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Potencial de los residuos de kale y lechuga como adsorbentes de aflatoxina b1 en un modelo dinámico que simula las condiciones del tracto gastrointestinal de las aves

Publicado: 26 de agosto de 2022
Por: Alma Vázquez-Durán, María de Jesús Nava-Ramírez, Daniel Hernández-Patlán, Bruno Solís-Cruz, Víctor Hernández-Gómez, Guillermo Téllez-Isaías (Departamento de Ciencias Avícolas, Universidad de Arkansas, USA), Abraham Méndez-Albores. UNAM-FES Cuautitlán. Unidad de Investigación Multidisciplinaria. México
Resumen

La adsorción del carcinógeno aflatoxina B1 (AFB1) con materiales preparados a partir de residuos agrícolas, son una alternativa prometedora sobre los adsorbentes inorgánicos convencionales. En este estudio, se prepararon dos bioadsorbentes a partir de residuos agrícolas de kale y lechuga. Se utilizó un modelo dinámico in vitro, que simula las condiciones del tracto gastrointestinal de las aves con el fin de evaluar la eficiencia de remoción de los bioadsorbentes (0.5%, p/p) al agregarse a una dieta contaminada con AFB(100 µg AFB1/kg). Se emplearon diferentes técnicas de caracterización con el fin de comprender los mecanismos de interacción entre la molécula de AFB1 y los bioadsorbentes. De acuerdo con los resultados de adsorción, el bioadsorbente preparado a partir de kale fue el mejor, con una capacidad máxima de adsorción del 93.6%, significativamente superior a la del bioadsorbente a base de lechuga (83.7%). Los resultados de la caracterización indicaron que diferentes mecanismos pueden interactuar simultáneamente durante la adsorción. Las interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, dipolo-dipolo y la formación de complejos AFB1-clorofila, parecen ser los principales mecanismos que se presentan durante la adsorción de la AFB1.

Palabras Clave: bioadsorbentes, micotoxinas, adsorción, modelo in vitro, pigmentos.


 

Introducción
Las micotoxinas son sustancias de bajo peso molecular (< 1 kDa) sintetizadas como parte del metabolismo secundario de diversas especies de hongos filamentosos como Aspergillus, Penicillium, Fusarium, y Alternaria. La mayoría de estos metabolitos secundarios son extremadamente tóxicos, por lo que, pueden causar importantes pérdidas económicas y problemas de salud pública. Las aflatoxinas son un grupo de metabolitos altamente tóxicos que pueden contaminar una amplia variedad de alimentos. Se conocen veinte tipos de aflatoxinas; sin embargo, por orden de importancia, la principales son: la aflatoxina B1 (AFB1), la aflatoxina B2 (AFB2), la aflatoxina G1 (AFG1) y la aflatoxina G2 (AFG2). La AFB1 es ampliamente estudiada debido a que es un potente hepatotóxico, hepatocarcinógeno, teratógeno y mutágeno [1]. Se han desarrollado diversas estrategias para evitar la presencia de las aflatoxinas en la cadena alimentaria como las químicas, las biológicas, y las físicas; sin embargo, la prevención continúa siendo la medida más eficaz, aunque es muy difícil de lograr, dado que, las aflatoxinas son moléculas altamente estables. Es por esta razón que, es difícil aplicar tratamientos físicos o químicos sin que éstos lleguen a modificar la calidad nutricional de los alimentos. Por lo tanto, la estrategia más común es la inclusión de adsorbentes en el alimento contaminado con aflatoxinas para unir selectivamente estas sustancias tóxicas durante su paso por el tracto gastrointestinal [2]. Para ello, se han empleado varios tipos de adsorbentes como: los minerales (bentonita, vermiculita, montmorillonita, zeolita, aluminosilicato de calcio y sodio hidratado y diatomita), los químicos (carbón activado), los polímeros (polivinilpirrolidona, colestiramina, quitosan, hidroxipropil metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y celulosa microcristalina), y los orgánicos (levadura, glucomananos, lactobacilos, fibras micronizadas y adsorbentes de origen vegetal) [3, 4]. También, se han desarrollado adsorbentes muy elaborados contra las aflatoxinas, como el óxido de grafeno magnético-TiO2 y nanocompositos de carbono [7, 8]. Sin embargo, el alto costo de algunos de estos adsorbentes, es el factor más crítico que limita su aplicabilidad.
Durante los últimos cuarenta años, la sorción con materiales derivados de plantas se ha propuesto como una alternativa para la eliminación de las micotoxinas [9]. En este contexto, se han realizado diversos estudios para evaluar la capacidad de adsorción de AFB1 de diferentes materiales basados en residuos agrícolas; sin embargo, hasta la fecha, los estudios sobre la capacidad de adsorción de aflatoxinas de estos materiales, utilizando modelos in vitro que simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastrointestinal, aún son escasos [6, 10, 11]. Nuestro grupo de investigación recientemente realizó un estudio in vitro con un adsorbente preparado a partir de lechuga (Lactuca sativa L.), en este estudio se mostró que el bioadsorbente preparado a base de residuos agrícolas de lechuga, se puede utilizar con éxito en dosis bajas para la eliminación de AFB1 [10].Desafortunadamente, la metodología in vitro utilizada no es directamente aplicable a las condiciones de campo para las aves, ya que ésta no considera el efecto de la matriz de alimento y las actividades enzimáticas similares a las de un modelo in vivo. En consecuencia, es necesario realizar otros estudios experimentales para investigar el potencial de adsorción de éste y otros materiales provenientes de desechos agrícolas poco utilizados. Es bien sabido que, un tercio de los alimentos producidos se pierden o se desperdician a nivel mundial (alrededor de 1300 millones de toneladas por año, incluidos más de 1 millón de toneladas de desechos vegetales) [11]. En cuanto a los productos hortofrutícolas, la mayor generación de residuos ocurre durante las etapas de cosecha y procesamiento, por lo que tiene sentido pensar que, los residuos hortícolas se pueden utilizar para obtener productos de alto valor agregado. El kale (Brassica oleracea L.), es un importante producto hortícola, perteneciente a la familia Brassicaceae, que posee un alto contenido de antioxidantes y sustancias quimioprotectoras [12]. El kale, es un vegetal frondoso, con hojas de bordes rizados; sin embargo, la senescencia acelerada de las hojas conduce a la generación de grandes cantidades de desechos. Hasta el día de hoy, existe una falta de información sobre el uso de residuos del kale como material absorbente para la eliminación de aflatoxinas. En consecuencia, esta investigación se realizó para preparar, caracterizar, evaluar, y comparar el potencial de dos materiales preparados a base de desechos agrícolas para la adsorción de AFB1 utilizando un modelo dinámico in vitro que simula las condiciones del tracto gastrointestinal (TGI) de las aves.

Materiales y Métodos
Preparación de los bioadsorbentes
Los residuos agrícolas de kale (Brassica oleracea L.) y lechuga (Lactuca sativa L.) fueron donados por un grupo de productores hortícolas locales (Tenango del Valle, Estado de México, México). Los desechos se recolectaron al final de la temporada de invierno. Además, se utilizó como material de referencia un mineral zeolítico no comercial de TaxcoGuerrero, México. Las hojas de kale y lechuga se lavaron exhaustivamente para remover las impurezas. Posteriormente, las hojas se cortaron en fragmentos pequeños (10 cm) y se secaron por separado en un secador solar, el cual fue diseñado y fabricado por la UNAM-FESC. El diseño consiste en un secador solar natural con un colector de placa plana y un secador de gabinete. Los experimentos de secado se realizaron durante el mes de marzo de 2021 en el Laboratorio de Investigación en Energías Renovables (UNAM-FESC). Las muestras de kale y lechuga (1 kg) se distribuyeron uniformemente en las bandejas del secador y se deshidrataron utilizando una temperatura de aire de secado de 60° C y una velocidad de flujo de aire de 0.017 kg/s. La radiación global alcanzó el valor máximo de 1800 W/m2 a las 13:00 (hora local). Las pérdidas de peso de las hojas se calcularon repetidamente hasta que el valor de humedad promedio alcanzó un valor constante (aproximadamente 7%). Las muestras deshidratadas se molieron y se tamizaron (malla 60) para obtener los bioadsorbentes con un tamaño de partícula < 250 μm. Los materiales se almacenaron en recipientes de plástico a -20 ° C hasta su posterior análisis. Los materiales que se emplearon en los experimentos de adsorción se muestran en la Figura 1.
Figura 1. Bioadsorbentes a base de residuos de (a) kale, (b) lechuga y el adsorbente inorgánico (c) zeolita.
Figura 1. Bioadsorbentes a base de residuos de (a) kale, (b) lechuga y el adsorbente inorgánico (c) zeolita.
Ensayos de adsorción
Preparación de la dieta contaminada con AFB1
Se preparó una solución primaria de aflatoxina B1 (100 µg AFB1/ml) en dimetilsulfóxido (DMSO). Posteriormente, la solución concentrada con DMSO se diluyó en agua destilada hasta obtener 1 µg AFB1/ml. Se preparó una dieta a base de maíz y soya con 19.5% de proteína (13 MJ/kg de energía metabolizable). El análisis composicional de la dieta se muestra en la Cuadro 1. Finalmente, la dieta se contaminó hasta alcanzar un contenido de aflatoxinas de 100 µg AFB1/kg.
Cuadro 1. Análisis composicional de la dieta experimental.

Potencial de los residuos de kale y lechuga como adsorbentes de aflatoxina b1 en un modelo dinámico que simula las condiciones del tracto gastrointestinal de las aves - Image 1
1Suplemento vitamínico (por kg): vitamina A, 20,000,000 UI; vitamina D3, 6,000,000 UI; vitamina E, 75,000 UI; vitamina K3, 9 g; tiamina, 3 g; riboflavina, 8 g, ácido pantoténico, 18 g; niacina, 60 g; piridoxina, 5 g; ácido fólico, 2 g; biotina, 0.2 g; cianocobalamina, 16 mg; and ácido ascórbico, 200 g. 2Suplemento mineral (por kg): manganeso, 120 g; zinc, 100 g; hierro, 120 g; cobre, 10-15 g; iodo, 0.7 g; selenio, 0.4 g and cobalto, 0.2 g.
Modelo de digestibilidad in vitro
Se utilizó un modelo de digestibilidad in vitro dinámico que simula el tracto gastrointestinal (TGI) de las aves para evaluar la eficacia de los bioadsorbentes, frente a un material de referencia (zeolita). La metodología empleada fue la propuesta por Hernandez‐Patlán et al. [41] con modificaciones mínimas. La metodología consiste en el uso de una incubadora para demanda química de oxígeno a 40 ° C con un agitador orbital. Brevemente, se colocaron 5 g de la dieta contaminada con aflatoxina (100 µg AFB1/kg) y 0.5% (p/p) del bioadsorbente en tubos para centrífuga de polipropileno de 50 ml y se mezclaron vigorosamente. Para simular el buche, se agregó 10 mL de HCl 0.03 M, alcanzando un valor de pH aproximadamente de 5. Posteriormente, los tubos se incubaron durante 30 min a 40° C y se agitaron a 19 rpm. Después de la incubación, en cada tubo, se agregaron 2.5 mL de HCl 1.5 M y 3000 U de pepsina por gramo de alimento, alcanzando un pH de 2. Estas condiciones simularon el proventrículo, y los tubos se incubaron nuevamente por 45 min. El tercer compartimiento gastrointestinal que se simuló fue el intestino (pH ~ 7). Se agregaron 6.84 mg de pancreatina 8 en 6.5 ml de bicarbonato de sodio 1 M y los tubos se incubaron durante otros 120 min. En estas circunstancias, el procedimiento de digestión in vitro completo tomó 195 min. Al final de la incubación, los tubos se centrifugaron a 7000 × g durante 30 min y se colectó el sobrenadante para la cuantificación de AFB1. Se utilizaron muestras control (sin adsorbentes) para conocer la concentración real de AFBen las condiciones simuladas del TGI. Todas las determinaciones se realizaron por quintuplicado.

Determinación de las aflatoxinas
La determinación de aflatoxinas se realizó utilizando columnas de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales para aflatoxinas totales. El eluato obtenido de las columnas se usó para su análisis en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC). Se empleó la metodología descrita previamente por Hernández-Ramírez et al. [42]. Se utilizó un sistema Waters ACQUITY UPLC H-Class equipado con un administrador de disolvente y una columna de fase reversa ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 µm). Se inyectaron y se eluyeron las muestras colectadas de las columnas de inmunoafinidad (1 µL) con una mezcla ternaria de agua/metanol/acetonitrilo (64:18:18, todos de grado HPLC) a una velocidad de flujo de 400 µl/min. La detección se realizó con un detector de fluorescencia ajustado a 365 nm de excitación y 429 nm de emisión. La concentración de AFBse calculó utilizando una solución de aflatoxina estándar (AFB1, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) con una curva de calibración. El límite de detección de AFBfue de 0.002 µg/L.

Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier con reflexión total atenuada (FTIR-ATR)
En este estudio, se utilizó la espectroscopia FTIR-ATR para analizar las características vibracionales de los bioadsorbentes. Los espectros se adquirieron utilizando un espectrofotómetro Frontier SP8000 FTIR (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Los espectros se colectaron en un rango de 4000 a 400 cm−1 a una resolución de 4 cm−1. Posteriormente, los espectros se analizaron con el software Spectrum 10.4.2.
Los índices de enlace (IE) de los principales grupos funcionales, se calcularon utilizando las siguientes ecuaciones:
Para los bioadsorbentes:
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Para la zeolita:
Para la zeolita:
Donde: ABx= es el área de la banda alrededor del número de onda correspondiente (cm-1), y ∑ AB= es el área total de todas las bandas del espectro IR.
Punto de carga cero (pHpzc) y potencial zeta (potencial ζ)
La metodología de pHpzc se realizó agregando 125 mg de cada bioadsorbente a un conjunto de matraces que contenían agua destilada a diferentes valores de pH (2, 5, 7, 9 y 11). El pH se ajustó con HCl (0.1 M) o NaOH (0.1 M). Los valores de pH del agua destilada se indicaron como el pH inicial (pHi). Posteriormente, las muestras se agitaron durante 195 min a 200 rpm. Posteriormente, se evaluó el valor de pH del sobrenadante usando un electrodo de vidrio y se determinó el pH final (pHf) y se calculó la diferencia (ΔpH). El ΔpH se graficó frente al pH inicial (pHi), y el punto donde la línea cruzó el eje x, representó el pHpzc del bioadsorbente. Además, se realizaron mediciones del potencial ζ con un ZetaSizer Pro (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Todas las determinaciones se realizaron a temperatura ambiente diluyendo 500 μL de la suspensión del adsorbente (0.5% p/v) en 5 ml de agua desionizada. Se evaluaron muestras a cinco valores de pH diferentes (2, 5, 7, 9 y 11), incluidos los que simulan el modelo gastrointestinal. El punto isoeléctrico (pi) definido como el pH en el que el potencial ζ es cero, se obtuvo trazando la curva de potencial ζ frente al pH. Cada conjunto de experimentos (pHpzc y potencial ζ) se realizó por quintuplicado.
Determinación de clorofilas y carotenos en los bioadsorbentes
Espectroscopía UV-Vis con reflectancia difusa
Los espectros de reflectancia difusa se registraron en un rango de 300 a 700 nm con un espectrofotómetro Lambda 365 UV-Vis (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) equipado con una esfera integradora para capturar la luz difusa reflejada. Para proporcionar una reflectancia del 100%, se utilizó sulfato de bario (BaSO4) como material de referencia.
Análisis de los pigmentos fotosintéticos
Los pigmentos se determinaron cuantitativamente en las muestras que se usaron en la espectroscopia de reflectancia difusa. Las clorofilas y los carotenoides se extrajeron con etanol y se determinaron usando un espectrofotómetro Cary 8454 UV-Vis (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Los coeficientes de absorción propuestos por Lichtenthaler y Wellburn [39] se utilizaron para La determinación de clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b) y carotenoides totales (C x + c). Se utilizaron las siguientes ecuaciones para determinar su contenido:
Análisis de los pigmentos fotosintéticos
Para caracterizar aún más las clorofilas de los bioadsorbentes, los extractos etanólicos también se sometieron a espectrofluorometría. Para ello, se realizaron mediciones de fluorescencia utilizando un espectrofotómetro LS-55 de fluorescencia (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Los espectros se colectaron en el rango de longitud de onda de 575-800 nm. Los espectros de fluorescencia se recogieron a una longitud de onda de excitación de 440. Se calculó la proporción de fluorescencia (F690/F735) para indicar la actividad fotosintética potencial de los adsorbentes.
Diseño experimental y análisis estadístico
El experimento se realizó con un diseño completamente al azar con cinco repeticiones. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la comparación de medias se realizó con la prueba de Tukey con el software SAS [43]. Se utilizó un valor de significancia de α = 0.05 para distinguir diferencias significativas entre tratamientos.
Resultados
Experimentos de adsorción
Los experimentos de adsorción de AFB1 se realizaron utilizando un modelo in vitro dinámico que simuló el tracto gastrointestinal de las aves. La capacidad de adsorción de los biomateriales varió significativamente (Figura 2). El bioadsorbente preparado a partir del kale mostró el mejor porcentaje de adsorción (93.6%), seguido del bioadsorbente de lechuga (83.7%) y, finalmente la zeolita (75.5%). Como se muestra en la Figura 2, la capacidad de adsorción de los biomateriales fue más significativa, en comparación con la zeolita. Los controles (sin la adición de adsorbentes), mostraron una marcada falta de adsorción de AFB1 (< 4%).
Figura 2. Capacidades de adsorción de AFB1 de los bioadsorbentes y la zeolita, utilizando un modelo in vitro dinámico que simula el tracto gastrointestinal de las aves. Las cajas y bigotes que no comparten un superíndice común difieren significativamente (prueba de Tukey p < 0.05).
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Grupos funcionales implicados en la adsorción de aflatoxinas (FTIR-ATR)
En esta investigación, los adsorbentes preparados a partir de kale y lechuga removieron contenidos relativamente altos de AFB1, lo que sugiere que existen diferentes mecanismos de unión ente los adsorbentes y la molécula de AFB1. Por lo tanto, los adsorbentes se caracterizaron para obtener información sobre la interacción entre los grupos funcionales presentes en los biomateriales y la molécula AFB1. Los espectros de FTIR-ATR de los adsorbentes se muestran en la Figura 3. Se detectaron diferencias significativas en cinco vibraciones activas de los bioadsorbentes: (i) la banda relacionada con los grupos hidroxilo en 3281 cm-1, (ii) las vibraciones de frecuencia media a débil de las cadenas de alquilo en 2916 y 2850 cm-1, (iii) la fuerte vibración del grupo carboxilato a 1613 cm-1, (iv) la fuerte vibración del enlace C = C en los aromáticos a 1406 cm-1, y (v) la fuerte vibración molecular del enlace C – O a 1031 cm-1 (Figura 3, perfil a). Estos grupos funcionales tienen un papel esencial en la adsorción de AFB1, lo cual concuerda con nuestros trabajos anteriores [4,6,14,15]. Por otro lado, la zeolita (Figura 3, perfil b) mostró la banda característica alrededor de 3623 cm-1 asociada con Al3+–OH en la hoja octaédrica [16]. La zeolita también estaba hidratada, ya que se pueden observar bandas de absorción de agua significativas a 3388 y 1632 cm-1. La banda centrada en 997 cm-1 y la banda ubicada en 791 cm-1 están relacionadas con las vibraciones de estiramiento simétricas y antisimétricas de los enlaces Si-O-Si. La banda de absorción a 598 cm-1 se atribuyó a la presencia de heulandita [17]. La banda a 513 cm-1 se puede asignar a la presencia de los anillos dobles de la zeolita [18]. Finalmente, la banda de absorción a 440 cm-1 está asociada con la vibración de flexión de los enlaces Si – O [19].
Figura 3. Espectro FTIR y los grupos funcionales de (a) los bioadsorbentes y (b) la zeolita.
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Además, en el espectro FTIR de los bioadsorbentes, las posiciones y los números de las bandas de absorción tuvieron un comportamiento similar. Sin embargo, se detectaron diferencias significativas en su intensidad (transmitancia relativa). En este contexto, la intensidad de la banda y el área de la banda son dos parámetros que se usan comúnmente para calcular una concentración de un enlace químico en particular. El área de banda se usa a menudo porque este parámetro proporciona una variación menor, considerando que pueden presentarse varias bandas de absorción sobrepuestas. La Figura 4 muestra los índices de enlace presentes en los materiales absorbentes. Para los bioadsorbentes, se calcularon cinco índices de enlace: el estiramiento OH, el estiramiento antisimétrico y simétrico CH2 y CH3, el estiramiento C = O, el estiramiento C = C y el estiramiento C – O. En el bioadsorbente elaborado a partir de kale, se encontró que los índices de OH y C – O fueron significativamente más bajos que los del bioadsorbente de lechuga (Figura 3, perfil a). Además, los índices CH2 y CH3, C = O y C = C fueron significativamente más altos en el bioadsorbente de kale. El bioadsorbente preparado a partir de kale, presentó más grupos carboxilato (hasta un 37%), en comparación con el bioadsorbente a base de lechuga (Figura 3, perfil a). En cuanto a la zeolita, solo se calcularon tres índices de enlace: la vibración de los OH, las vibraciones antisimétricas y simétricas de los Si-O-Si y las vibraciones de los enlaces Si-O (Figura 4, perfil b). En general, el índice de Si-O-Si fue significativamente más alto que los demás.
Figura 4. Índices de enlace de los principales grupos funcionales de (a) los bioadsorbentes y (b) la zeolita. Media de cinco repeticiones ± error estándar. Para cada grupo funcional, las medias que no comparten un superíndice común difieren significativamente (Tukey p < 0.05).
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Punto de carga cero (pHpzc) y potencial zeta (potencial ζ)
La carga eléctrica neta de la superficie del adsorbente juega un papel esencial durante la adsorción. En este sentido, el pHpzc proporciona información útil sobre la carga superficial de los bioadsorbentes y asegura que la interacción electrostática sea uno de los mecanismos que dictan la adsorción. La Figura 5 (perfil a) muestra el pHpzc de los adsorbentes. El pHpzc del kale y la lechuga fueron muy similares, dando un valor de 6.2 y 6.3, respectivamente. Se registró un pHpzc de 8.8 para la zeolita. Para dilucidar aún más el posible mecanismo a través del cual los bioadsorbentes pueden adsorber AFB1 de manera eficiente, también se realizó un estudio del potencial ζ. La Figura 4 (perfil b) muestra la relación entre el potencial ζ y el pH de los materiales absorbentes. En general, el potencial ζ aumentó significativamente con el aumento del pH y alcanzó el máximo a pH 11. Además, se determinó que el punto isoeléctrico (pi) de los bioadsorbentes se encuentra en el rango de pH 2-3. El perfil b de la Figura 5, también muestra que la zeolita se cargó negativamente en todo el intervalo de pH (de 2 a 11); en consecuencia, no se pudo determinar el pi para este material.
Figura 5. Punto de carga cero (a) y la relación entre el potencial zeta y el pH de los bioadsorbentes y la zeolita (b). Media de cinco repeticiones ± error estándar. pi = punto isoeléctrico.
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Espectroscopía UV-Vis con reflectancia difusa
La Figura 6 muestra los espectros de reflectancia difusa de los adsorbentes. Para los bioadsorbentes, se observó una absorbancia variable tanto en la región visible como en el infrarrojo cercano del espectro (Figura 6, perfil a). En la región roja, se distinguen claramente dos bandas distintivas, una banda ancha a 677 nm y un hombro a 650 nm. En la región azul se observa un hombro a los 425 nm. Finalmente, en la región verde, se observa una moderada absorbancia a 550 nm. Además, la absorbancia aumentó significativamente al aumentar el contenido de pigmentos (hasta 0.95 U. A. en el bioadsorbente preparado a partir de kale). Finalmente, la zeolita solo mostró una transición intraconfiguracional en la región visible cerca de los 500 nm (Figura 6, perfil b).
Figura 6. Espectro UV-Vis de reflectancia difusa de (a) los bioadsorbentes y (b) la zeolita.
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Determinación cuantitativa de las clorofilas y los carotenos en los bioadsorbentes
En esta investigación, los principales pigmentos fotosintéticos de los bioadsorbentes se extrajeron con etanol y su contenido se determinó espectrofotométricamente utilizando los coeficientes de absorción de Lichtenthaler y Wellburn [39]. La Figura 7 (perfil a) muestra los espectros de absorción en donde se observaron dos máximos de absorción, uno en los 432 nm (región azul) y otro en los 665 nm (región roja). También, se logró observar la presencia de tres máximos de absorción en el rango espectral azul (418, 432 y 467 nm). Además, los extractos etanólicos de los bioadsorbentes se caracterizaron espectrofluorométricamente. En la Figura 7 (perfil b) se muestran los espectros de fluorescencia de los bioadsorbentes. Los espectros de ambos bioadsorbentes exhibieron dos máximos de fluorescencia cerca de 690 nm y 735 nm, respectivamente.
Figura 7. Espectros representativos de la absorción de clorofila (a) y de la intensidad de fluorescencia de la clorofila (b) en los bioadsorbentes.
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Sin embargo, la forma de los espectros de fluorescencia difiere considerablemente, observando que, con el aumento del contenido de clorofila en el bioadsorbente (Cuadro 2), la intensidad de fluorescencia disminuyó significativamente. Además, la proporción de fluorescencia de clorofila en los dos máximos (F690/F735) fue calculada a partir de los espectros de la Figura 6 (perfil b), los resultados indican que la proporción disminuyó considerablemente al aumentar el contenido de clorofila. La proporción F690/F735 para la lechuga corresponde al 0.113 y la de kale a 0.104. Estos resultados confirmaron que el bioadsorbente preparado a partir de kale presentó indudablemente más contenido de clorofila que el bioadsorbente de lechuga. Por lo tanto, el bioadsorbente preparado a partir de kale tuvo aproximadamente un 30% más de clorofila a y hasta un 57% más de carotenoides totales que el bioadsorbente de lechuga (Cuadro 2).
Cuadro 2. Contenido de clorofilas y carotenoides totales en los bioadsorbentes.
Cuadro 2. Contenido de clorofilas y carotenoides totales en los bioadsorbentes.
Mecanismo de adsorción de AFB1
La adsorción de AFB1 en los bioadsorbentes puede deberse a una combinación de interacciones electrostáticas y no electrostáticas (Figura 8). En general, las interacciones electrostáticas dependen del pH de la solución. A los valores de pH que se usaron en el modelo in vitro dinámico (pH 2-7), la molécula de AFBno está ni protonada ni desprotonada. Sin embargo, la adsorción de AFBaumentó significativamente por arriba del pH 6, lo que sugiere que la superficie de los bioadsorbentes se desprotonó significativamente, lo que aumentó la adsorción de moléculas de AFBbajo la simulación del pH intestinal (pH 7). Además, los bioadsorbentes contienen diversos grupos funcionales como: hidroxilo, amino, carboxilo y éster, los cuales pueden establecer de manera eficiente enlaces de hidrógeno con los átomos de oxígeno de los grupos éter, carbonilo y metoxi en la molécula de AFB1. Además, el alto número de índices de enlace relacionados con los grupos hidrófobos como CH2, CH3 y C = C en los bioadsorbentes, dio como resultado una superficie altamente hidrófoba, que favoreció la adsorción de moléculas AFB1 a través de interacciones dipolo-dipolo o hidrofóbicas. Finalmente, los bioadsorbentes también contienen cantidades considerables de pigmentos fotosintéticos, entre ellos la clorofila a, la cual puede formar complejos no covalentes con la molécula de AFB1, independientemente del pH [4].
Figura 8. Mecanismo propuesto para la adsorción de AFB1 por los bioadsorbentes
Figura 8. Mecanismo propuesto para la adsorción de AFB1 por los bioadsorbentes
Discusión y conclusiones
Experimentos de adsorción
La bioadsorción es una buena alternativa frente a los adsorbentes inorgánicos que actualmente se encuentran en el mercado para remover micotoxinas; sin embargo, estos últimos son capaces de liberar compuestos tóxicos para los animales (metales pesados, dioxinas, etc). Para conocer si un material puede tener éxito como adsorbente, se deben realizar diversas metodologías y técnicas para su caracterización antes de su uso. Hasta la fecha, solo se han realizado tres estudios para evaluar la capacidad de adsorción de aflatoxinas de diferentes materiales derivados de plantas utilizando procedimientos in vitro dinámicos que asemejan la digestión gastrointestinal [6,10,11]. En este contexto, Adunphatcharaphon et al. [10] evaluó la capacidad de adsorción de aflatoxinas de la cáscara de la fruta de durian (Durio zibthinus) utilizando un modelo in vitro que simuló ciertas condiciones del TGI. Después de dos horas de digestión gástrica, la piel de durian tratada con ácido (0.5% p/v) redujo significativamente la concentración de AFB1 tanto a nivel gástrico como intestinal. Después de completar el procedimiento de digestión, la cáscara de durian tratada con ácido redujo la bioaccesibilidad de AFB1 en un 95.1%. Además, Rasheed et al. [11] evaluó la capacidad de adsorción del orujo de arándano (0.2% p/v) mediante la simulación de ciertas condiciones de la sección gástrica (pH 2.5) e intestinal (pH 7). Las eficiencias de eliminación fueron de aproximadamente el 65% y el 70% en el compartimiento gástrico e intestinal, respectivamente. Aunque estos estudios son consistentes con nuestros hallazgos, estas metodologías pueden no ser directamente aplicables en condiciones in vivo, ya que estos modelos no consideran el efecto de una matriz de alimento. Además, las metodologías propuestas para preparar los bioadsorbentes consumen mucha energía o exigen procedimientos complicados y sustancias químicas altamente especializadas.
Recientemente, nuestro grupo de investigación evaluó las capacidades de adsorción de AFB1 de bioadsorbentes preparados a partir de la cáscara de plátano, hojas de Pyracantha y Aloe vera utilizando un modelo in vitro dinámico el cual simuló las condiciones del TGI de las aves [6]. En general, los materiales absorbentes orgánicos (1.5% p/p) redujeron significativamente la biodisponibilidad de AFB1 en la sección intestinal, siendo el Aloe vera el biomaterial con mayor capacidad de adsorción (68.5%). Sin embargo, como se muestra en la Figura 2, la capacidad de adsorción de estos nuevos adsorbentes fue mejor que la del polvo de Aloe vera, incluso con un contenido menor de adsorbente (0.5% p/p). Esta observación sugiere que la adsorción de AFB1 por los bioadsorbentes basados en residuos agrícolas podría lograrse mediante diferentes mecanismos químicos o físicos.
Grupos funcionales implicados en la adsorción de aflatoxinas (FTIR-ATR)
Como se observa en la Figura 3 (perfil a), una marcada disminución de los índices OH y C–O puede provocar una baja hidrofilicidad en el bioadsorbente de kale, lo que haría que su superficie fuera más favorable para la adsorción de las moléculas AFB1. Un alto número de grupos hidrófobos también puede ayudar a que el bioadsorbente de kale elimine AFB1 de manera eficiente. Se ha informado que un mayor número de grupos hidrófobos (como los grupos metilo y aromáticos) da como resultado una superficie altamente hidrófoba, lo que favorece significativamente la capacidad de adsorción [20]. Nuestro grupo de investigación estudió recientemente la interacción de la molécula AFB1 y los grupos funcionales presentes en el bioadsorbente de Pyracantha koidzumii empleando cálculos de teoría funcional de la densidad utilizando el conjunto funcional y base B3LYP/6-311++G (d, p) [15]. Las determinaciones indicaron que el carboxilato tiene la máxima energía de unión con la molécula de AFB1 (-40.2 kcal/mol), seguido del hidroxilo (-12.8 kcal/mol), luego el carbonilo (-11.4 kcal/mol) y, finalmente, los grupos amino (-8.6 kcal/mol). Estos resultados son consistentes con los encontrados en esta investigación, ya que el bioadsorbente preparado a partir de kale tiene más grupos carboxilato, hasta un 37% más que el bioadsorbente de lechuga (Figura 2, perfil a).
En cuanto a la zeolita, el índice de Si-O-Si fue significativamente más alto que los demás, lo que significa que la superficie de Si-O-Si es estrictamente hidrófoba [21]. Aunque la adsorción de AFB1 en las arcillas está mediada por atracciones electrostáticas débiles, otros mecanismos como la atracción moderada de donante-aceptor de electrones y un fuerte enlace de puente de calcio también son responsables de la adsorción de AFB1 [22].
Punto de carga cero (pHpzc) y potencial zeta (potencial ζ)
En solución, a pH> pHpzc, la superficie del adsorbente está cargada negativamente y podría interactuar con moléculas cargadas positivamente. Por el contrario, a pH < pHpzc, la superficie del adsorbente se carga positivamente (el agua ácida dona más protones que grupos hidróxido) y comienza a atrapar moléculas cargadas negativamente. En este contexto, Nava-Ramírez et al. [4] informó un valor de pHpzcde 5.65 para un bioadsobente preparado a partir de lechuga. Tal diferencia podría deberse en parte, a diferencias en la etapa de madurez, las condiciones atmosféricas durante el crecimiento y la fase de cosecha. Interesantemente, ambos bioadsorbentes (kale y lechuga) tienen superficies cargadas altamente negativas en el pH de la sección intestinal; como resultado, estos materiales presentaron adsorciones significativas de AFB1 en el modelo in vitro dinámico. Por otro lado, la zeolita mostró una carga positiva constante en el ango de pH de 2 a 8.8 (Figura 4, perfil a), lo que confirma que la adsorción de AFB1 no es impulsada principalmente por atracciones electrostáticas.
El potencial ζ es el potencial eléctrico en sistemas coloidales y provee información de la carga de las partículas en la superficie, por lo que es susceptible a modificación al cambiar el pH del medio. Esta afirmación se confirmó cuando se modificó el pH de las soluciones que contuvieron a los bioadsorbentes. Es importante destacar que ambos bioadsorbentes presentaron valores de potencial ζ altamente negativos en dos de los tres compartimentos del tracto gastrointestinal. Además, de acuerdo con los resultados del pi de los bioadsorbentes, se puede confirmar que, el potencial ζ es cero en los valores de pH de 2 a 3. En otras palabras, a estos valores de pH, las partículas no se mueven cuando se exponen a un campo eléctrico. Interesantemente, los valores de potencial ζ fueron significativamente más altos en el bioadsorbente de lechuga. En estas circunstancias, se esperaría que el adsorbente preparado a partir de lechuga adsorbiera más eficazmente a la molécula de AFB1, que el bioadsorbente de kale. Este nuevo hallazgo señaló que diferentes mecanismos podrían estar involucrados en la adsorción.
Espectroscopía UV-Vis con reflectancia difusa
Los pigmentos presentes en los bioadsorbentes cumplen varias funciones importantes. Por ejemplo: las clorofilas pueden formar complejos no covalentes con AFB1 [4]; los carotenoides son reconocidos como poderosos antioxidantes que eliminan tanto el oxígeno como los radicales peroxilo [23]; y las antocianinas también son potentes antioxidantes polifenólicos [24].Retomando los resultados de UV-Vis con reflectancia difusa, la banda de los 677 nm se puede asociar con la presencia de la clorofila a (Chl a), por otro lado, el hombro que se observa a los 650 nm se asocia con la clorofila b (Chl b). En la región de los 425 nm —donde absorben las clorofilas y los carotenoides— la absorción se puede atribuir a los carotenoides y, en menor medida, a la absorción de Chl b [25]. Finalmente, en la región de los 550 nm, se puede asociar con la presencia de antocianinas [26]. En cuanto a la zeolita, la región visible cerca de 500 nm, suele estar asociada con los oligómeros de FeOx en el material arcilloso [27].
Determinación cuantitativa de las clorofilas y los carotenos en los bioadsorbentes
Numerosos estudios han demostrado que las clorofilas tienen un potencial anticancerígeno significativo contra una amplia gama de carcinógenos humanos, incluida la AFB1 [28-31]. Por lo tanto, se han propuesto diferentes mecanismos responsables de la actividad preventiva del cáncer, incluida la actividad antioxidante [32,33], la modulación de las vías de desintoxicación [34], la inducción de la apoptosis [35] y la captura de carcinógenos [4, 36-38]. El último mecanismo es el más recomendable para estudiar, ya que, en nuestro trabajo anterior, se demostró que la formación de complejos AFB1- clorofila mejora la tasa de absorción de AFB1 por bioadsorbentes que contienen cantidades considerables de clorofilas [4]. Por lo tanto, la hidrofobicidad de las clorofilas y los carotenoides sugiere una mejor eficiencia para capturar AFB1 en el modelo in vitro dinámico. En el espectro UV-Vis se pudieron observar dos máximos de absorción sobresalientes (432 nm y 665 nm) los cuales corresponden a la Chl a. Los carotenoides presentaron una amplia absorción con tres máximos (418, 432 y 467 nm). Estos resultados obtenidos por espectroscopía UV-Vis indicaron que el bioadsorbente preparado a partir de kale tenía mayor cantidad de pigmentos fotosintéticos, en comparación con el de la lechuga. En un intento por confirmar estos resultados, las clorofilas se caracterizaron adicionalmente espectrofluorométricamente, la intensidad de fluorescencia de los espectros disminuyó significativamente debido a la reabsorción de la fluorescencia de longitud de onda más corta de alrededor de los 690 nm [40].

Conclusión
En esta investigación, dos adsorbentes fueron ecológicamente preparados a partir de residuos de kale y de lechuga; ambos exhibieron capacidades de adsorción competitivas. El bioadsorbente preparado a partir de kale tuvo una capacidad de adsorción de AFB1 significativa en el modelo in vitro dinámico que simula las condiciones del TGI de las aves. La metodología de ahorro de energía rentable y respetuosa con el medio ambiente que se utilizó para preparar los bioadsorbentes, ofrece la posibilidad de reducir su costo de producción. Por lo tanto, los residuos de kale pueden considerarse un material de desecho agrícola prometedor para el desarrollo de nuevos adsorbentes de AFB1. Este es el primer estudio que muestra que los bioadsorbentes no modificados a partir de desechos agrícolas y que contienen cantidades considerables de pigmentos fotosintéticos tienen una capacidad significativa para eliminar AFB1 en un modelo gastrointestinal in vitro dinámico. Aunque este modelo parece ser e más completo y realista que los disponibles en la literatura, también tiene algunas limitaciones, ya que no hay células caliciformes, microbiota, ni células del sistema inmunológico dentro del modelo in vitro dinámico. En consecuencia, los bioadsorbentes deben probarse en un modelo in vivo y así poder demostrar su idoneidad para contrarrestar los efectos tóxicos de la AFB1. Esta investigación está en progreso en nuestros laboratorios.

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[43] SAS/STAT. [En línea]. Available: http://www.okstate.edu/sas/v8/saspdf/stat/pdfidx.htm . [Último acceso: 7 July 2021].

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Autores:
María de Jesús Nava Ramírez
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Luis Rafael Molina Morales
6 de octubre de 2022
Excelente tema, me podrían informar si hay algún estudio de los cambios citologicos en un manual que causan micotoxinas en hígado y tracto digestivo. Muchas gracias
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