Modelos predictivos de complejos fúngicos/micotoxinas basados en el ambiente. Caso de estudio: complejo Fusarium verticillioides/fumonisinas (FB) en maíz

Las micotoxinas son compuestos tóxicos producidos por una gran variedad de hongos filamentosos, especialmente de los géneros Aspergillus (aflatoxinas), Penicillium (ocratoxinas) y Fusarium (deoxinivalenol, zearalenona, fumonisinas), como resultado de su metabolismo secundario. El consumo de alimentos contaminados con micotoxinas tiene consecuencias negativas en la salud humana y animal, asociadas a sus efectos cancerígenos, teratogénicos, embriotóxicos, hepatotóxicos, estrogénicos e inmuno-supresores, pudiendo éstos últimos favorecer la aparición de otras enfermedades. Se supone que los tejidos vegetales más fuertemente colonizados por un hongo tienen una mayor biomasa fúngica y consecuentemente un mayor contenido de micotoxinas.

Mermas en cantidad y calidad del grano de maíz cosechado se relacionan frecuentemente al accionar de hongos toxigénicos. Se ha encontrado que Fusarium verticillioides es el hongo más prevalente y agente causal de la podredumbre de espiga en las regiones maiceras de Argentina, siendo las fumonisinas (FB) las micotoxinas prominentes (Chulze et al, 1996; Presello et al., 2008). Las FB pueden producir edema pulmonar en cerdos, leucoencefalomalacia en equinos, inmunosupresión y se han relacionado al cáncer de esófago. F. verticillioides puede entrar a las espigas de maíz por infecciones en estigmas (principal vía de entrada), en forma sistémica a partir de plántula y por heridas causadas por insectos barrenadores. El advenimiento de resistencia transgénica a estos insectos, con la expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis (maíces Bt), permitió la reducción de las podredumbres de espiga/contaminación con micotoxinas. A campo, la efectiva disminución en los niveles de FB en el grano de maíz se logra previniendo la infección fúngica a través del uso de genotipos menos susceptibles (Iglesias et al., 2010).

El crucial impacto de los factores meteorológicos sobre el crecimiento fúngico/síntesis de FB, estimuló el desarrollo de modelos predictivos mecanísticos o empíricos con base ambiental a nivel mundial. En Argentina, Martínez et al. [2010] desarrollaron sendos modelos de regresión logística de respuesta ordinal para predecir la contaminación con FB₁ y FB₂ en grano de maíz a cosecha (híbrido susceptible a la podredumbre de espiga causada por F. verticillioides). Altos niveles de FB se relacionaron a la mayor ocurrencia sincrónica de precipitación y alta humedad del aire durante el período crítico (17 días) en torno a la fecha de aparición de estigmas. Recientemente se analizaron otras bases de datos de contenidos de FB en muestras granarias colectadas en el país y se extrajeron conclusiones:

a) Muestras de grano de maíz extraídas de ensayos (EEA INTA) sembrados con híbrido experimental susceptible

Se analizó el efecto de las condiciones meteorológicas imperantes en un lapso temprano (AE: aparición de estigmas) y tardío (MF: madurez fisiológica) del ciclo del maíz, sobre la variabilidad en el contenido en grano de FB a cosecha (Moschini et al., 2017). La concentración de FB fue analizada en 35 muestras de grano (Laboratorios del Instituto Nacional de Tecnología Industrial y del Instituto Tecnología de los Alimentos- INTA) de un híbrido susceptible (L4674xL4671) a la podredumbre de espiga (Fusarium verticillioides), implantado en varias campañas/sitios de la región pampeana. Modelos de regresión logística (ver apéndice 1) de respuesta ordinal se ajustaron con la base de datos completa y con la que resultó de la remoción de casos con máximos registros de estrés por sequía en torno a AE y ambiente conducente a la infección en MF. Para excluir ciertos ambientes, un índice de sequía [IS (°Cdía/mm)=∑₁³⁰Amplitud térmica diaria*Días sin Precipitación (Prec) / Prec acumulada] fue calculado en un lapso de 30 días centrado en la fecha de AE. Muy altos valores de IS y favorables condiciones para la infección en MF se observaron en dos sitios (campaña 2011/12) con muestras granarias muy contaminadas con FB (mal clasificadas por los modelos), aislándose del análisis (Fig.1).

Modelos logísticos más precisos se ajustaron con los 33 casos remanentes. El mejor modelo incluyó variables asociadas a la ocurrencia de días con Prec combinado con altos valores térmicos y de humedad relativa (HR) en torno a la fecha de AE (requerido para la generación de eventos de infección fúngica) y al registro de días con alta humedad relativa del aire en torno a MF, que lentifica el secado del grano y favorece la síntesis de FB (Ec. 1).

LogitPS= -7,7131 + 2,6962 PPrecTHR_AE+ 0,0865 DHR_MF Ec. 1

LogitPMac= -2,0093 + 2,6962 PPrecTHR_AE+ 0,0865 DHR_MF

PS: probabilidad de observar un nivel de FB severo (S,FB>4230 µg kg^-1, percentil 90%). PM: probabilidad de un nivel moderado (M,FB>2215 y <=4230 µg kg^-1). PrL=1-(PS+PM) siendo PL la probabilidad de un nivel ligero a nulo (L, FB<=2215 µg kg^-1, percentil 50%). PPrecTHR_AE: periodos de dos días con ocurrencia de Prec>0,2 mm, HR>70%, y Tx<33°C y Tn>19,5°C (día 1) y HR>70% en el día 2. DHR_MF: días con HR>=85%. PPred=28/33*100=84,8%. Períodos críticos: AE: inicio=fecha AE - 7 días, finalizando al acumular 210 GD (Temperatura media diaria (Td) base inferior=10°C, Td base superior=30°C); MF: inicio=40 días siguientes a fecha de AE-7 días, finalizando al acumular 1000 GD (Td base inferior=0°C).

Modelos predictivos de complejos fúngicos/micotoxinas basados en el ambiente. Caso de estudio: complejo Fusarium verticillioides/fumonisinas (FB) en maíz - Image 1

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^{Figura 1. Valores de la variable meteorológica PPrecTHR_MF calculada en torno a madurez fisiológica (MF) para las observaciones con más elevados índices de sequía (IS:°Cdías/mm) en el lapso de 30 días centrado en la fecha de aparición de estigmas (AE). PPrecTHR_MF: periodos de dos días con ocurrencia de Prec>0,2 mm, HR>70%, y Tx<33°C y Tn>19,5°C (día 1) y HR>70% en el segundo día; IS(°Cdía/mm)=∑₁30Amplitud térmica diaria*Días sin Prec/Prec acumulada; Per: Pergamino, Bar: Barrow, Man: Manfredi, Par: Paraná.}

b) Muestras de grano de maíz extraídas de ensayos (campos demostrativos de BAYER) sembrados con híbrido comercial Bt DK747 MGRR2. (Borsarelli et al., 2017)

La concentración de FB fue analizada (Laboratorio Instituto Tecnología de los Alimentos-INTA) en 23 muestras de grano del híbrido Bt de maíz implantado en las campañas 2009/10 a 2011/12 en la región pampeana. Modelos de regresión logística de respuesta binaria se ajustaron con la base de datos completa y con la que resultó de la remoción de casos con máximos registros de estrés por sequía en torno a la fecha de aparición de estigmas (AE) y ambiente conducente a la infección/síntesis de FB en madurez fisiológica (MF). Con criterios similares usados en el análisis precedente, muy altos valores del índice de sequía (IS>245,1°Cdía/mm, percentil 75%) y favorables condiciones para la infección/síntesis de FB (DPrecTHR_MF*DPrec_MF>=12; percentil 70%) en MF, se observaron en dos sitios (Balcarce: 2009/10 y Venado Tuerto: 2011/12) con muestras granarias muy contaminadas con FB, aislándose del análisis (Fig. 2). El cuadrante NE de la región pampeana presenta una mayor frecuencia de años que manifiestan dichas condiciones (IS>245,1 °Cdía/mm y DPrecTHR_MF*DPrec_MF>=12), cuando se analizan maíces de siembra temprana (AE: fin de diciembre). El cuadrante NO presenta en cambio los valores más bajos (IS no supera el umbral de 245,1°Cdía/mm, se intensifica el régimen monzónico de lluvias). En maíces tardíos (AE: principios de febrero) los valores de frecuencia bajan notoriamente en la zona núcleo sojera-maicera y en el sur de Buenos Aires.

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^{Figura 2. Valores del producto de las variables DPrecTHR_MF*DPrecHR calculadas en torno a madurez fisiológica (MF) para las observaciones con más elevados índices de sequía (IS:°Cdías/mm) en el lapso de 30 días centrado en la fecha de AE. DPrecTHR_MF: días con ocurrencia de Prec>0,2 mm, HR>70%, y Tx<33°C y Tn>18°C; DPrecHR: días con Prec>0,2mm y HR>=81% IS(°Cdía/mm)=∑₁30 Amplitud térmica diaria*Días sin Prec/Prec acumulada; Pjo: Pehuajó, VTu: Venado Tuerto, EFo: El Fortín, Bal: Balcarce}

El mejor modelo logístico ajustado con los 21 casos remanentes (Ec.2) incluyó a la variable DPrecTHR_AE, asociada a la ocurrencia de días con Prec combinado con altos valores térmicos y HR (requerido para la infección fúngica), y a DPrec_MF que cuenta los días con registro de Prec en torno a MF (se favorece la síntesis de FB al reducir la velocidad de secado del grano en planta).

LogitPS= - 4,6539 + 1,1036 DPrecTHR_AE+ 0,2148 DPrec_MF Ec. 2

PS: probabilidad de observar una contaminación con FB severa (S,FB >=1010 µg kg^-1, percentil 65%). PL=1-PS siendo PL la probabilidad de un nivel de FB ligero (L, FB<1010µg kg^-1). DPrecTHR_AE: días con ocurrencia de Prec>0,2mm, HR>70%, y Tx<33°C y Tn>18°C. DPrec_MF: días con registro de Prec>0,2mm. PPred=85,7%. Períodos críticos: AE (aparición de estigmas): inicio= fecha AE - 7 días, finalizando al acumular 260 GD (Td base inferior=10°C, Td base superior=30°C); MF (madurez fisiológica): inicio= 40 días siguientes a la fecha AE - 7 días, finalizando después de acumular 1000 GD (Td base inferior=0°C).

Para maíces de siembra temprana (AE: 31/12), el sector N de la región pampeana y especialmente el NO de Córdoba, presenta condiciones meteorológicas muy favorables para la expresión del complejo fúngico/micotoxina (Fig. 3). El porcentaje de años con un nivel severo de FB se duplica en el S de Buenos Aires en el caso de maíces de siembra tardía (AE: 10/2). Para este objetivo se corrióla Ec.2en 37 estaciones meteorológicas para la serie 1971-2015.

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^{Figura 7. Frecuencia de años (en %) con un nivel severo de concentración de FB (FB>=1010 µg kg-1) estimado mediantela Ec. 2 para dos fechas de aparición de estigmas: 31/12 (izquierda) y 10/2 (derecha)}

c) Muestras de grano de maíz extraídas de camiones en terminales portuarias (se sabe sitio de origen en región pampeana) (SENASA-INTA. Campañas: 2004/05 a2006/07. N=42 Modelo logístico ordinal (Ec. 3) y binario (Ec.4) (Sancho et al., 2017)

LogitPS= -9,0506 + 1,3652 DPrecT_AE+ 0,9116 DPrecT_MF Ec. 3

LogitPMac= -6,762+1,3652 DPrecT_AE+ 0,9116 DPrecT_MF

PS: probabilidad de observar un nivel de FB severo (S,FB >=816 µg kg^-1). PM: probabilidad de un nivel moderado (M,FB>=467 y <816 µg.kg^-1); PL: probabilidad de un nivel ligero (L, FB<467 µg.kg^-1). PPred=37/42*100=88,1%

LogitPS= -15,2097 + 3,5192 DPrecTHR_AE+ 1,9771 DPrecT_MF Ec. 4

PS: probabilidad de observar un nivel de FB severo (S,FB >=594µg kg^-1); PL: probabilidad de un nivel ligero (L, FB<594µg kg^-1). PPred=41/42*100=97,6%. P*=0,55: valor de probabilidad para clasificar al nivel de FB como severo (S) que alcanza la > precisión de predicción. DPrecT_AE: días con ocurrencia simultánea de Prec>0.2 mm, y Tx<32.9°C y Tn>18°C. DPrecTHR_AE: días con ocurrencia simultánea de Prec>0,2mm, Tx<32,9°C y Tn>18°C y HR>=70%, DPrecT_MF: días con ocurrencia simultánea de Prec>1mm, y Tx<25°C y Tn>13.3°C. Períodos críticos:AE: aparición de estigmas: 17/12 al 15/1; MF: madurez fisiológica: 15/2 al 2/4.

d) Muestras de grano de maíz extraídas de ensayos con híbridos convencionales y Bt en sitios del NOA. Analizadas por Elisa. Campañas: 2009/10 a 2011/2012 (Juárez et al., 2017)

LogitPS= -4,5375 + 0,867 DPrecT_AE * DPrec_MF+ 4,9081 GS Ec. 5

PS: probabilidad de observar un nivel de contaminación con FB severo (S,FB>=1150µg kg^-1, percentil 25%). PL=1-PS, siendo PL: probabilidad de un nivel ligero (L, FB<1150µg kg^-1). PPred=23/26*100=88,5%. DPrecT_AE: número de días con registro de Prec>1 mm, en el intervalo térmico: Tx<33ºC y Tn>18°C. DPrec_MF: días con Prec>0,2 mm. GS: grado de susceptibilidad de los híbridos: 1 (convencionales); valor 0 (Bt). Períodos críticos: AE: aparición de estigmas: Inicio: fecha de siembra+650°D; Fin: fecha de siembra+900°D; MF: madurez fisiológica: Inicio: fecha de siembra+1880°D; Fin: fecha de siembra+2160°D

Conclusiones

-Mediante técnicas de regresión logística se ajustaron modelos para estimar las probabilidades de niveles de concentración de FB en grano de maíz a cosecha, en base a variables meteorológicas calculadas en los períodos críticos de aparición de estigmas (AE) y de madurez fisiológica (MF).

-En AE, donde el hongo infectante puede ingresar a la espiga, la correlación entre el contenido de FB y días con Prec fue negativo a débilmente positivo, elevándose significativamente (+) al combinarse con la temperatura (rango térmico 18-19,5°Ca33°C) y HR (>70%). Las variables PPrecTHR, DPrecTHR y DPrecT, calculadas en torno a la fecha de AE, están ligadas a los requerimientos del hongo para la infección (fuente de mojado: precipitación).

- En MF, todas las variables incluídas en los modelos descriptos accionan sobre la velocidad de secado del grano. Más días con las características de DPrec_MF, DPrecT_MF (rango térmico: 13,3°C-25°C) y DHR_MF (>=85%) llevan a lentificar el proceso de secado, extendiendo el tiempo con mayor actividad agua en grano y favoreciendo de esta forma la síntesis de FB.

-Situaciones que contradicen la tendencia general y conducen a muy altas contaminaciones con FB, se observaron con la ocurrencia de extrema sequía en torno a AE (se afectaría la longitud de las chalas y la firmeza con que se ajustan a la espiga) y favorables condiciones para la infección/síntesis de FB en MF.

^{Apéndice 1:Regresión logística: con el propósito de identificar las variables meteorológicas más fuertemente asociadas a los niveles binarios (S: Severo; M-L: Moderado a Ligero) u ordinales (S, M y L) de intensidad de la enfermedad o de tasa de incremento epidémico o de concentración de micotoxinas, en muchos trabajos se calculan en primera instancia los correspondientes coeficientes de correlación no-paramétrica de Kendall Tau-b. A partir de la maximización de estos coeficientes queda establecida la ventana temporal donde son calculadas las variables meteorológicas. Luego, por medio del método de máxima verosimilitud y la función logit como nexo, se ajustan modelos de regresión logística que relacionan la probabilidad de la variable respuesta binaria u ordinal con variables explicativas. Siendo LogitPS=ln(PS/1-PS), donde PS es la probabilidad de ocurrencia de un nivel severo (S) en la variable respuesta y ln es el logaritmo natural. El modelo logístico, con X₁ y IX₁X₂ (interacción) como predictores, puede ser escrito como: LogitPS=ln(PS/1-PS)= β0 + β1 X₁+ β2 IX₁X₂, en el cual β0 a β2 son los parámetros. Mediante la resolución de las expresiones Exp(LogitPS)/(1+Exp(LogitPS)) o 1/(1+Exp(-LogitPS) se obtiene el valor de PS, mientras que PL=1 - PS (respuesta binaria). Para la respuesta ordinal, el procedimiento de regresión logística da una segunda ecuación por la cual se puede calcular la probabilidad acumulada de ocurrencia de un nivel igual o mayor al moderado de la expresión: PMac=Exp(LogitPMac)/(1+Exp(LogitPMac)), siendo PM=PMac-PS. La probabilidad de un nivel de la variable respuesta ligera a nula (L) se calcula como: PL=1-(PS+PM). El más alto valor de probabidad define el nivel de respuesta pronosticado. La precisión de predicción (PPred%) representa el porcentaje de casos analizados correctamente clasificados.}

Modelos predictivos de complejos fúngicos/micotoxinas basados en el ambiente. Caso de estudio: complejo Fusarium verticillioides/fumonisinas (FB) en maíz

Granos contaminados con micotoxinas, Fernando Tamames (Special Nutrients)

Análisis de Micotoxinas: Myco 5-in-1 PLUS