Actividad ovicida del extracto acuoso y dos fracciones de Lysiloma acapulcensis contra Haemonchus contortus

Introducción

El uso de plantas o extractos de leguminosas arbóreas son una herramienta alternativa para disminuir las parasitosis que presentan los rumiantes criados en sistemas extensivos de zonas tropicales (Torres-Acosta et al., 2012; Martínez-de-Montellano et al., 2013; Olmedo et al., 2014). Existen metabolitos secundarios que las plantas utilizan para defenderse contra plagas o predadores naturales (Acamovic y Brooker, 2005). Algunos de estos compuestos se han aislado para utilizarlos en el control de nematodos gastrointestinales (NGI). En México se han evaluado diversas leguminosas arbustivas y arbóreas en forma de extracto y ofreciéndolas como parte de la dieta en los animales, obteniendo resultados positivos (Torres -Acosta et al, 2012). Dentro de las familias de las Fabáceas se tienen a Leucaena leucocephala, Pithecellobium dulce, Lezpedeza cunatea Lysiloma acapulcensis y L. latisilicum. El tepehuaje (L. acapulcensis), es un árbol que predomina en algunas zonas subtropicales de México, y se ha comprobado que las cabras consumen sus hojas y vaina. A partir de esto se hicieron diversos estudios evaluando el valor nutricional de sus hojas en diferentes épocas del año (Camacho et al., 2010), reportando que la época es importante ya que esta define el valor nutricional de sus hojas.

Por otra parte se han tenido experiencias sobre el uso a nivel in vitro en forma de extracto crudos contra nematodos parásitos de ovinos (95% de Haemonchus contortus, 3% de Oesophagostomum columbianum y 2% Trichostrongylus colubriformis), utilizando concentraciones de 50 mg/mL, dando como resultado efectos larvicidas (100% de mortalidad) y en menor grado ovicidas (32.6% de inhibición). Esta leguminosa tiene altos niveles de flavan 3- ol o taninos (Olmedo et al., 2014), que son los responsables en afectar la actividad biológica de los NGI; sin embargo, para obtener un mejor efecto es necesario aislar estos metabolitos mediante solventes como acetato de etilo, ya que con este proceso se eliminan otros componentes (azucares, lípidos). Es por ello que el objetivo del presente experimento fue evaluar la comparación del extracto acuoso con la fracción acuosa y acetato de etilo de L. acapulcensis contra huevos de H. contortus.

Materiales y Métodos

Zona de estudio:Este experimento fue realizado en el Laboratorio de Helmintología, en las instalaciones del Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria (CENID-PAVET), del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicado en Jiutepec, Morelos.

Procedimiento experimental: Se utilizaron huevos de H. contortus obtenidos a partir de un ovino infestado experimentalmente. Estos se concentraron mediante el paso de diferentes tamices (200, 100, 75 y 37 μm de diámetro) y fueron lavados con sacarosa al 40 %.

Se utilizaron placas de cultivo ELISA de 96 pozos, con cuatro repeticiones (n=4). Los tratamientos fueron las concentraciones del extracto y las fracciones (25, 12.5, 6.25 y 3.12 mg/mL), ivermectina al 0.5 % control positivo (C+), agua y DMSO como control negativo (C- ). A cada pozo se le depositaron 100 huevos en un volumen de 50 μL y, posteriormente se añadieron 50 μL de extracto o controles. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente (28 °C), durante 48 horas. Se detuvo la eclosión con solución de Lugol y se procedió a cuantificar la cantidad de huevos y larvas en cada pozo a través de 10 alícuotas de 5 μL. Se determinó el porcentaje de eclosión en cada caso.

Análisis estadístico: Los datos fueron analizados a través de un análisis de varianza mediante un diseño completamente al azar y para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey (P<0.05). También se calcularon las concentraciones letales 50 (CL50) y 90 (CL90), mediante un análisis PROBIT. Se empleó el paquete estadístico SAS versión 9.0.

Resultados y Discusión

Los metabolitos secundarios que tienen las plantas pueden ser aprovechados para el control de las parasitosis de los rumiantes; sin embargo, se requiere del uso de diferentes solventes para poder extraer las moléculas o compuestos. Para el caso de la extracción de los flavonoides se pueden extraer con agua, pero el inconveniente de esta extracción es que se arrastran muchas sustancias que pueden interferir en los estudios sobre la actividad antihelmíntica. No obstante los extractos acuosos son fácil de obtener. Asimismo, existen otros solventes medianamente polares como es el acetato de etilo, el cual deja a un lado sustancias como los azucares.

En la figura 1 se observa que la fracción acetato de etilo resulto ser más efectiva (P<0.05), que el extracto y fracción acuosa, inhibiendo la eclosión al igual que la ivermectina en un 100 %. Al observar los huevos en el microscopio, las larvas permanecían inmóviles en el interior de los mismos, probablemente debido a que el metabolito activo causó alguna alteración en la cubierta superficial del huevo, impidiendo la eclosión de las larvas. Cabe señalar que las larvas se desarrollaron dentro del huevo, pero no eclosionaron y los que sí lo hicieron al momento de entrar en contacto directo con la fracción de acetato de etilo, las larvas perecieron. Este mismo efecto lo encontraron Vargas- Magaña et al (2014), utilizando extractos acetónicos de diversos extractos entre ellos la leguminosa Lysiloma latisilicum, observaron dos efectos antihelmínticos de los extractos (huevos morulados y huevos con larva, pero no eclosionados). Por lo tanto esto podría marcar la pauta para poder hacer evaluaciones sobre el desarrollo larvario y estudios in vivo ofreciendo la fracción de acetato acompañado en el alimento de los rumiantes. No obstante se tienen que tomar en cuenta los factores como época del año tipo de dieta del animal. Dado que el paso del extracto o fracción en el rumen puede sufrir modificaciones por la interacción entre los microrganismos como las bacterias y protozoarios ruminales (Olmedo et al., 2015). Sin embargo los taninos o flavonoides que logran llegar hasta el abomaso son los que actúan directamente contra los parásitos adultos.

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Figura 1. Inhibición de la eclosión de huevos de Haemonchus contortus expuesto a un extracto acuoso y dos de sus fracciones (acuosa y acetato de etilo) de la leguminosa Lysiloma acapulcensis

Esta teoría está basada por estudios realizados por Martínez-de-Montellano et al. (2013), en estudios de barrido que hicieron sobre nematodos adultos, comprobaron que los daños debido a los taninos eran de forma directa, afectando diferentes partes de los parásitos, por ejemplo en las hembras afecto el aparato bucal y reproductor. La leguminosa bajo estudio tiene altas cantidades de taninos condensados libres (116 g kg/ Ms), y puede representar una opción más para utilizarla como desparasitaste natural. De tal modo, es necesario seguir evaluando experimentos in vitro e in vivo para corroborar su efecto sobre los nematodos gastrointestinales.

En la figura 2 se observan las CL50 y CL90, de la fracción de acetato de etilo, dado que obtuvo las mejores concentraciones letales (CL50=6.49 mg/mL; CL90=30.80 mg/mL), en la inhibición de la eclosión.

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Figura 2. Concentración letal de la fracción acetato de etilo sobre la inhibición de huevos del nematodo Haemonchus contortus

Existen factores ambientales que pueden influir en la producción de compuestos por parte de las plantas como la época del año, tipo de suelo, variedad de la planta, y parte de la planta de donde se obtienen los extractos; además de los solventes a utilizar (Kanumuri et al., 2015). Por otra parte la inocuidad de los extractos tiene que ser evaluada en animales a distintas dosis. Es importante considerar estos aspectos en trabajos futuros para obtener los mejores resultados en el uso de extractos de plantas como una herramienta de control de los NGI.

Referencias

Acamovic T, Brooker. 2005. Biochemistry of plant secondary metobolites and their effects in animals. Proceedings of the Nutrition Society, 64, 403-412.

Kanumuri SRR, Naveen K, Isha T, Wahajuddin. 2015. Phytochemical analysis of isoflavonoids using liquid chromatography coupled with tándem mass spectrometry. Phytochemical Review. 14, 469-498.

Martinez-Ortíz-de-Montellano C, Arroyo-López C, Fourquaux I, Torres-Acosta JFJ, Sandoval-Castro CA, Hoste H. 2013. Scanning electron microscopy of Haemonchus contortus exposed to tannin-rich plants under in vivo and in vitro conditions. Experimental Parasitology. 133, 281-286.

Olmedo JA, Rojo RR., Arece GJ, Salem AZM, Morales AE, Albarrán PB, Lee RHA, Vázquez AJF. 2015. Extracto de Lysiloma acapulcensis en la digestibilidad y fermentación ruminal de una dieta para ovinos. Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. 2 (5), 173-182.

Olmedo JA, Rojo RR., Arece GJ, Salem AZM, Kholif AE, Morales AE. 2014. In vitro activity of Pithecellobium dulce and Lysiloma acapulcensis on exogenous development stages of sheep gastrointestinal strongyles. Italian Journal of Animal Science. 13 (3104), 303-307.

Torres-Acosta JFJ, Molento M, Mendoza GP. 2012. Research and implementation of novel approaches for the control of nematode parasites in Latin America and the Caribbean: Is there sufficient incentive for a greater extensión effort. Veterinary PArasitology. 186, 132-142.

Vargas-Magaña JJ, Torres-Acosta JFJ, Aguilar-Caballero AJ, Sandoval-Castro CA, Hoste H, Chan-Pérez JI. 2014. Anthelmintic activity opf acetone-water extracts against Haemonchus contortus eggs: Interaction betwen tannins and other plant secondary compounds. Veterinary Parasitology. 206, 322-327.