Estudio Inmunohitoquímico Comparativo de Pulmones Naturalmente Infectados por Virus de Influenza A H1N1 pdm y Subtipos Recombinados Aislados en la Argentina

El virus de influenza porcina (SIV) es un patógeno primario del tracto respiratorio del cerdo, siendo los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 los más prevalentes (1). La severidad de los signos clínicos y de la lesión pulmonar depende de la dosis infecciosa, el nivel anatómico de exposición y el estatus inmunitario. Si bien el aislamiento viral es considerado la prueba gold estándar para el diagnóstico de SIV, requiere tiempo y laboratorios especializados. La detección de antígeno viral por técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) ofrece las ventajas de poder cuantificar la presencia del antígeno viral y relacionarla con la microanatomía pulmonar y la severidad de las lesiones producidas (2).

El objetivo del trabajo fue comparar, por medio de la técnica de IHQ, el nivel anatómico y el grado de inmunomarcación en pulmones infectados naturalmente con SIV H1N1pdm y sus recombinantes BsAs/H1N1 y StaFe/H1N2. 

 

Se realizó el estudio IHQ sobre muestras de pulmones procedentes de 18 cerdos con lesiones sospechosas y rRT-PCR positivas a SIV. Siete casos correspondieron a H1N1pdm, 5 casos a BsAs/H1N1 y 6 casos a StaFe/H1N2. Se utilizó un  suero monoclonal anti-nucleoproteína (NP) influenza A (Millipore) en dilución 1:400 y, como sistema de revelado, LSAB2 (Dako Cytomation, Ca, USA). De cada muestra se examinaron 5 campos. Los resultados de IHQ se expresaron en grados de 0 a 3, en función a la cantidad (nula, escasa, moderada, abundante) de células inmunomarcadas presentes en bronquios (BR), bronquiolos grandes (BG), medianos (BM), pequeños (BP) y alvéolos (ALV). Se realizó lectura ciega, sin conocimiento del origen de las muestras.

Los resultados se analizaron por la técnica de inferencia Bayesiana mediante software WinBUGS (3).

 

A nivel del BR, la inmunomarcación fue significativamente mayor en H1N2/StaFe vs H1N1/Bs.As y H1N1pdm, que no difirieron entre sí. En los BG, H1N1/Bs.As y H1N2/StaFe, fueron significativamente  mayores que H1N1pdm. En los BM, H1N1/Bs.As. seguido de H1N2/StaFe, fueron significativamente mayores que H1N1pdm y en los BP, H1N2/StaFe seguido de H1N1/BsAs, fueron significativamente mayores que H1N1pdm. A nivel de ALV, la inmunomarcación fue significativamente mayor en H1N2/StaFe vs H1N1/BsAs y H1N1pdm, estos últimos, no difirieron entre sí. Considerando los BR, bronquiolos y ALV, los bronquiolos fueron los niveles anatómicos blanco para la visualización del virus de influenza. Analizando en conjunto los 3 virus, la inmunomarcación fue significativamente mayor en H1N2/StaFe que H1N1/BsAs y H1N1pdm. Estos dos últimos, no difirieron entre sí.

 

En la infección por SIV, el nivel anatómico de multiplicación viral está determinado por la presencia de receptores α2,6 GalNAc para la HA del virus en las células epiteliales del tracto respiratorio y del pulmón (1, 2) así como por el curso de la infección. Al inicio, 1-3 días posinfección (dpi), el virus se multiplica en el epitelio bronquial y bronquiolar; mientras que a los 7-10 dpi, en neumocitos y macrófagos (2, 4). El mayor grado de inmunomarcación en BR, bronquiolos y ALV observado en los casos de infección por los virus recombinantes H1N2/StaFe y H1N1/BsAS en comparación con H1N1pdm, no se  correspondió con la severidad de las lesiones (4). En efecto, las lesiones en BR, bronquiolos y ALV en la infección por H1N1pdm fueron estadísticamente más severas que las observadas con ambos virus recombinantes (4). En SIV, la carga viral condiciona la severidad de los signos y lesiones mediante la producción de citoquinas proinflamatorias (IFN-α,TNF-α, IL-1, IL-6) por sobre las anti-inflamatorias (IL-4, IL-10, IFN-γ) (5). En los virus recombinados una desregulación en la producción de estos mediadores químicos explicaría lo observado. Estudios experimentales permitirán evaluar la consistencia de estas observaciones. 

1.- Olsen, CW y col. Diseases of Swine 9th Ed. Blackwell Publishing, Iowa, USA. 2006.
2.- Jung T y col.. Vet Pathol 39:10-16, 2002
3.- Ntzoufras L. Bayesian Modeling Using WinBUGS. John Wiley&Sons,Inc., Hoboken, New Jersey, p 526, 2009
4.- Cappuccio, J.y col. Proceedings International. Symposium on Emerging.and Re-emerging. Pig Diseases. Spain 2011.pp 246.
5.- Jo, S.K et al. Virus Res.197:64-70, 2007