Efecto del uso de etilenglicol (3 y 6%) y plasma seminal ovino en base tris-lactosa-yema de huevo, en dos diluyentes de conservación de semen lavado caprino sobre los parámetros espermáticos poscongelación

INTRODUCCIÓN

Se han encontrado limitantes en programas de reproducción mediante inseminación artificial en cabras, como lo es la disminución en la fertilidad con el uso de semen congelado con respecto al semen fresco y conservado a 5 ºC; con semen fresco (a 16-22 ºC durante 4 6 horas máximo) se pueden alcanzar fertilidades en torno al 70-80 %. Con semen conservado a 5 ºC hasta 36 horas, las fertilidades se sitúan cerca del 75 % (Roca, Hernández, Carvajal, & Martínez, 2006). Sin embargo, cuando se utiliza semen congelado para realizar las inseminaciones las tasas de fertilidad afectan negativamente los valores encontrándose rangos entre 60 - 65 % (Amann & Graham, 1993).

La congelación del semen es una técnica que se ha desarrollado sobre todo para satisfacer dos necesidades fundamentales: por un lado, la conservación del material genético como un banco de germoplasma a tiempo indefinido, aplicación con la que se contribuye de manera importante a la conservación de razas o especies en riesgo de extinción; en segundo lugar, el desarrollo de la inseminación artificial (lA), en la que se utiliza como un recurso en programas de mejoramiento genético (Cordova, Pelaez, Peña, & Alegre, 2000).

En establecieron esta dos investigación protocolos se de congelación de semen de caprino, previamente centrifugado para eliminar su plasma seminal PS (lavado de semen) y luego adicionado de plasma seminal ovino; en cada protocolo se utilizó un crioprotector a dos niveles v:v junto con un disacárido como sustrato energético, para ser evaluados una semana después del proceso.

MATERIAL Y MÉTODOS

El trabajo de investigación se realizó con la participación de varias instituciones: (UNISARC, Granja Animalia y Centro Latinoamericano de Especies Menores CLEM).

Los reproductores caprinos seleccionados para la colecta de semen por el método de vagina artificial fueron animales puros de razas lecheras propiedad de la Granja Animalia situada en el municipio de Manizales, departamento de Caldas. Por otro lado, los reproductores ovinos escogidos para para la colecta de semen con electroeyaculador para el aporte del PSO fueron aportados por el SENA situado en el municipio de Tuluá en el departamento del Valle del Cauca.

Se evaluaron 4 machos caprinos cuyos eyaculados fueron lavados mediante centrifugación (eliminación del PS) para ser restituidos con PS ovino; se valoraron en fresco y poscongelación para determinar el que mejores resultados ofrecía sobre la resistencia de la célula espermática al choque frío; se utilizaron crioprotectores permeables en base Tris, para las diluciones y elaboración de las dosis para la IA a una concentración de 40 x 106 espermatozoides con motilidad progresiva morfológicamente normales (SpzMPMN).

Tratamientos

T0 Semen entero + Diluyente comercial (Triladyl)

T1 Semen lavado + PSO + D1 (ETG 3% + TLYh)

T2 Semen lavado + PSO + D2 (ETG 6% + TLYh)

Duración

Las colectas, centrifugación y congelación de plasma seminal de los ovinos (PSO) se hicieron un mes antes, con el fin de tener suficiente cantidad para proceder con los protocolos de conservación del semen de caprino.

Las colectas y evaluación seminal de los machos cabríos se realizaron durante tres semanas, una vez por semana. La investigación tuvo entonces una duración considerada como trabajo de campo de esas tres semanas.

La evaluación de los parámetros espermáticos poscongelación, se hicieron para cada repetición una semana después de la congelación correspondiente a una repetición, siendo en total una duración de seis semanas para obtener los resultados de la contrastación seminal de todos los reproductores.

Preparación de los medios dilución

Se diseñaron diluyentes para cada tratamiento divididos en fracciones para el semen fresco, temperatura crítica y de equilibrado.

Para cada tratamiento se utilizaron los diluyentes divididos en tres fracciones: una solución base, un medio de enfriamiento para el descenso de la temperatura de 37 a 5ºC y un medio de equilibrado a 5ºC durante 1,5 horas antes de la congelación.

Se prepararon dos diluyentes utilizando el etilenglicol ETG a dos concentraciones (3 y 6% v:v para el diluyente 1 D1 y 2 D2 respectivamente, en base TLYh.

Obtención del plasma seminal ovino

A cada eyaculado de los borregos, se le extrajo el plasma seminal mediante centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos a 15ºC. El sobrenadante obtenido se filtró mediante una membrana Millipore 6V de 0,20 μm para almacenarlo a una temperatura de -20ºC hasta su uso como componente de los protocolos para cada tratamiento.

Unidades experimentales y colectas

Esta investigación se realizó con 4 machos cabríos de las razas Alpina, Saanen, Toggenburg y La mancha; a cada uno de los cuales se le realizaron tres colectas de semen (cada semana a cada animal) mediante vagina artificial.

Evaluación del semen fresco

Después de la colecta se procedió a llevar la muestra al laboratorio para la posterior evaluación de parámetros tanto macroscópicos como microscópicos.

Al llegar el material seminal se tenía preparado el baño termostático atemperado a 37ºC con tubos de citrato de Na, la tinción de eosina-Nigrosina,glutaraldehído al 2%, PBS, solución hipoosmótica a 100 mOsm/l, solución salina formolada al 0,3%, platina térmica y portaobjetos atemperados con los que realizó la evaluación.

Lavado del semen caprino

Una vez colectado cada macho, se procede a hacer una dilución 1:1 con diluyente comercial Triladyl y centrifugado durante 7 minutos a 2500 rpm; seguidamente se extrajo el efluente (PS y dilución inicial) para proceder con la dilución de conservación a temperatura crítica.

Restitución del PSO

Al paquete espermático de cada macho cabrío se les resuspendió en PSO debidamente atemperado, seguidamente se les adicionó la solución base y la fracción I del diluyente para empezar a bajar la temperatura de 37 a 5ºC (temperatura crítica), a razón de 0,5ºC por cada minuto.

Dilución y congelación

Una vez finalizado el período de temperatura crítica, el semen fue diluido nuevamente con la fracción II (diluyente preparado para cada tratamiento con ETG al 3 y al 6%) y se procedió al equilibrado de la solución durante 1,5 horas, tiempo en el cual el crioprotector entra en la célula, para proceder con el proceso de llenado de pajillas.

Una vez finalizado el llenado de pajillas, se pusieron en las rampas de congelación para ser llevadas a vapores de nitrógeno líquido (-80ºC) durante 10 minutos, y ya congeladas se almacenaron en nitrógeno líquido a 196ºC.

Evaluación de pajillas poscongelación

Una semana después de la congelación de las muestras por cada tratamiento, se escogieron varias pajillas al azar de cada uno y se les aplicó el mismo protocolo de evaluación que en fresco para así determinar el efecto de los niveles de etilenglicol después de congelado.

RESULTADOS

La comparación de los tres tratamientos (semen sin lavar con diluyente comercial T0 DC, semen lavado + PSO con 3% de etilenglicol ETG T1 D1 en base T-L-Yh y semen lavado + PSO con 6% de etilenglicol ETG T2 D2 en base T-L-Yh), muestra valores decrecientes entre tratamientos, especialmente presentando los mejores resultados a favor del tratamiento T2 (D2); en este, todos los valores de las variables están por encima del 60%, por tanto se puede intuir que el ETG a niveles de 6% v:v es una buena alternativa como componente de un diluyente de congelación, (figura1).

La variable dependiente Cn no muestra mayores tratamientos cambios entre poscongelación, posiblemente porque la variable células normales, sea un factor intrínseco inherente al macho.

Los valores de los parámetros espermáticos acrosomas y endósmosis (indicadores de fertilidad) para el tratamiento T1D1 estuvieron por debajo del 50%, teniendo en cuenta que el semen descongelado alcanza rápidamente la capacitación y reacción acrosómica, lo que puede llevar a una menor capacidad fecundante.

Descripción de las variables

La tabla 1 presenta los resultados con relación al promedio y error estándar de las variables dependientes, para los tres tratamientos, el testigo que se realizó con diluyente comercial (Triladyl) y los otros dos con semen lavado adicionado con PSO aplicando los protocolos con dos niveles ETG en base Tris-Lactosa-Yema de huevo.

Efecto del uso de etilenglicol (3 y 6%) y plasma seminal ovino en base tris-lactosa-yema de huevo, en dos diluyentes de conservación de semen lavado caprino sobre los parámetros espermáticos poscongelación - Image 1

Las variables motilidad individual progresiva MIP y vitalidad VyM presentaron diferencias altamente significativas (p< 0,0001 con valores de p> F= 49,33 y 96,52); para los acrosomas normales An y Endósmosis End presentaron diferencias significativas (p< 0,05 con valores de p> F= 12,46 y 15,21) respectivamente, por el efecto tratamiento a favor del T2 D2; se puede intuir que estos resultados pueden deberse a la eficacia del ETG combinado con la Lactosa, por el efecto osmótico marcado, pero transitorio, que produce rápidos cambios en el volumen celular, lo cual no parece perjudicar la función del espermatozoide. Estos datos están acordes con los trabajos realizados por (Aisen, Álvarez, Venturino, & Garde, 2000) que utilizaron la combinación de este disacárido con un crioprotector permeable, obteniendo un mejor efecto protector de membrana que cuando se emplea con un monosacárido.

Prueba del rango múltiple de Duncan

En el procedimiento GLM, la prueba del rango múltiple de Duncan, que controla el índice error comparisonwise de tipo I, muestran los resultados de las variables analizadas para los efectos macho y tratamiento.

Para el efecto macho, la variable Cn con semen descongelado, presentó diferencias significativas (p< 0,05 con p> F= 6,92) a favor del macho 1 sobre los demás, (tabla 2).

El efecto tratamiento (diluyente comercial, ETG 3 y 6%) para las variables MIP, VyM, An y End, presentaron diferencias altamente significativas (p< 0,0001 con valores de p> F = 49,33; 96,52; 36,38 y 42,46) a favor del tratamiento T2 D2, seguidos por T1 D1 y T0 DC, (tablas 3 a 6).

El análisis de las Cn con semen descongelado presentó diferencias significativas (p< 0,05 con p> F= 6,67) a favor del tratamiento T2 D2, seguidos por T1 D1 y T0 DC, (tabla 7).

Todos los resultados a favor del T2 se pueden explicar por los estudios realizados demuestran un mejor efecto protector del ETG en comparación con el glicerol (GL), en otras especies como humanos (Deppe y col., 2003), equinos (Ball y Vo, 2001), bovinos (Guthrie y col., 2002) y chinchillas (Carrascosa y col., 2001); además del uso concomitante en el diluyente con base Tris, que se refleja en una mejor motilidad poscongelación (Saavedra, 2018).

Coeficientes de correlación Pearson

Como punto final, el coeficiente de correlación de Pearson (Tabla 7.8) expresa valores de correlación positivos.

La variable MIP mostró correlación altamente significativa (p< 0,0001) con VyM, An y End con valores de (p> r= 0,95372; 0,94323 y 0,95699) respectivamente, y correlación significativa (p< 0,05 con p> r= 0,95372) con la variable espermática Cn.

Vitalidad VyM presentó correlación significativa (p< 0,05 para p> r= 0,52164) con Cn; con los An y End, mostró correlación altamente significativa (p< 0,0001 para p> r= 0,91199 y 0,93404) respectivamente.

Los valores que se obtuvieron de los parámetros espermáticos una semana después de la congelación, comparados con el semen integro de los machos cabríos con diluyente comercial fueron satisfactorios, posiblemente gracias a la inclusión del PSO al semen caprino lavado; como ya se mencionó, el plasma seminal del macho cabrío contiene enzimas que aportan las glándulas bulbouretrales, las cuales reaccionan negativamente con algunos componentes del diluyente (yema de huevo), formando un medio toxico a la célula espermática; coincidiendo con los resultados publicados por (Rojas, 2014).

CONCLUSIONES

El semen lavado caprino adicionado con PSO y congelado con un diluyente con un crioprotector adecuado, presenta buenos parámetros poscongelación.

El mejor efecto sobre la viabilidad de las células espermáticas poscongelación se logró con la inclusión del ETG al 6% v:v en el diluyente de congelación en base TLYh, correspondiente al tratamiento 2 (T2 D2).

Los parámetros espermáticos poscongelación para el tratamiento 2 (T2 D2), presentaron unos porcentajes por encima del 60% y están dentro de las exigencias para la inseminación artificial en hembras caprinas; por tanto, el protocolo de congelación es replicable por otros entes dedicados a la reproducción de pequeños rumiantes.

La centrifugación a 2500 rpm durante 7 minutos significativamente espermáticas caprinos.

Es posible elaborar en laboratorio un protocolo para la congelación de semen de pequeños rumiantes, sin depender de los diluyentes comerciales.