Aislamiento y caracterización del virus de la diarrea epidémica porcina

La diarrea epidémica porcina es una enfermedad producida por un virus RNA perteneciente al orden Nidoviridae, la familia Coronaviridae y género Alfacoronavirus, tiene un genoma de aproximadamente 28 kb cuenta con dos regiones conservadas UTR 3´ y 5´ y 7 ORFs.

Se caracteriza por ser una enfermedad aguda y altamente contagiosa causando alta mortalidad en cerdos lactantes y difícilmente las lesiones provocadas por esta enfermedad se diferencian de aquellas producidas por Gastroenteritis Transmisible (GET), otro alfacoronavirus. Esta enfermedad fue reportada en el 2013 en los Estados Unidos donde al igual que en nuestro país ha representado grandes pérdidas económicas en la porcicultura.
 

De las muestras recibidas en el laboratorio de diagnóstico de Lapisa se seleccionaron aquellas que tuvieron una mejor replicación en cultivo celular y una mayor carga viral estas se procesaron para inoculación en cultivo celular, para lo que se utilizaron microplacas de 6 pozos y botellas de cultivo de 25 cm2 con células VERO a las cuales se les dio tratamiento con tripsina para la infección, y al final del tiempo de incubación se adicionó Medio Dulbeco de mantenimiento.

Las células fueron incubadas a 37°C con 5% de CO2 y revisadas diariamente hasta observar la presencia de efecto citopatogénico, el cual varió entre cada una de las cepas. Una vez que el efecto fue evidente se tomó el fluido de las botellas y de las placas para enviarse al área de biología Molecular y las placas fueron lavadas y fijadas para tinción de inmunuhistoquímica, para secuenciación se purificaron los productos obtenidos de PCR utilizando primers forward y reverse marcados con IRdye en 700 y 800 nm y ésta se realizó en un equipo Li-cor 4300 DNA Analizer. Los fragmentos analizados fueron de 651-bp, 833-bp y 808 bp respectivamente para el gen Spike (S), membrana( M) y ORF3.

Para el análisis de las secuencias obtenidas programa BioEdit Sequence Alignement Editor 7.2.5.

De las muestras seleccionadas para aislamiento viral se obtuvieron los siguientes resultados:

1. Qi Chen, Ganwu Li, Judith Stasko, Joseph T., Thomas, Wendy R., Stensland, Angela E, Pillatzki, Philip C Gauger, Kent J, Schawartz, Darin Madson, Kyoung-Jin Yoon, Harmon, Rodger G. Journal of Clinical Microbiology Vol 52, No 1 pp234-243, 2014.
2. Martin Hofmann and Robert Wyler Propagation of the Virus of Porcine Epidemic Diarrhea in Cell Culture. Journal of Clinical Microbiology, Nov 1988, pp 2335-2339.
3. Vlasova A, Marthaler Douglas, Wang Qiuhjong, Culhane Marie, Rossow Kurt, Rovira Albert, Collins James and Saif Linda. 2014. Distinct Characteristics and Complex Evolution of PED Strains, North America, May-2013-February 2014. Emerging Infectious Deseases. Vol 20, Nº 10, October 2014.