Micotoxinas "enmascaradas”: un potencial riesgo

Los cereales pueden ser invadidos por hongos tanto en el campo, durante la formación del grano y la cosecha, como en el transporte y almacenamiento. Hay aproximadamente 400 compuestos de bajo peso molecular que son reconocidos como micotoxinas por sus efectos tóxicos sobre la salud humana y animal. Sin embargo, las regulaciones y recomendaciones para piensos y materias primas solo establecen niveles para algunos de estos compuestos, como por ejemplo aflatoxina B1, fumonisinas B1 y B2, ocratoxina A, deoxinivalenol, zearalenona, toxina HT-2 y toxina T-2. Dichas micotoxinas están muy bien caracterizadas en numerosos trabajos científicos, pero ¿qué se sabe de las otras micotoxinas? Existe un grupo demicotoxinas que, por su creciente frecuencia y su conocido potencial tóxico, son posibles candidatas a regulación y actualmente están sobre la mesa de debate en EFSA (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria) para futuras recomendaciones. Una parte de estas micotoxinas no reguladas son las comúnmente llamadas micotoxinas “enmascaradas".

En la literatura existe una variedad de términos que se utilizan de forma indistinta y que puede dar lugar a confusión: “enmascaradas”, “ocultas”, “conjugadas”, “modificadas” y “unidas/ligadas”, entre otros. Si bien todos estos términos tienen en común que se refieren a variaciones de la molécula original o micotoxina libre, hay pequeñas diferencias que vale la pena tener en cuenta para evitar confusiones.

El tema de las micotoxinas “enmascaradas” comenzó a atraer el interés científico a mediados de la década de 1980, después de varios casos de micotoxicosis en los que los síntomas de los animales afectados no se correlacionaban con el bajo contenido de micotoxinas detectado en el alimento (Berthiller et al., 2015). En 1990, Gareis et al.,utilizaron por primera vez el término micotoxinas “enmascaradas” para referirse a derivados de las micotoxinas que no se detectaban por los métodos de análisis de rutina y que, sin embargo, contribuían a la toxicidad. Es decir, el término “enmascaramiento” inicialmente se refería a cuestiones analíticas y no a un tema de estructura u origen. Según esta definición, con la aplicación de una tecnología capaz de detectar dichos derivados, el término “enmascaradas” dejaría de tener sentido. Sin embargo, aunque en la actualidad el uso de métodos basados en la cromatografía líquida y la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) permiten detectar y cuantificar derivados de micotoxinas, el término “enmascaradas” se sigue utilizando. Según Berthiller et al. (2013), a fin de evitar malentendidos y confusión, el término micotoxinas “enmascaradas” debe usarse exclusivamente para los metabolitos de las micotoxinas producidos por las plantas.

El mecanismo de defensa de las plantas frente a cualquier xenobiótico puede dividirse en tres fases. Durante la primera, llamada fase de transformación, se modifican químicamente las moléculas tóxicas mediante reacciones de oxidación, reducción y/o hidrólisis. Durante la fase II, se da la conjugación (fase de conjugación) a pequeñas moléculas (glutatión, azúcares o ácidos orgánicos), de esta manera se vuelven más polares, lo que facilita su posterior unión a enzimas, transportadores u otras proteínas relevantes para su eliminación. Finalmente, en la fase III (fase de compartimentación), se transportan a vacuolas para ser almacenados o acumulados en el apoplasto (figura 1).

Existen otras sustancias derivadas de micotoxinas que tampoco son detectables en un análisis de rutina y que,sin embargo,no son producidos por las plantas (al menos no principalmente). Se trata de metabolitos biológicos originados por hongos o por los propios animales, así como derivados formados durante el procesamiento térmico del alimento (Berthiller et al., 2009) (tabla 1). Todos estos compuestos no quedan englobados en el término micotoxinas “enmascaradas", según la definición anterior, pero sin embargo tienen la característica de no detectarse por método rutinarios. En 2014,Rychlik et al.,con el fin de armonizar la terminología en el ámbito científico, propuso un sistema de clasificación para las micotoxinas modificadas, incluyendo las “enmascaradas”, que establece una jerarquía sistemática de cuatro niveles (figura 2). Esta definición fue recogida por EFSA en su dictamen científico sobre micotoxinas modificadas (EFSA J., 2014).

Este sistema de clasificación distingue en primer lugar entre micotoxinas libres, micotoxinas asociadas a la matriz y micotoxinas modificadas. Las micotoxinas modificadas se clasifican además en aquellas que se modifican biológica o químicamente. En cuanto a las modificaciones biológicas, se pueden producir por el metabolismo de plantas, animales, hongos u otros medios. Este sistema de clasificación se basa en la forma en que se produce la modificación, de ahí que algunos compuestos puedan pertenecer a más de una categoría, por ejemplo el sulfato de zearalenona es un metabolito sintetizado por plantas y también por hongos. Es un sistema abierto para que en el futuro puedan incluirse nuevos compuestos.

La investigación sobre derivados de micotoxinas se ha expandido enormemente debido al progreso en el desarrollo de métodos analíticos capaces de detectar nuevos compuestos a bajos niveles de concentración. Especialmente en los últimos 10 años se han podido elucidar continuamente nuevas formas modificadas en plantas (Malachova et al., 2018).

Así pues, por “enmascaradas” se entienden exclusivamente las micotoxinas biológicamente modificadas por plantas. Según los estudios publicados, el fenómeno de “enmascaramiento” está relacionado principalmente con toxinas de Fusarium (tricotecenos, zearalenona, fumonisinas, toxina T2 y HT2), y esto es debido a que son los principales hongos que infectan a las plantas en el campo, a diferencia de la infección por Aspergillus o Penicillium que se da principalmente durante el transporte o el almacenamiento. Sin embargo, no puede descartarse la formación de alguna forma modificada de AFB1, ya que los cultivos pueden ser más susceptibles a la infección por especies aflatoxigénicas en condiciones cálidas y húmedas, así como en sequías (Benito et al., 2020).

Debido a la falta de patrones y de materiales de referencia, actualmente la mayoría de los estudios están dirigidos a DON, seguido por ZEA, y por el contrario, se dispone de muy pocos datos para las formas modificadas de tricotecenos menores como NEO, DAS, FUS-X, así como para las toxinas T2 y HT2 (EFSA, 2014).

En los últimos años se han descrito nuevas formas “enmascaradas”, como nivalenol-3-glucósido (NIV-3G) y fusarenon-X-glucósido (FUSX-3G) en trigo (Berthiller et al., 2015), formas gulosidadas de las toxinas T2 y HT2  (T2-3G y HT2-3G) en trigo y avena (Busman et al., 2011 y 2016), así como la conjugación de DON con L-glutatión (GSH) en trigo (Kluger et al., 2015) (Tabla 2).

Básicamente hay dos posibles estrategias de análisis, directas e indirectas, según los analitos de interés y el equipo de laboratorio disponible se puede aplicar una u otra. En cuanto a los métodos directos, que cubren las formas solubles (entre las que se encuentran las micotoxinas “enmascaradas”), la técnica más utilizada es la LCMS,la cual permite un análisis preciso, rápido y específico. Desafortunadamente, para su aplicación es imprescindible conocer perfectamente la estructura química del analito y contar con patrones puros (Malachova et al., 2018). Para la mayoría de las micotoxinas “enmascaradas” los patrones analíticos no están disponibles, sin embargo los de más fácil acceso son: 3-AcDON, 15-AcDON, DON-3G, ZEA-14G y ZEA-14S.

Los problemas derivados de la falta de patrones analíticos pueden evitarse mediante la aplicación de métodos indirectos, como es la hidrólisis primaria (enzimática, acética y básica) de micotoxinas conjugadas antes del análisis. Esta estrategia proporciona una medida relativamente rápida del contenido total de micotoxinas pero no diferencia entre micotoxinas libres y “enmascaradas”, además la hidrólisis puede ser inadecuada o destructiva, subestimando así los resultados. La principal ventaja es que no hacen falta patrones puros (Berthiller et al., 2013).

Por otro lado, existen métodos inmunoquímicos, ampliamente conocidos y utilizados para el control de rutina de forma rápida, sencilla y más económica. Si bien dichos métodos no se desarrollaron específicamente para cuantificar micotoxinas “enmascaradas”, pueden tener cierta utilidad ya que en ocasiones responden a más de un compuesto, es decir, a la micotoxina libre y a su forma “enmascarada”. Si el anticuerpo utilizado en el kit tiene una afinidad significativa por las formas enmascaradas, se obtendrá como resultado una señal que representa la suma de ambas formas (Rychlik et al., 2014). Este efecto se conoce como "reactividad cruzada" y viene especificado por el fabricante en las instrucciones del kit. Se ha demostrado que los inmunoensayos comerciales desarrollados para detectar DON detectan DON-3-Glc en diversos grados (Ruprich y Ostry, 2008; Tangni et al., 2010). La “reactividad cruzada” no permite cuantificar las formas enmascaradas, pero sí podría mejorar la evaluación general del riesgo de los animales por el consumo de alimento contaminado.

En el campo de la determinación de micotoxinas existe una clara tendencia al uso de métodos de análisis múltiples basados en cromatografía líquida acoplada a varios analizadores de masas (LC-MS/MS). Los flujos de trabajo basados en LC-MS/MS proporcionan una selectividad y sensibilidad significativamente más altas, una mayor confianza en la identificación de analitos, y también facilita el uso de procedimientos de preparación de muestras optimizados que ahorran tiempo y mano de obra, reduciendo los costes generales asociados con la detección de micotoxinas (Malachova et al., 2018).

La información sobre la incidencia de las formas enmascaradas ha aumentado considerablemente, debido a la mayor preocupación que existe sobre este tema en la comunidad científica y también a un mayor acceso a equipos LC-MS/MS por parte de los laboratorios que analizan micotoxinas.

De los derivados de DON, DON-3G es el de mayor incidencia, seguido por 3Ac-DON y 15Ac -DON. Los datos revisados sobre ZEA y sus metabolitos son menos abundante, siendo ZEA-14S la forma modificada de mayor incidencia (Kovalsky et al., 2016, Bryla et al., 2018).

La proporción relativa de DON-3G/DON en los cereales puede variar considerablemente, entre un 20 y más de un 70%, dependiendo de la especie de cereal y del genotipo, así como de las condiciones climáticas (Rychlic et al., 2014). De Boevre et al. (2012) encontraron concentraciones significativas de las formas modificadas de DON y ZEA, en diferentes muestras de materias primas y piensos, en unas proporciones relativas entre un 4 y un 39% para DON-3G/DON, y entre un 2 y un 25%  paraZEA-4G/ZEA. Streit et al. (2015) detectaron un total de 139 metabolitos en el análisis de 83 muestras de piensos y materias primas, las principales micotoxinas “enmascaradas” detectadas fueron DON-3G y ZEA-4S en un 75 y 49% respectivamente. DON-3G frecuentemente coexiste con DON en granos de trigo, maíz, cebada y avena, a concentraciones de 2 a 1700ug/kg y su incidencia alcanza hasta el 100% (Zhang et al., 2019, Bryla et al., 2018).

Según EFSA (2014), la proporción de las formas modificadas respecto a las libres, en alimentos y piensos, podría alcanzar un 110% para ZEA, un 30% para NIV y un 10% para T2 y HT2.

El riesgo de exposición a micotoxinas modificadas puede ser importante por lo que deberían destinarse esfuerzos para extender las regulaciones/recomendaciones existentes de manera de incluir en el futuro también formas de DON y ZEN “enmascaradas” (Bryla et al., 2018).

 ¿Qué efectos tienen las micotoxinas “enmascaradas” sobre la salud?

A pesar del amplio conocimiento que existe sobre la incidencia de micotoxinas “enmascaradas” en cereales, no existen suficientes trabajos científicos sobre su toxicidad. El conocimiento sobre la relevancia toxicológica de las micotoxinas modificadas es todavía muy escaso (Kovac et al., 2018). Lo que está claro es que, al ser la conjugación a grupos polares un proceso de detoxificación en plantas, las micotoxinas “enmascaradas” son menos tóxicas que sus formas originales (Berthiller et al., 2015, Gratz 2017). Por ejemplo, la capacidad de inhibir la síntesis de proteínas se ve drásticamente reducida en D-3G en  comparación con la molécula original DON, tanto 15Ac-DON como 3Ac-DON son igual o menos tóxicos que DON, y la forma conjugada de ZEA, Z-14G, produce una actividad estrogénica mucho menor en comparación con la forma libre (Berthiller et al., 2013, Rychlic et al., 2014).

El hecho de que las micotoxinas “enmascaradas” sean menos tóxicas es probable que esté relacionado con los cambios en su estructura. La conjugación, por ejemplo con una molécula de glucosa, bloquearía el sitio activo de la micotoxina que le otorga su toxicidad, limitando así la interacción de los grupos fundamentales con los objetivos celulares ( Zhang et. al, 2019).

Aunque el nivel de toxicidad intrínseca es más bajo en las micotoxinas “enmascaradas”, su toxicidad podría resurgir cuando la molécula conjugada se hidrolice en el tracto digestivo, liberando así el precursor tóxico o micotoxina libre, lo que contribuye a una toxicidad impredecible. Este es el argumento de más peso para abordar los posibles efectos tóxicos, considerar su toxicidad indirecta a través de la hidrólisis a sus formas libres.

EFSA, en su dictamen científico del 2014 sobre los riesgos para la salud humana y animal relacionados con la presencia de formas modificadas de micotoxinas en alimentos y piensos, reconoce que, aunque no hay información sobre la toxicidad de las micotoxinas conjugadas, éstas pueden tener importancia toxicológica y decide optar por un enfoque pragmático: asume la misma toxicidad para las formas conjugadas que sus correspondientes formas libre.

Las altas proporciones de micotoxinas “enmascaradas” que coexisten con sus formas libres en diferentes cereales y alimentos a base de cereales podrían aumentar considerablemente laexposición a las micotoxinas y plantear riesgos adicionales para la salud animal. Por otro lado, es más que probable que tales formas “enmascaradas” estén involucradas en casos de micotoxicosis de difícil explicación.

Además de aplicar las estrategias ampliamente conocidas para el control de micotoxinas, sería interesante estudiar la identificación de genotipos de cereales que utilicen una vía de desintoxicación la cual conduzca a derivados menos tóxicos, cuya formación sea irreversible, para así reducir la incidencia de micotoxinas.

Es recomendable continuar destinando esfuerzos en la implementación del análisis de micotoxinas “enmascaradas” de forma rutinaria, lo cual puede contribuir a la evaluación del riesgo y la identificación de límites tolerables de estos compuestos.

Figura 1. Formación de micotoxinas “enmascaradas” por  conjugación con glucosa en el metabolismo de fase II, es uno de los principales mecanismos de desintoxicación de las plantas para resistir la acumulación de micotoxinas (Zhang et al., 2019).

Tabla 1. Diferentes derivados de micotoxinas, según su origen, y principales matrices donde se producen (Berthiller et al., 2009).

Figura 2. Sistema de clasificación propuesto por  Rychlik et al. (2014) para las micotoxinas modificadas.

Tabla 2. Principales micotoxinas enmascaradas descritas en la literatura.