGFP se puede visualizar claramente ya a las 24 h.p.i., aunque se puede detectar con baja expresión a las 12 h.p.i. Estos resultados indican que la expresión de eGFP se puede usar para controlar la replicación viral.

Fuerte correlación entre NT convencional y eGFP-NT

Convencional y eGFP-NT se evaluaron primero mediante el uso de muestras diluidas de suero de pollo de referencia. Las muestras de suero de referencia, positivas a otros patógenos (IBV, MDV, adenovirus aviar tipo 1 e ILTV) y de un pollo SPF, se usaron para evaluar la neutralización inespecífica. Estos sueros dieron negativo, como se esperaba, para ambos métodos de neutralización. La fluorescencia en eGFP-NT era visible tan pronto como 18 h de incubación, y era claramente visible a las 24 h.

Para evaluar la eficacia del virus rLS1-1eGFP para medir los títulos de nAb, el convencional y eGFP-NT se realizaron utilizando un total de 57 muestras de suero. La mayoría de las muestras presentaron el mismo título de neutralización cuando se midieron con ambas técnicas. Además, la correlación entre el NT convencional y el NT-eGFP fue muy alta (R2 = 0,994), como se muestra en la figura 5a. Por lo tanto, concluimos que rLS1-1eGFP se puede utilizar como un virus informador para determinar títulos de nAbs con gran fiabilidad.

IH y ELISA tienen fuertes correlaciones con NT convencional pero presentan mayor dispersión que NT-eGFP

Se evaluaron las correlaciones entre los títulos de nAbs y los títulos de anticuerpos medidos por IH y ELISA. En la Fig. 5b, se muestra la relación entre log2 IH y log2 NT. Se observó una fuerte correlación (R2 = 0.816) entre los títulos NT e IH. Además, varias muestras que resultaron positivas al ensayo IH, con títulos correspondientes a diluciones de hasta 1:8, fueron negativas para la neutralización. Estos resultados son consistentes con el hecho de que la ecuación de la línea (Y = 0.816X + 1.238) muestra que cuando NT es 0, en promedio, los títulos IH serían positivos y mayor de un título correspondiente para una dilución de 1:2. Vale la pena mencionar que las muestras de suero positivas para IH y negativas para el ensayo TN vinieron de pollos vacunados, sugiriendo que ya sea nAbs no estén circulando en ese momento porque las células plasmáticas se convierten en memoria B Existen células o anticuerpos específicos contra NDV, pero estos no son nAbs.

Los títulos de anticuerpos medidos por ELISA (S/P) también tienen una fuerte correlación (R2 = 0.791) con los títulos log2 NT (Fig. 5c). Ambos IH como ELISA mostraron una mayor dispersión al NT convencional que el eGFP-NT. Estos resultados indican que IH y ELISA no son tan confiables como eGFP-NT, lo que demuestra que este método puede cerrar la brecha entre una medición rápida y precisa de nAbs contra NDV.

Fig. 4 Caracterización del virus rLS1-1eGFP. a Embrión de pollo SPF infectado con rLS1 y rLS1-1eGFP. Los embriones fueron inoculados a los 9 días de edad e incubados por 3 días. La expresión de eGFP se observó claramente en el cordón umbilical de los embriones. b Comparación de la cinética de crecimiento de rLS1 y rLS1-1eGFP. Las células DF-1 se infectaron con una MOI de 0,05 y el sobrenadante fue colectado en intervalos de 12 horas post-infección y se tituló mediante ensayo en placa. Los datos fueron tomados en tres experimentos independientes. La significancia estadística (p <0,01) fue denotada con dos asteriscos. c Correlación entre la expresión de eGFP y diferentes MOI y tiempos de infección. Las células DF-1 se infectaron con rLS1-1eGFP en las MOI indicadas y se observó la expresión de eGFP a las 12, 24, 36 y 48 h.p.i.

Discusión

NDV es una de las principales amenazas para la industria avícola en todo el mundo y cada año se descubren nuevos genotipos y subgenotipos [37]. En América del Sur, el virus circula actualmente [38-41] y existe una necesidad urgente de mejorar las vacunas, así como la bioseguridad y la vigilancia. La relevancia de los nAbs en la protección y contra la diseminación viral han sido bien establecidas [8, 12, 16]. Por lo tanto, las vacunas contra NDV deberían ser capaces de inducir títulos altos de nAb. Un método rápido y fácil de realizar para medir nAbs ayudará a evaluar nuevos candidatos a vacunas. En este contexto, hemos desarrollado un nuevo vector (rLS1), que puede aceptar inserciones en todas las regiones intergénicas. Más tarde, el gen eGFP fue incorporado antes del gen N en el genoma del virus rLS1, generando el rLS1-1eGFP. Elegimos esa posición para producir altos niveles de eGFP proteína [25]. Este virus se usó para desarrollar eGFP-NT para medir nAbs.

Fig. 5 Comparación del NT  convencional con el NT-eGFP, IH y ELISA de 57 muestras de suero de pollo. a Correlación entre NT convencional y NT-eGFP. Los títulos de neutralización (eje X) se dan como el log2 de la dilución de suero recíproca en la que se inhibe el 100% de ECP. Los títulos de eGFP-NT (eje Y) se dan como log2 de la dilución de suero recíproca máxima en la que todos los pocillos muestran la expresión de no eGFP. b Correlación de NT y IH convencionales. Los títulos de IH (eje Y) se dan como el log2 de la dilución de suero recíproca máxima en la que se inhibe la hemaglutinación. c Correlación entre títulos de NT (eje X) y títulos de ELISA (eje Y). El ELISA se da como la relación S/P

En nuestras manos, el NT convencional tardó 4 días en distinguir los pozos infectados de los no infectados, los que fueron difíciles de leer en los pocillos teñidosde placa de neutralización. Por el contrario, los resultados de la eGFP-NT se pueden obtener en un día. Establecimos 24 h.p.i. como un tiempo conservador para observar las células infectadas para medir los títulos de nAb porque en este momento la expresión de la eGFP es muy obvia en los pocillos positivos. Sin embargo, obtuvimos los mismos títulos de nAb cuando fueron medidos a las 18 h o más tarde (datos no mostrados). Para la NT convencional, la dificultad para diferenciar claramente los pocillos infectados de los no infectados en diluciones limitantes puede conducir a un sesgo del operador. Por el contrario, la eGFP-NT es una herramienta confiable, en la cual la fluorescencia se puede detectar fácilmente, minimizando el sesgo del operador.

El NT convencional mostró una correlación más fuerte con eGFP-NT (R2 = 0.994) que con respecto al ELISA (R2 = 0.791) o al IH (R2 = 0.816). Aunque nuestros datos sugieren buenas correlaciones entre los nAbs y el IH o el ELISA, hay una ventana de incertidumbre con títulos bajos en ambos casos. En base a nuestras regresiones, los ensayos de IH sobrestiman y el ELISA subestima los títulos de NT. Además, estas ecuaciones pueden verse muy afectadas en función del origen del inmunógeno responsable de inducir la respuesta humoral. Varios grupos han demostrado que los títulos de anticuerpos medidos por ELISA o IH no se corresponden necesariamente con los títulos de nAbs de NDV [8, 12, 13]. Nuestros resultados también muestran que el IH tiende a producir resultados positivos en algunas muestras con títulos negativos de nAb, y tanto el IH como el ELISA tienen una gran dispersión con respecto a NT. Por el contrario, eGFP-NT tiene una ventaja evidente sobre el IH o el ELISA porque muestra claramente la presencia de nAbs inducidos después de la vacunación. Es muy probable que las correlaciones cambien drásticamente cuando se utilicen vacunas de  NDV por subunidades o de virus-vectorizados para la inmunización contra NDV, ya que solo se mostrarán algunos epítopos, pero no necesariamente inducirán la producción de anticuerpos que puedan ser detectados por IH o ELISA. Por ejemplo, vectores basados en el paramixovirus aviar tipo 3 que portan las proteínas F o HN o la combinación de ambos vectores fueron capaces de inducir títulos de nAbs similares al grupo control vacunado con LaSota-NDV, pero no lograron obtener títulos de ELISA [42]. En otro estudio, se probó una vacuna basada en partículas virales (VLP) de la proteína F de NDV y la proteína M1 de influenza en pollos SPF, lo que resultó en niveles bajos de títulos de anticuerpos contra NDV por ELISA, sin embargo se demostró que las aves estaban completamente protegidas [43]. Se han observado resultados similares en vacunas de NDV vectorizado en Fowl pox [44] y en un baculovirus que expresa la proteína F [10].

Recientemente, un VIH pseudotipado fue diseñado para expresar las proteínas F y HN de NDV junto con la luciferasa como proteína reportera, y este virus se utilizó para ensayos de neutralización [45]. En nuestro caso, hemos diseñado el vector NDV de tal manera que puede aceptar inserciones en casi todas las regiones intergénicas y uno puede intercambiar genes F y HN de diversos donantes. El plásmido pFLC-LS1-1eGFP, que contiene el gen eGFP reportero en la estructura del NDV, tiene sitios de restricción únicos que flanquean los genes F (BssHII y MluI) y HN (MluI y SnaBI), que pueden usarse para reemplazar fácilmente los genes de otros genotipos. Además, el uso de un NDV reportero que expresa la eGFP tiene algunas ventajas en comparación con el vector de lentivirus pseudotipado que se usó para los ensayos de neutralización: 1) La producción del virus rLS1-1eGFP es técnicamente fácil, ya que el virus crece a títulos altos en ambos cultivo celular y huevos embrionados, lo que nos permite preparar grandes reservas virales. Por el contrario, los lenitivirus requieren un nuevo procedimiento de transfección para generar el virus reportero cada vez que se realice el ensayo [20]. 2) Como se mencionó anteriormente, la eGFP-NT es más económico y no requiere reactivos adicionales. Por el contrario, los lentivirus que expresan la enzima luciferasa requieren kits reporteros para luciferasa y un luminómetro para ser cuantificados. 3) El rLS1-1eGFP puede usarse para ensayos de alto rendimiento midiendo las células positivas a la eGFP con un lector de fluorescencia directamente en placas sin ninguna tinción [18, 20, 21]. 4) Finalmente, el vector rLS1-1eGFP se puede usar para expresar F y HN foráneos en un contexto natural en lugar de utilizar un sistema sustituto, que podría no reflejar el mismo mecanismo de entrada y, por lo tanto, la eficacia infecciosa.

Conclusiones

Generamos un NDV recombinante que alberga la eGFP a partir de un cDNA clonado y desarrollamos una prueba de neutralización basada en la expresión de la eGFP (eGFP-NT) para la detección y cuantificación rápida de nAbs contra NDV. Esta nueva prueba es simple, económica y precisa, lo que la hace adecuada para probar nuevos candidatos a vacunas contra el NDV. El eGFP-NT puede implementarse en laboratorios con equipamiento de cultivo celular básico y un microscopio de fluorescencia. Hasta el momento, es el método más rápido para evaluar nAbs para NDV, con una alta correlación con la prueba de neutralización convencional.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Ángela Montalván y Edison Huaccachi por su excelente asistencia técnica.

Financiado

Este estudio fue parcialmente financiado por el Programa de Ciencia y Tecnología del Perú. (FINCyT) Nº contracto ITAI-2-P-050-009-15.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

Contribuciones de los autores

AC, RI-L, MF-D y VV contribuyeron a la concepción y diseñaron la investigación. AC, RI-L y KC adquirieron los datos del estudio. AC y RI-L analizaron los datos y todos los autores los interpretaron. AC, RI-L y VV redactaron el documento, y todos los autores revisaron críticamente, leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Consentimiento para publicación. No aplica.

Aprobación de ética y consentimiento para participar. No aplica

Conflicto de intereses. Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Referencias. Contactar con los autores

 
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