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Ayudas diagnósticas en la medicina de los animales de producción: Parte II

Publicado el: 3/1/2022
Autor/es: Nathalia María del Pilar Correa Valencia
Un análisis clínico o prueba de laboratorio es un tipo de exploración confirmatoria, ya que la solicita un médico veterinario al laboratorio clínico para confirmar o descartar un diagnóstico, individual o poblacional.
Dicho análisis forma parte del proceso de atención al fenómeno epidemiológico y se apoya en el estudio de distintas muestras biológicas mediante su análisis en laboratorio y brinda un resultado objetivo, que puede ser cuantitativo —un número, como en el caso del nivel de anticuerpos (Ac) o cualitativo —positivo o negativo. No deben confundirse ambos conceptos, por un lado, está el resultado de la prueba de laboratorio realizada, y por otro, la interpretación que el médico veterinario tratante dé a esos resultados.
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En la entrega previa (Parte I), tratamos los puntos fundamentales al momento de colectar las muestras ante un evento sanitario en animales de producción. En esta segunda entrega nos referiremos a la definición, tipos, indicaciones de elección y limitaciones de tres tipos de pruebas diagnósticas frecuentemente utilizadas hoy en día: ELISA (ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas), PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y CULTIVO. Las pruebas diagnósticas de tipo hemoleucograma e histopatología refieren particularidades extensas, que superan la intención del presente material.
La técnica ELISA (acrónimo en inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) es una técnica de inmunoensayo, en la cual un antígeno (Ag) inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo (Ac) enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como por ejemplo, un cambio de color. La aparición de colorantes permite medir indirectamente, mediante espectrofotometría, el Ag en la muestra.
Existen actualmente varios formatos de la prueba de ELISA, que permiten, por ejemplo, la cuantificación de un Ag y la detección o la determinación de la subclase (idiotipo) de un Ac. Entre los más comúnmente utilizados en medicina de la producción, tenemos los siguientes:
ELISA directo:El objetivo de la prueba es detectar la presencia de un Ag de interés en una muestra clínica. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo que las analizadas (e.g. sangre, orina), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del Ag buscado. Asimismo, se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el Ag de interés).
ELISA indirecto: El objetivo de la prueba es detectar la presencia de Acs generados por el animal frente a un Ag de interés, detectados en una muestra clínica. El sistema de detección emplea dos anticuerpos (uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario). Los controles positivos y negativos son los mismos. Es el formato de ELISA más popular y es un método polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un paso de más con respecto al método directo.
ELISA competitivo: Este tipo de ELISA es el más complejo. Se utiliza para detectar o cuantificar Ags presentes en bajas cantidades en una muestra clínica. Se denomina así porque se utiliza un Ag de referencia que competirá con el Ag que se sospecha está en la muestra, mediante la unión al Ac.
La principal indicación de la prueba de ELISA, desde el punto de vista clínico y epidemiológico, es la determinación de la presencia y cuantificación de un Ac particular en una muestra, ya sea de sangre, suero, orina, leche, líquido cefalorraquídeo, o de cualquier otro fluido de importancia clínica. Esta prueba puede aplicarse a enfermedades infecciosas de diversas etiologías, ya sean virales, bacterianas, protozoarias, parasitarias, entre otras. Adicionalmente, está diseñada para identificar cuantitativamente la concentración relativa de Ac producidos por el animal en respuesta a un Ag determinado, ya sea por vacuna o desafío de campo; es decir que el resultado nos indicará el comportamiento inmunitario del lote muestreado (o del individuo) frente a una enfermedad en un momento determinado, así como los cambios en una línea temporal.
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Esta última aproximación permite 1) realizar el seguimiento a la eficacia y eficiencia de las vacunaciones (e.g. métodos, insumos, personal, rutas de aplicación); 2) determinar el período en el cual se hace presente un desafío infeccioso o de manejo y así poder ajustar los calendarios de vacunación para obtener una respuesta inmune óptima; 3) evaluar los niveles de Ac transmitidos por vía materna y poder determinar la fecha más adecuada para la vacunación dentro del sistema; 4) evaluar la eficiencia de los procesos o inmunizaciones previos a las vacunas; y 5) analizar históricamente los métodos utilizados en bioseguridad y preparación de instalaciones, con el fin de identificar qué procedimientos se ajustan correctamente a los objetivos.
La técnica PCR (acrónimo en inglés Polymerase Chain Reaction) es una técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN/ARN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una sola copia de ese fragmento original, o molde. Su utilidad es que, tras la amplificación de dicho fragmento, resulta mucho más sencillo identificar —con una probabilidad muy alta, virus o bacterias causantes de una enfermedad o hacer investigación científica sobre el material genético amplificado (e.g. filogenética, secuenciación, análisis funcional de genes).
Existen actualmente varios formatos de la prueba de PCR. Entre los más comúnmente utilizados en medicina de la producción, tenemos los siguientes:
PCR anidada: Es una técnica muy sensible de PCR, en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. Su desventaja, es que no nos permite cuantificar la muestra.
PCR in situ: Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas del material genético de interés.
PCR múltiple: Este formato permite amplificar simultáneamente más de una secuencia genética (ya se trate de diferentes cepas o variantes de un mismo agente etiológico o de varios de ellos). La principal ventaja es que se obtiene información sobre varios productos en una sola reacción, lo que se traduce en un menor costo. Sin embargo, es una técnica que requiere de una cuidadosa optimización del proceso.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR):Es un formato cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN/ARN presente en la muestra original, o identificar (con una muy alta probabilidad), muestras de ADN específicas. A diferencia de la PCR convencional (de punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, en el qPCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada, y por supuesto también al ADN molde.
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones. En medicina veterinaria, la prueba de PCR se emplea fundamentalmente como herramienta diagnóstica, desde el punto de vista clínico y epidemiológico, definiéndose la presencia de un agente infeccioso (o al menos su ADN) y cuantificación de dicha presencia. Esta prueba puede aplicarse a matrices diversas como sangre, suero, orina, fluidos orales, leche, líquido cefalorraquídeo, o cualquier otro fluido de importancia clínica en donde se tenga conocimiento de que el agente etiológico per se estaría presente.
Por obvias razones permite la identificación de dicho agente, incluso presente en bajas cantidades en la muestra clínica. Esto representa una ventaja analítica cuando se le compara con otras pruebas como ELISA y cultivo. En el primer caso, para la detección de Ac se requiere de una respuesta inmune efectiva y detectable, lo cual no siempre se presenta; y en el segundo caso, se requieren partículas del agente infeccioso que se encuentren viables para que se puedan reproducir y ser visibles. La prueba de PCR requiere cantidades suficientes de ADN, incluso de un microorganismo no viable, para garantizar su detección. Adicionalmente, esta prueba permite genotipificar el agente infeccioso de interés (esto es, analizar el ADN de la línea germinal de un microorganismo, con el fin de identificar nucleótidos o bases nitrogenadas específicas que permiten determinar la presencia de ciertas variantes).
La detección de ADN/ARN por la PCR presenta ciertas ventajas —como la rapidez, identificación inequívoca del agente, así como desventajas —una sensibilidad moderada, alto costo, equipos y reactivos especiales y personal altamente calificado. La sensibilidad moderada, más que un asunto propio de la prueba es una variable por controlar cuando se toma la decisión de qué muestra biológica remitir (e.g. la materia fecal incluye varios inhibidores de la polimerasa, enzima responsable del proceso replicación del ADN), el momento de colección de la muestra en el proceso de dinámica de la enfermedad (e.g. período prepatogénico, patogénico, recuperación; lo que podría comprometer la cantidad de ADN “detectable” en la muestra biológica), y conservación durante el transporte y almacenamiento de la muestra (dada la posibilidad de degradación del ADN presente en la muestra). Todas las situaciones mencionadas podrían llevar a un falso negativo, lo cual comprometería la interpretación del fenómeno epidemiológico.
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La prueba de PCR también presenta una ventaja, específicamente sobre la prueba de ELISA, y es que, dada su sensibilidad, se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentre el origen de la respuesta, o partir del resultado poblacional para la intervención que dio justificación a la realización de la prueba.
En microbiología, el cultivo se define como un método para la multiplicación de microorganismos (e.g. bacterias, virus), a partir de la preparación de un medio óptimo que favorezca el proceso deseado.
Las variedades de formatos del cultivo radican principalmente en el medio que se utilice (i.e. sólido, líquido). La principal diferencia entre estos medios es que el sólido contiene un 1,5–2% de agar-agar, mientras que el medio líquido no contiene agar-agar. Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar, dependiendo de sus características particulares. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne.
En el caso que el objetivo de la prueba sea aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra biológica formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos (resiembras), cada bacteria individual genera —por escisión binaria, una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
En medicina veterinaria, el cultivo se emplea fundamentalmente como herramienta de detección, desde el punto de vista diagnóstico, definiéndose la presencia de un agente infeccioso —inicialmente viable y capaz de reproducirse, y en algunos casos, la cuantificación de su presencia en términos de UFC (Unidades Formadoras de Colonia). Esta prueba puede aplicarse a matrices diversas como sangre, suero, orina, fluidos orales, leche, líquido cefalorraquídeo, o cualquier otro fluido de importancia clínica en donde se tenga conocimiento de que el agente etiológico viable está presente.
En otros escenarios —entendiendo que muchas especies bacterianas son similares al microscopio (morfológicamente hablando), para identificar cada tipo de bacteria se estudian sus características bioquímicas, sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la del tipo que se desea averiguar si está presente. En otras aproximaciones, el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolismos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se puede identificar si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes. Así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hidrólisis y cambios apreciables prosaicamente en las placas de agarsangre.
Cuando se requiere el cultivo de virus, este se debe realizar en células vivas y todo lo que ello representa en términos de viabilidad y conservación. Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes comunes como las bacterias, los hongos y las levaduras.
Algunas limitaciones generales al cultivo microbiano y a los resultados al antibiograma, se derivan de factores como la calidad del medio (e.g. capacidad nutricional, pH, humedad), el grosor del agar, horizontalidad y esterilidad, las condiciones de incubación (e.g. temperatura, humedad, composición de la atmósfera, tiempo), discos antibióticos de baja calidad o caducos, interacciones antibióticas, poca distancia entre discos o que estén demasiado cerca del margen de la placa de Petri, inóculo no estandarizado o dispersión desigual en placa, cultivo contaminado o cepa infectada por bacteriófagos, e instrumentos de medida no estandarizados — lectura de las zonas de inhibición e interpretación equívocas.
Una indicación que viene ganando popularidad, es que, además de la identificación de las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas, se identifiquen también los antibióticos a los que son sensibles, es decir, la inclusión del antibiograma, el cual tiene 3 utilidades principales: 1) la instauración de un tratamiento antibiótico correcto, de acuerdo al agente aislado desde el cultivo. En este caso, es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección posee mecanismos que le confieran resistencia frente a algún antibiótico para no incluirlo como terapia; 2) en cuanto al tratamiento, el antibiograma no solo es necesario en la instauración, también resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de tratamientos empíricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. En este sentido se espera que el antibiograma confirme, o en su defecto, oriente en la corrección del tratamiento; y, 3) en la epidemiología, ya que es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas correctivas, principalmente cuando se presentan resistentica de interés en salud pública.
Históricamente, la sensibilidad a los antibióticos se determinaba mediante la técnica de Kirby-Bauer, que utiliza discos impregnados de antibiótico y según el halo que se formaba a su alrededor (en mm) se determinaba si la bacteria era sensible, intermedia o resistente a dicho antibiótico. Sin embargo, se han desarrollado otros métodos, como, por ejemplo, la determinación de la CIM (Concentración Inhibitoria Mínima), es decir, la concentraciónmás baja de un antibiótico necesaria para lograr la inhibición del crecimiento de un microorganismo después de su incubación.
RECUERDEN:
Ninguna prueba diagnóstica brinda la información completa del fenómeno epidemiológico que se está presentando, y mucho menos, representa una ruta de solución a un problema infeccioso por sí sola. Adicionalmente, todas y cada una de ella presenta limitaciones propias que comprometen su sensibilidad y especificidad. Es por esto que se recomienda la combinación de 2 o más pruebas diagnósticas para contar con un mayor espectro de información.

 
Autor/es:
MV, MSc, DSc. Docente/Investigador UdeA. Asesora en Investigación y Desarrollo BIOTECNO,
 
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