engormix
search
search
El servicio no esta disponible para contactar a esta empresa desde Estados Unidos de América

Cómo elegir el mejor probiótico para su operación

Publicado el: 30/4/2021
Autor/es: Maria Aparecida Melo Iuspa, Brasil e I+D, Hanau - Alemania

La modernización de la industria avícola durante los últimos años ha impulsado la producción de pollos de engorde que cada vez son más eficientes en la conversión del alimento en carne. El progreso de las líneas modernas de pollos de engorde es el resultado de años de desarrollo e investigación en el ámbito genético, de una mejor gestión nutricional y de mejoras en las condiciones ambientales y sanitarias.

La composición del microbiota de las aves está influenciada desde la incubadora. En la producción comercial, los pollitos nacen en un entorno controlado con baja carga microbiana y lejos de sus madres, lo que significa que no tienen un contacto natural con la microbiota de sus padres. Por el contrario, las aves criadas en condiciones no comerciales y/o silvestres están expuestas desde una edad temprana a la microbiota natural procedente de sus padres y de su entorno. En esta situación, las bacterias beneficiosas son capaces de colonizar el intestino inmediatamente después de la eclosión. Dado que los pollitos producidos comercialmente no tienen este contacto, son más susceptibles a todo tipo de colonización microbiana que puede conducir a la contaminación del tracto digestivo con bacterias potencialmente patógenas. Una vez que las bacterias patógenas colonizan el intestino, la digestión y el crecimiento pueden verse afectados. En esta situación, sin el uso de aditivos que eviten la colonización del intestino por estos patógenos, tenemos un mayor reto para producir de forma rentable.

La práctica común ha sido siempre el uso de antibióticos para mejorar el rendimiento, utilizados continuamente en dosis subterapéuticas. Su aplicación en la producción animal ocurre desde la década de 1950, cuando los investigadores de la época encontraron que promovían un mejor crecimiento y eficiencia productiva (Castanon, 2007). El efecto positivo de los antibióticos para mejorar el rendimiento de los alimentos balanceados está relacionado principalmente con el hecho de que actúan en la prevención de la colonización de patógenos en el intestino, lo que permite una mayor disponibilidad de nutrientes para el crecimiento y la deposición muscular, en lugar de ser utilizados para la activación del sistema inmunitario.

La práctica común ha sido siempre el uso de antibióticos para mejorar el rendimiento, utilizados continuamente en dosis subterapéuticas. Su aplicación en la producción animal ocurre desde la década de 1950, cuando los investigadores de la época encontraron que promovían un mejor crecimiento y eficiencia productiva (Castanon, 2007). El efecto positivo de los antibióticos para mejorar el rendimiento de los alimentos balanceados está relacionado principalmente con el hecho de que actúan en la prevención de la colonización de patógenos en el intestino, lo que permite una mayor disponibilidad de nutrientes para el crecimiento y la deposición muscular, en lugar de ser utilizados para la activación del sistema inmunitario.

Desde la prohibición de la UE en el 2006, se han estudiado varias alternativas a los antibióticos para promover una buena microbiota. Los probióticos en el alimento balanceado y/o el agua han sido una opción muy popular para sustituir a los antibióticos que mejoran el rendimiento. Se definen como productos que contienen cepas vivas que actúan beneficiosamente sobre el animal mejorando el equilibrio intestinal, lo que favorece la mejora del desempeño y la prevención de patógenos entéricos. Como consecuencia de ello, vemos una enorme lista de opciones en el mercado, compuestas por una o múltiples cepas y con una variedad de beneficios y mecanismos de acción para el huésped, incluyendo el control de patógenos.

La definición de probiótico ampliamente aceptada y utilizada por la comunidad científica fue dada por la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación) en 2001, definiendo a los probióticos como microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren beneficios a la salud del huésped (Hill et al., 2014). Las bacterias son los microorganismos más utilizados como probióticos, pero las levaduras y los hongos también pueden utilizarse con este fin.

La definición de probiótico ampliamente aceptada y utilizada por la comunidad científica fue dada por la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación) en 2001, definiendo a los probióticos como microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren beneficios a la salud del huésped (Hill et al., 2014). Las bacterias son los microorganismos más utilizados como probióticos, pero las levaduras y los hongos también pueden utilizarse con este fin.

.- Estabilidad térmica
.- Resistencia a un pH bajo, como el de la molleja
.- Tolerancia a la bilis
.- Crecimiento en presencia de ácidos grasos de cadena corta
.- Producción de enzimas
.- Inhibición de patógenos
.- Expresión de metabolitos secundarios
.- Sensibilidad a los antibióticos
.- Ausencia de genes de resistencia a los antibióticos y producción de toxinas.

Como ejemplo de este proceso de investigación tenemos en este estudio la evaluación del mecanismo de Quorum quenching (QQ) de la cepa CECT 5940 de Bacillus amyloliquefaciens, que tiene una capacidad inherente para producir una amplia gama de metabolitos secundarios que han demostrado interactuar con diferentes poblaciones bacterianas.

El quórum sensing (QS) es un sistema de comunicación entre células bacterianas basado en la producción y secreción de moléculas de señalización denominadas autoinductores, que se acumulan en el entorno extracelular cuando se alcanza una alta densidad celular bacteriana (Fuqua et al., 1994). Al alcanzar una concentración intracelular umbral de autoinductores, la molécula de señalización desencadena la expresión sincronizada de múltiples genes en la población, regulando así importantes funciones biológicas como la transferencia de plásmidos, la motilidad, la agregación, la luminiscencia, la biosíntesis de antibióticos y la virulencia (Swift et al., 2001; Waters y Bassler, 2005; Williams et al, 2007). Los autoinductores de tipo 1 mejor caracterizados son las N-acil-homoserina lactonas (AHL), una familia de moléculas formadas por un anillo de homoserina lactona (HSL) N-acilado con un grupo graso acil en la posición alfa. Los mecanismos que conducen a la inactivación del sistema de comunicación QS se denominan comúnmente Quorum Quenching (QQ) (Dong et al., 2001, 2007), aunque algunos autores prefieren restringir el término a la degradación enzimática de las señales AHL (Kjelleberg et al., 2008). Uno de los posibles mecanismos de acción de los probióticos es el QQ, que bloquea la comunicación (es decir, el quorum sensing) entre las bacterias patógenas, impidiendo así su crecimiento, la formación de biopelículas y la expresión de virulencia.


Materiales y métodos

Cepas utilizadas

Probiótico: Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940
Biosensor: Chromobacterium violaceum CECT 5999 (CV026) (McClean et al., 1997)

La cepa de tipo salvaje de Chromobacterium violaceum produce un pigmento violeta (violaceína) y su producción se regula a través de la QS La cepa utilizada en el estudio era un mutante de esta especie que perdió su capacidad inherente de producir el pigmento violeta y, por tanto, se denomina mutante blanco (CV026). Sin embargo, este mutante puede ser inducido a producir violaceína aplicando AHLs al medio de cultivo.

Homoserinas lactonas sintéticas (compuestos comerciales análogos a las AHL):

- C6-HSL: N-hexanoil-L-homoserina lactona (Sigma-Aldrich 09926) - C8-HSL: N-octanoyl-L-homoserina lactona (Sigma-Aldrich 10940)

Estos compuestos (inductores) se prepararon como soluciones madre en agua destilada estéril a una concentración de 1 mg/ml para C6-HSL y a 0,7 mg/ml para C8-HSL.

Cribado de Quorum Quenching (Florez et al., 2014):

Crecimiento de Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 con análogos:
El Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 se incubó durante 24 horas a 30°C en medio LB (Luria Bertani) en frascos de 250 mL con 50 mL de medio de cultivo. Este preinóculo se utilizó para inocular un nuevo matraz con 25 mL de LB para mantener una DO600 de aproximadamente 1,1. Los análogos de las AHL (autoinductores), C6-HSL o C8-HSL, se añadieron al medio de cultivo a una concentración final de 4 µg/mL y se incubaron a 30°C con agitación. Las muestras se recogieron a diferentes intervalos: 0 (inmediatamente después de la adición del inductor) y a las 1, 2, 4, 6 y 24 horas. Las muestras recogidas se centrifugaron individualmente a 3000 rpm durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se recuperó tras la centrifugación.

Ensayo de detección:
Las placas de agar LB se sembraron con 4 mL de LB al 0,8% que contenían 1 mL del cultivo indicador de C. violaceum en LB con 25 μg/mL de Canamicina. Las placas permanecieron en reposo hasta la solidificación del medio de cultivo. Tras la solidificación del medio, se prepararon pocillos de 6 mm en las placas para la posterior inoculación con una pipeta y puntas estériles de 50 μL de las diferentes muestras del sobrenadante de la incubación de B. amyloliquefaciens CECT 5940 con los inductores, recogidos a intervalos de tiempo crecientes (0, 1, 2, 4, 6 y, 24 horas). A continuación, las placas se incubaron a 30 °C durante 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo indicador.

Controles e interpretación de los resultados:
Los pocilllos con halos de color violeta indicaban que la QS había tenido éxito y no había QQ. Cuando había actividad QQ en las muestras añadidas a los diferentes pocillos, los halos eran opacos e incoloros, aunque el inductor estaba presente.

En el ensayo de detección, se utilizaron los controles descritos a continuación y en la Tabla 1 se detalla el color esperado en la prueba y la nomenclatura utilizada en las placas (entre paréntesis).

Tabla 1: Muestras probadas y color esperado.

Cómo elegir el mejor probiótico para su operación - Image 1
1 La ausencia de un halo violeta indica que el QS estaba bloqueado

  • Halo opaco incoloro (ausencia de inductor)

- Agua destilada estéril (A). Halo opaco sin color porque el mutante es blanco y no hay molécula inductora. - Medio de cultivo LB estéril (M). Halo opaco incoloro, porque no hay inducción. - Medio de cultivo LB + probiótico (sin inductor). Los cultivos probióticos se incuban durante el mismo número de horas que el probiótico de prueba con las moléculas inductoras de C6-HSL o C8-HSL de la muestra y se utilizan como control para verificar que el probiótico produce compuestos que estimulan la producción de violaceína, causando un resultado falso negativo. Se espera que estos controles tengan un halo opaco e incoloro. Se etiquetan con una "E", seguida del tiempo de incubación en horas (Exhoras)

  • Halo violeta (presencia de inductor)

- Moléculas inductoras (C6-HSL o C8-HSL). Se espera que el halo sea violeta porque estos compuestos son inductores de la violaceína. - Medio de cultivo LB + C6-HSL o C8-HSL. Estos cultivos se incuban durante el mismo número de horas que el probiótico de prueba con C6-HSL o C8-HSL para verificar la degradación del inductor en el tiempo en ausencia del microorganismo. Se espera que estos controles tengan halos violetas. Se etiquetan con una "M" seguida del tiempo de incubación en horas (Mxhoras)

Las muestras de ensayo (molécula inductora + probiótico) están etiquetadas únicamente con el número de horas de incubación: 0, 1, 2, 4, 6, 24. Dado que el inductor está presente, se espera que el halo sea de color violeta y la ausencia de este pigmento indica que el QS fue bloqueado por un mecanismo QQ.


Resultados y discusión

El ensayo realizado permitió visualizar claramente la capacidad de un compuesto para bloquear la inducción de la QS mediante la inhibición de la producción de violaceína.

Se analizaron los efectos de los sobrenadantes de cultivo del probiótico B. amyloliquefaciens CECT 5940 en presencia de inductores C6-HSL y C8 -HSL a diferentes tiempos de incubación.

Los pocillos con agua (A), medio de cultivo (M) o medio de cultivo con sólo la cepa B. amyloliquefaciens CECT 5940 (E0-24 horas) no produjeron pigmento (Figura 1). Esto era de esperar, ya que estos pocillos no contenían el inductor C6-HSL o C8-HSL, y la cepa mutante de C. violaceum por sí sola no produce ningún compuesto que estimule la producción de violaceína.

Cuando se añadió el inóculo con el inductor C6-HSL a los pocillos y se incubó durante 24 horas (M0-24), se observó un halo pigmentado en todos los pocillos (Figura 1). Esto sugiere que el inductor C6-HSL no se degrada con el tiempo porque el halo de violaceína se observó incluso después de 24 horas de incubación.

En los pocillos en los que se inoculó el medio de cultivo con la cepa B. amyloliquefaciens CECT 5940 y el inductor C6-HSL (0-24), se observó un halo pigmentado en las muestras con tiempos de incubación de hasta 6 horas, lo que demuestra que la C6-HSL estaba presente y estimulaba la producción de violaceína. Sin embargo, tras 24 horas de incubación del inductor C6-HSL o C8-HSL con B. amyloliquefaciens CECT 5940, el pigmento dejó de observarse, lo que indica que la cepa probiótica impedía la producción de violaceína y, por tanto, tenía actividad QQ.

Cuadro 2: Muestras analizadas y resultados

Cómo elegir el mejor probiótico para su operación - Image 2
- La ausencia de un halo violeta indica QQ (QS ha sido bloqueado)

Cómo elegir el mejor probiótico para su operación - Image 3

Figura 1. Inducción de la síntesis de violaceína por la cepa CV0526 de C. violaceum mediante HSLs sintéticas (C6-HSL) e inhibición. A: agua destilada; M: medio LB; M0-24: medio LB + C6-HSL a diferentes tiempos de incubación; E0-24: medio LB + la cepa B. amyloliquefaciens CECT 5940 sin C6-HSL a diferentes tiempos de incubación; 0-24: medio LB + cepa B. amyloliquefaciens CECT 5940 + C6-HSL a diferentes tiempos de incubación.

Los resultados de este estudio demuestran la actividad de quórum quenching (QQ) de B. amyloliquefaciens CECT 5940 sobre C. violaceum CECT 5999 (CV026), utilizando C6-HSL o C8-HSL como sustrato. El ensayo se repitió utilizando C8-HSL como inductor y se obtuvieron los mismos resultados.

Referencias bibliográficas

 
remove_red_eye 140 forum 0 bar_chart Estadísticas share print
Compartir:
close
Ver todos los comentarios
Productos
ESTABILIZANDO LA FLORA INTESTINAL CON PROBIÓTICOS  Ecobiol®...