Ayudas diagnósticas en la medicina de los animales de producción: Parte III

En entregas previas, tratamos los puntos fundamentales al momento de colectar las muestras ante un evento sanitario en animales de producción (Parte I) y nos referiremos a la definición, tipos, indicaciones de elección, interpretación y limitaciones de tres tipos de pruebas diagnósticas frecuentemente utilizadas hoy en día (ELISA, PCR y CULTIVO; Parte II). En la presente entrega (Parte III y final), se muestra la manera de interpretar los resultados a estos tres tipos de pruebas diagnósticas.

En un reporte de resultados de ELISA típico, usualmente se pueden tener los siguientes datos:

Conteo: Es el número de muestras que se han utilizado para realizar la prueba. En este parámetro no se incluyen los controles positivos y negativos presentes en la placa. Generalmente, se usan 20 muestras para una población infinita, en la cual se quieren estudiar enfermedades con prevalencias del 10 al 15% y niveles de confianza del 95%. Dependiendo de la situación sanitaria de la granja, el número de muestras puede aumentar para volver más fiable el análisis estadístico y la inferencia a partir de los datos obtenidos.

Media o promedio: Es el promedio de los títulos obtenidos al analizar la muestra, expresados en UI/mL.

Gmedia: Es el promedio geométrico de los títulos de los sueros analizados. En este parámetro se restringen los valores máximos y mínimos no significativos de la muestra, con lo que se obtiene un resultado más cercano a la realidad, siempre que la muestra sea uniforme. Es por esto, que los resultados obtenidos acá deben ser analizados juntamente con los otros resultados estadísticos.

DS (desviación estándar): Expresa la medida de la dispersión para un conjunto de datos, es decir, que tan lejos de la media podrían estar los valores que están siendo analizados. Este valor es uno de los más importantes y nos da una primera idea de la forma en la que están agrupados los datos de la muestra que se está analizando.

%CV (coeficiente de variación en porcentaje): El rasgo más importante de este parámetro es que incluye los valores de Gmedia y DS, representado lo grande que es la DS en comparación a la media.

Mínimo: Es el valor más bajo encontrado en el análisis de la muestra.

Máximo: Es el máximo valor encontrado en el análisis de la muestra.

Como los resultados obtenidos en una prueba de ELISA pueden variar entre zonas geográficas, sistemas productivos y granjas, no es posible hablar en términos absolutos sobre los valores esperados, aunque sí existen rangos razonables para algunas enfermedades en animales. Por esto, es necesario partir de los datos históricos de la explotación y con ellos realizar una curva consolidada del comportamiento inmunológico de los lotes, que constantemente deberá ser retroalimentada. Esta curva o “línea base” servirá como referencia para mejorar o conservar los procesos, una vez que se analicen los resultados al ELISA y su contraste con los parámetros productivos.

Aunque el procedimiento a realizar es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que, de no ajustarse correctamente, pueden afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba, con la posibilidad de generar tanto falsos positivos como falsos negativos.

Como prueba diagnóstica —independiente del formato que se use, el ELISA cuenta con diversas limitaciones. En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos (Ac) no significa necesariamente que el animal (o el lote) esté enfermo (clínicamente hablando). El individuo, ya sea tras una vacunación, enfermedad o reto de campo, que no progresa a un cuadro clínico, puede producir Ac específicos. De no saberse interpretar, esto podría llevar a un falso positivo. En segundo lugar, hay individuos y agentes infecciosos que producen una baja cantidad de Ac, por lo que pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Un caso práctico sería el observado en coinfecciones con agentes inmunosupresores, o en cuadros de malnutrición, o si el individuo se encuentra en el periodo “ventana” de la infección en el momento de realizar la prueba. En tercer y último lugar, pueden darse falsos negativos cuando se presenta una inespecificidad entre antígenos (Ag) y Ac.

En el caso particular de la prueba de ELISA indirecto, la dilución de la solución que contiene el Ac primario —por ejemplo, suero sanguíneo, es un factor muy importante a tener en cuenta, con el fin de evitar la aparición de falsos negativos, ya que, si la muestra está muy diluida, no será detectada como positiva si la titulación de Ac es muy baja. Es decir, aunque los Acs están presentes, la prueba es negativa, ya que la concentración de Acs específicos contra el Ag fijado no es suficiente como para dar una señal detectable.

Usualmente, un informe de resultados de una prueba de PCR indica positividad o negatividad de la prueba al o los agente(s) de los que se sospechaba inicialmente, y su interpretación partirá de la casuística del sistema productivo y de la epidemiología de la zona. Cuando el formato utilizado es qPCR, se obtiene además una cuantificación de dicho ADN en términos de cantidades relativas del número de copias y una gráfica de amplificación, respaldada en una curva estandarizada.

Es importante tener presente que un resultado negativo no descarta el contacto previo, ni descarta la posibilidad que el individuo (o población) esté(n) en periodo de incubación y —dependiente del agente infeccioso, se podría constituir una fuente de contagio para otros individuos.

La detección de ADN/ARN por la PCR presenta ciertas ventajas —como la rapidez, identificación inequívoca del agente, así como desventajas —una sensibilidad moderada, alto costo, equipos y reactivos especiales y personal altamente calificado. La sensibilidad moderada, más que un asunto propio de la prueba, es una variable por controlar cuando se toma la decisión de qué muestra biológica remitir (e.g. la materia fecal incluye varios inhibidores de la polimerasa, enzima responsable del proceso replicación del ADN), el momento de colección de la muestra en el proceso de dinámica de la enfermedad (e.g. período prepatogénico, patogénico, recuperación; lo que podría comprometer la cantidad de ADN “detectable” en la muestra biológica), y conservación durante el transporte y almacenamiento de la muestra (dada la posibilidad de degradación del ADN presente en la muestra). Todas las situaciones mencionadas podrían llevar a un falso negativo, lo cual comprometería la interpretación del fenómeno epidemiológico.

En general, los resultados de los cultivos pueden ser negativos (estériles, sin presencia de bacterias), contaminados (con presencia de múltiples bacterias, habitualmente por contaminación de la muestra y no necesariamente por enfermedad) o positivos (habitualmente cuando tienen > 100.000 unidades formadoras de colonias; UFC). Es importante tener presente que un resultado negativo no descarta la presencia del agente patógeno, ni en la muestra inicial ni en el animal(es) afectado(s).

Asimismo, una vez que se cuenta con un resultado positivo, se suelen aportar tres datos importantes: la bacteria especifica (género y en algunos casos, la especie), el número de UFCs y el antibiograma. A este último se le dan tres interpretaciones: sensible (la bacteria presenta una gran área de inhibición causada por el fármaco -95% de éxito), intermedio (se presenta un halo de inhibición más reducido) y resistente (presenta muy poco o casi nada de halo de inhibición).

En cuanto a los resultados de concentración inhibitoria mínima (CIM), siempre es tentador pensar que el antibiótico con la menor concentración será la mejor elección, ya que lo intuitivo sería considerar que aquel antibiótico que requiera una menor concentración será más efectivo para eliminar dicha bacteria. Sin embargo, existen múltiples factores que intervienen, como la farmacodinamia/farmacocinética de los antibióticos (efectos del fármaco y su metabolismo en el organismo), la concentración en el lugar de la infección (algunos fármacos se acumulan más en hueso, tejidos blandos, sistema urinario, etc.), el tiempo que se conservan las concentraciones por encima de la CIM, la ruta que se piensa utilizar (e.g. oral, intravenosa, intramuscular) y la susceptibilidad propia de la bacteria a dicho antibiótico (algunas bacterias son particularmente sensibles a algunos antibióticos). Otro detalle para tener en cuenta, es que el punto de corte y el rango de diluciones difieren según el fármaco y la especie bacteriana. Por lo tanto, comparar las CIMs de diferentes antibióticos no se basa únicamente en el valor numérico, por lo que una menor CIM no es necesariamente mejor que otro antibiótico con una CIM superior.

Cuando se requiere el cultivo de virus, este se debe dar en células vivas y todo lo que ello representa en términos de viabilidad y conservación. Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes comunes como las bacterias, los hongos y las levaduras.

Algunas limitaciones generales al cultivo microbiano  y a los resultados al antibiograma, se derivan de factores como la calidad del medio (e.g. capacidad nutricional, pH, humedad), el grosor del agar, horizontalidad y esterilidad, las condiciones de incubación (e.g. temperatura, humedad, composición de la atmósfera, tiempo),  discos antibióticos de baja calidad o caducos, interacciones antibióticas, poca distancia entre discos o que estén demasiado cerca del margen de la placa de Petri, inóculo no estandarizado o dispersión desigual en placa,  cultivo contaminado o cepa infectada por bacteriófagos, e instrumentos de medida no estandarizados — lectura de las zonas de inhibición e interpretación equívocas.

La interpretación final de los resultados deberá realizarse dentro de la particularidad de cada granja y de cada enfermedad o complejo de enfermedades, valiéndose del historial de la explotación y de la zona geográfica en la que se desarrolla. También hay que mencionar que los resultados de laboratorio siempre deben de ser confrontados con los parámetros productivos obtenidos, con el fin de tomar decisiones adecuadas.

Las consideraciones particulares y detalladas para la interpretación de pruebas diagnósticas en animales terrestres pueden ser consultadas en el Manual de animales terrestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE),
8ª edición (2018): https://www.oie.int/es/que-hacemos/normas/codigos-y-manuales/acceso-en-linea-al-manual-terrestre/#searchform-header