INTRODUCCION
La deficiencia de selenio (Se) se ha asociado con algunas patologías del bovino como enfermedad del músculo blanco, retención de placenta, inmunosupresión y mastitis, entre otras (Miller y col 1993); igualmente, alteraciones en el crecimiento y desarrollo estarían relacionadas con cambios en el metabolismo hormonal tiroideo inducidos por la deficiencia de Se (Wichtel y col 1996a, Wichtel y col 1996b).
El yodo, zinc y Se participan en la síntesis de las hormonas tiroideas (Ruz y col 1999). Además, el Se forma parte de la estructura de diferentes proteínas del organismo y su concentración en la glándula tiroides es más alta que en otros tejidos (Howie y col 1995); también, es constituyente de cuatro glutatión peroxidasas y tres iodotironina 5’-deiodinasas (DI; EC 3.8.1.4), tipos I, II y III, entre otras selenoproteínas (Wichtel 1998, Holben y Smith 1999). La DI tipo I se expresa en diferentes órganos, como el hígado, riñones y glándula tiroides, la tipo II lo hace en el sistema nervioso y el tejido adiposo pardo, y la tipo III en el útero y la placenta (Wichtel 1998, Allan y col 1999, Arthur y col 1999, Holben y Smith 1999).
Las DI catalizan la deiodinación de la prohormona 3,5,3’,5’-tetrayodotironina (L-tiroxina, T4) a su forma metabólicamente activa la 3,5,3’-triyodotironina (T3) (Berry y Larsen 1992, Brent 1994, Arthur y col 1999). Las hormonas tiroideas tienen como efecto el aumento de la tasa metabólica celular. En particular sobre el metabolismo lipídico, la actividad tiroidea es inversa a la concentración sérica de colesterol, lo que estaría indicando que una hipercolesterolemia podría asociarse con alteraciones de la función tiroidea; pero, una hipocolesterolemia tiene poco valor como indicador de hipertiroidismo (Brent 1994, Duntas 2002).
En rebaños lecheros del sur de Chile se ha descrito la deficiencia de Se diagnosticada mediante la determinación de la actividad eritrocitaria de la enzima antioxidante glutatión peroxidasa (GSH-Px; EC 1.11.1.9) (Ceballos y col 1998a , Wittwer y col 2002). En vacas lecheras mantenidas en praderas con forrajes con un bajo contenido de Se, las concentraciones de T3 se mantuvieron significativamente más bajas durante la lactancia que en vacas suplementadas con Se (Contreras y col 2002, 2005). También se han descrito signos clínicos compatibles con una deficiencia de Se en caprinos Cashmere, habiéndose observado una respuesta positiva a la suplementación con Se, considerándose el cambio de peso como indicador (Ceballos y col 1999b); sin embargo, no se observaron diferencias en la concentración de T4 entre las cabras suplementadas y no suplementadas con Se (Ceballos y col 1999ab); pero, no se estudió el efecto sobre colesterol, lipoproteínas y triacilgliceroles.
MATERIAL Y METODOS
Animales seleccionados y grupos experimentales.En este estudio se trabajó con doce vacas Frisón Negro Chileno, clínicamente sanas, gestantes (siete meses) y con una edad promedio de cinco años, las que fueron asignadas a uno de dos grupos con seis vacas cada uno. Los grupos fueron homogéneos en cuanto a la edad de las vacas, número de partos, peso, condición corporal y producción de leche según el registro de la lactancia previa al estudio. Ambos grupos recibieron una ración con bajo contenido de Se, manteniéndose un grupo durante todo el estudio con esta ración (Se-D) y el otro grupo recibió vía subcutánea una dosis única de Se (Se-S) aproximadamente 45 días antes del parto. Los animales no recibieron ningún tratamiento que pudiera afectar las concentraciones séricas de T3, T4 o los lípidos séricos estudiados, tales como glucocorticoides o sulfonamidas.
Alimentación. Las vacas se mantuvieron desde seis semanas antes del parto en cubículos con comederos individuales, en piso de concreto y con cama de paja de trigo. Durante el preparto cada vaca recibió diariamente 9,5 kg de heno con un bajo contenido de Se (0,02 ppm base materia seca) y un kg de un concentrado comercial (Cosetan®, Biomaster-IANSA, Chile) con un contenido de Se de 0,12 ppm base materia seca. Al momento del parto las vacas permanecieron tres días con sus crías antes de empezar su ordeño mecánico dos veces por día. Las vacas recibieron durante la lactancia 11,5 kg de heno, 0,5 kg de afrecho de soya (Se: < 0,17 ppm base materia seca), 0,15 kg de sales minerales sin Se y 0,5 kg de sebo oxidado para alimentación animal (Se: < 0,1 ppm base materia seca) desde 15 días postparto y durante todo el período de estudio. El sebo oxidado se ofreció con el objeto de inducir un ambiente propio de estrés oxidativo. Además hasta 5 kg de Cosetan® y hasta 0,12 kg de urea, tratando de satisfacer los requerimientos y preservando mantener una ración con un bajo contenido de Se. El máximo consumo de Se durante el período previo al parto fue 0,03 mg/kg base materia seca, y durante la lactancia 0,05 mg/kg base materia seca. El consumo de alimento se controló diariamente pesando la cantidad ofrecida y el eventual alimento no consumido. La condición corporal promedio al parto para las vacas Se-S fue 3,0, mientras que en el grupo Se-D fue 2,90 al mes posparto el valor fue más bajo llegando a 2,1 y 2,0 para las vacas Se-S y Se-D, respectivamente. El agua se mantuvo ad libitum y la leche se pesó diariamente hasta finalizar el estudio.
Suplementación con Se y obtención de muestras. El grupo suplementado recibió 1 mg de Se/kg/pv usando selenato de bario (BaSeO4) (Deposel®, Young Animal Health Ltd., New Zealand) en dosis única de 1 mL/50 kg/pv, mientras que las vacas del grupo Se-D no recibieron suplementación.
De cada vaca se obtuvieron simultáneamente dos muestras de sangre (con y sin heparina) mediante venopunción coccígea, en el período previo al parto y a la suplementación (45 días antes del parto) y luego en la lactancia cada 15 días hasta 105 días postparto. La muestra de sangre con heparina, previa determinación de la concentración de hemoglobina, fue hemolizada con un diluyente comercial (Ransel diluyente®, Randox Lab., Irlanda del Norte) y se mantuvo a -20 ºC hasta el análisis de la actividad sanguí- nea de GSH-Px; igualmente, el suero se mantuvo a una temperatura similar hasta el análisis de la concentración de las hormonas T3 y T4, colesterol, lipoproteínas de alta (HDL), baja (LDL) y muy baja densidad (VLDL) y triacilgliceroles (TAG).
Análisis. El balance nutricional de Se fue evaluado mediante la actividad sanguínea de GSH-Px en un hemolizado de las muestras de sangre tomadas con heparina en ambos grupos de vacas. Se empleó un reactivo comercial (Ransel®, Randox Lab., Irlanda del Norte) basado en una técnica cinética compuesta NADPH dependiente, según la modificación del método descrito por Paglia y Valentine en 1967 (Ceballos y col 1998a ). Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro Hitachi 4020 (ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y la actividad se expresó en U/g Hb e interpretada según Ceballos y Wittwer (1996) y Ceballos y col (1998a ), quienes señalan que los valores inferiores a 60 U/g Hb se consideran deficientes, entre 61 y 100 U/g Hb como bajo-marginal, entre 101 y 130 U/g Hb marginales y sobre 130 U/g Hb son adecuados. Las concentraciones séricas de T3 y T4 se midieron mediante un inmunoensayo utilizando la técnica de electroquimioluminescencia en un equipo Elecsys 1010® (ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), los resultados se expresan en nmol/L. Además se determinaron las concentraciones séricas de colesterol (método enzimático CHOD-PAP), lipoproteínas HDL (método fosfotungstato magnesio CHOD-PAP), LDL (ecuación de Friedewald), VLDL (método enzimático GPO-PAP) y TAG (método enzimático GPO-PAP). Los análisis se realizaron mediante espectrofotometría UV usando reactivos comerciales (ROCHE Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y los resultados se expresaron en mmol/L.
El análisis del contenido de selenio se realizó mediante espectrometría de masa con plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), previa digestión de la materia orgánica de la muestra con ácido nítrico y perclórico. Los análisis se realizaron en los Laboratorios Hill en Nueva Zelanda.
Análisis estadístico. El diseño correspondió a un estudio longitudinal completamente al azar. Las diferencias entre grupos y entre períodos se establecieron mediante una prueba de análisis de varianza (ANDEVA) para un modelo jerárquico/parcelas-divididas (split-plot) según la ecuación:
Yij = μ + αttment(i) + βj + αβttment(i), j + Ai + εij
En donde:
Yij = GSH-Px en la i-ésima vaca al tiempo j.
µ = media general.
αttment(i) = efecto del tratamiento en la i-ésima vaca.
βj = efecto de la j-ésima observación en la i-ésima vaca.
αβttment(i), j = interacción.
Ai = efecto aleatorio de la i-ésima vaca.
εij = error.
Posteriormente se realizó una prueba de comparación múltiple de Bonferroni, ajustándose el nivel de significancia según el número de comparaciones. El análisis se efectuó usando el PROC MIXED de SAS (SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA) empleando también la opción REPEATED para incluir la matriz de varianzas-covarianzas entre medidas repetidas en un mismo individuo.
RESULTADOS
Glutatión peroxidasa.La actividad sanguínea de GSH-Px observada en las vacas que recibieron la ración baja en Se (Se-D) disminuyó a lo largo del estudio con respecto a los valores observados en el grupo Se-S (P < 0,05), observándose un valor basal de 111 ± 21 U/g Hb, valor considerado bajo-marginal a los 30 días de la suplementación (89 ± 13 U/g Hb) y al final del estudio (65 ± 8 U/g Hb). En el grupo Se-S la actividad sanguínea de GSH-Px aumentó desde 119 U/g Hb previo a la suplementación hasta 300 U/g Hb al final del período experimental (P < 0,05, figura 1).
Hormonas tiroideas.El promedio de las concentraciones séricas basales para T3 fue 1,8 ± 0,2 nmol/L y 1,6 ± 0,2 nmol/L para las vacas Se-D y Se-S respectivamente (P > 0,05). La concentración de T3 se redujo, encontrándose la concentración más baja durante la lactancia (1,4 ± 0,1 nmol/L), entre 45 y 60 días después de iniciado el ensayo (P < 0,05), no observándose diferencias según el tratamiento en los diferentes períodos de muestreo (P > 0,05), posteriormente los valores se incrementaron hasta el final del estudio (P < 0,05).
Las concentraciones séricas basales de T4 presentaron diferencias significativas entre los grupos Se-D y Se-S, los valores fueron 84,3 ± 2,2 nmol/L y 103,0 ± 9,7 nmol/L para Se-D y Se-S respectivamente (P < 0,05). Estas concentraciones disminuyeron en ambos grupos (P < 0,05) dos semanas después, valores que se mantuvieron bajos hasta 60 días después de iniciado el estudio y posteriormente se incrementaron sin alcanzar valores similares a los basales (figura 2). No se observaron diferencias en la concentración de T4 entre los grupos Se-D y Se-S en los diferentes períodos de muestreo (P > 0,05).
Perfil lipídico.El promedio de las concentraciones basales de colesterol fue similar (P > 0,05) entre los grupos Se-D (3,7 ± 0,2 mmol/L) y Se-S (3,7 ± 0,1 mmol/L), valores que declinaron significativamente dos semanas después (P < 0,05), iniciándose posteriormente un incremento hasta 75 días después de iniciado el estudio (figura 3). El consumo de una dieta baja en Se no produjo cambios significativos en la concentración promedio de colesterol entre ambos grupos (P > 0,05).
Previo al momento de suplementar las vacas, las concentraciones de HDL fueron similares entre los grupos estudiados (P > 0,05), disminuyendo dos semanas después en ambos grupos (figura 3) e incrementándose a partir de este momento (P < 0,05). A lo largo del estudio se observó una tendencia a una concentración mayor en el grupo Se-D (3,4 ± 0,2 mmol/L), mientras que para el grupo Se-S el promedio encontrado fue 3,0 ± 0,1 mmol/L (P = 0,047).
Las concentraciones de LDL disminuyeron hasta el día 15 después de iniciado el estudio, posteriormente aumentaron en forma significativa (P < 0,05, figura 3) en ambos grupos. No se observaron diferencias en la concentración de LDL entre ambos grupos Se-S y Se-D en los períodos estudiados (P > 0,05).
Las concentraciones para las lipoproteínas VLDL y las concentraciones para TAG no presentaron diferencias entre los grupos Se-D y Se-S (P > 0,05), observándose sólo variaciones entre los diferentes períodos del estudio (P < 0,05).
Producción de leche. La producción promedio de leche en el grupo Se-D fue 13,8 ± 3 kg/día y 14,0 ± 3 kg/día en el grupo Se-S (P > 0,05). La máxima producción se alcanzó en la cuarta semana postparto, siendo similares las producciones entre los grupos (P > 0,05).
DISCUSION
Las dietas con un bajo contenido de Se causan una baja actividad sanguínea de GSH-Px (Ceballos y Wittwer 1996). Así, la suplementación bajo diferentes formas de presentación de Se han inducido un incremento en la actividad de GSH-Px, ya que la actividad de la enzima está relacionada con el aporte del mineral (Wichtel 1998, Ceballos y col 1999c ). En este estudio la suplementación con selenato de bario produjo una mayor actividad de GSH-Px, la que en el grupo Se-S fue mayor a partir del día 45 del estudio (figura 1). La actividad de la enzima aumenta después de la incorporación del mineral en los eritrocitos, proceso lento que conlleva un período de espera para evaluar el efecto de la suplementación por medio de la actividad de GSH-Px en sangre (Grace y col 2001).
Los resultados obtenidos en el presente trabajo concuerdan con otros estudios donde se han obtenido diferencias al suplementar con Se bajo la forma de selenato de bario, observándose que la actividad de la enzima se eleva a partir del día 46 después del tratamiento (Grace y col 2001). Asimismo, diferentes formas químicas de suplementación con Se han demostrado ser efectivas para inducir un aumento en la actividad de GSH-Px, lo que indica que estas formas químicas usadas para la suplementación se metabolizan en forma similar (Ortman y Pehrson 1999, Gunter y col 2003, Rowntree y col 2004).
Con respecto a la concentración de hormonas tiroideas, el bajo consumo de Se en la dieta puede inducir cambios en sus valores séricos en caprinos, bovinos y terneros (Wichtel y col 1996ab, Awadeh y col 1998, Rowntree y col 2004). Pese a lo anterior, no se ha demostrado que haya una interacción significativa entre el Se y el yodo, aunque la deficiencia del primero podría exacerbar el efecto de un bajo consumo de yodo (Wichtel y col 1996ab, Arthur y col 1999).
En este estudio las concentraciones de T3 fluctuaron dentro del rango de referencia (0,8-2,0 nmol/L) descrito por Burton (1992) e inferiores al señalado por Tiirats (1997). Los valores obtenidos para T4 fueron inferiores al límite inferior referencial (57-129 nmol/L) señalado por Burton (1992), observándose algún grado de recuperación desde el día 90 del estudio en adelante sin lograr valores similares a los observados previamente al parto (figura 2). Sin embargo, la concentración de ambas hormonas fluctuó dentro del rango observado para vacas productoras de leche en el sur de Chile (Contreras y col 1999, Matamoros y col 2003, Contreras y col 2005).
La concentración de T3 no presentó diferencias entre los grupos a lo largo del estudio, mientras que los valores promedio de T4 fueron diferentes sólo para el valor basal (figura 2). En otros estudios se han descrito resultados diferentes, donde un bajo consumo de Se en la dieta para terneros condujo a una disminución en la concentración de T3 (Wichtel y col 1996b) o un consumo adecuado en la ración para vacas (Awadeh y col 1998) causó incrementos en la concentración de T3 sin afectar la de T4.
Las diferentes DI contienen residuos de selenocisteí- na en posiciones correspondientes a los codones UGA (TGA) en los respectivos ARN mensajeros (Allan y col 1999, Arthur y col 1999), lo que conlleva a un aumento de la actividad de las diferentes DI al suplementar con Se (Holben y Smith 1999, Bates y col 2000). La DI tipo I es responsable de la producción de dos terceras partes como mínimo de la T3 circulante derivada de la T4 (Brent 1994, Awadeh y col 1998, Arthur y col 1999), en un mecanismo donde el residuo de selenocisteína acepta la molécula de yodo en el centro activo de la enzima (Berry y Larsen 1992), originando un aumento de la concentración de T3. Contrario a lo observado en este estudio, en otros reportes se ha observado una disminución significativa de la T4, efecto atribuido a una mayor deiodinación de la hormona; pero, no se encontraron cambios significativos en la concentración de T3 (Wichtel y col 1996a ).
Las concentraciones de hormonas tiroideas también se pueden ver afectadas por factores diferentes al contenido de Se en la dieta, como son el contenido de yodo en la ración, el consumo de grasas y el estado fisiológico de la vaca, entre otros (Grum y col 1996, Tiirats 1997, Arthur y col 1999, Contreras y col 1999, Matamoros y col 2003). Por lo tanto, su concentración obedece al resultado de múltiples factores y no se debería sólo al consumo de selenio.
Con respecto a los resultados del perfil lipídico se pudo establecer que no hubo diferencias significativas en las concentraciones de colesterol, lipoproteínas LDL y VLDL y TAG entre ambos grupos de vacas. En otros estudios se ha descrito el hallazgo de cambios en el metabolismo lipídico asociados con la concentración sérica de Se, observándose una elevación del colesterol y LDL en individuos con concentraciones bajas del mineral (Qu y col 2000, Huang y col 2002).
El grupo de vacas Se-D presentó una mayor concentración de HDL, encontrándose apenas una leve evidencia de significancia en los resultados (P = 0,05). No obstante, la prueba estadística usada tuvo el suficiente poder (1-ß) para evitar errores en la prueba de significancia. Contrario a estos resultados, en roedores y mujeres se ha observado una concentración de HDL significativamente más baja en individuos con valores séricos de Se disminuidos (Qu y col 2000, Lee y col 2003). Lo anterior sería sugerente de la participación del Se en el metabolismo lipídico bien sea a través de un mecanismo directo o indirecto, pero esto requiere la realización de estudios posteriores; adicionalmente, no se encontraron referencias en la literatura internacional donde se haya evaluado el efecto de la ración con un bajo contenido de Se sobre la concentración de lipoproteínas en el bovino, lo que dificulta la comparación de los resultados con estudios similares.
El metabolismo de las lipoproteínas es un proceso complejo, donde unas se derivan de precursores aportados por otras lipoproteínas (Murray y col 2000). En el bovino el proceso de formación de las lipoproteínas es similar al descrito para los humanos con algunas variantes, especialmente en el fraccionamiento de estos compuestos (Bauchart 1993). La tendencia observada en este estudio podría estar asociada con una disminución en la síntesis de HDL, puesto que la actividad tiroidea regula la actividad de algunas de las enzimas que intervienen en el transporte de las lipoproteínas. Ha sido descrito (Duntas 2002) que la proteína que transfiere ésteres de colesterol y la lipasa hepática dependen del estado funcional de la tiroides, incrementando su actividad en los casos de elevaciones subclínicas de la concentración hormonal tiroidea, lo que conlleva a una reducción en la concentración de HDL.
Variaciones en el metabolismo de las lipoproteínas también están relacionadas con factores diferentes a la función tiroidea; así, se han descrito cambios asociados con el estado nutricional y productivo del rumiante (Bauchart 1993), balance energético (Grummer 1993, Drackley 1999), consumo de grasas en la dieta y los cambios asociados en la respuesta a estímulos hormonales mientras dure el uso de la grasa (Grum y col 1996, Drackley 1999), y con alteraciones circadianas en la síntesis o utilización lipídica independientes de cambios circadianos en los lípidos séricos (Bitman y col 1990).
Finalmente, la producción de leche está determinada por varios factores, entre otros se cuentan el estado sanitario general, la sanidad mamaria y la nutrición; pese a lo anterior, la suplementación con nutrientes específicos no siempre produce un incremento en la producción. Los resultados de este estudio concuerdan con lo anterior al no encontrarse diferencias para la producción de leche entre ambos grupos. En otros estudios se han obtenido resultados similares donde no se obtuvieron diferencias en la producción de leche al suplementar con Se en forma de bolos (Wichtel y col 1994) o como selenato de bario (Grace y col 2001).
En consideración a los resultados obtenidos, es posible señalar que el bajo consumo de Se manejado con la suplementación con selenato de bario no indujo cambios en la concentración de T3, así como tampoco en la concentración de colesterol, lipoproteínas o TAG, observándose sólo una tendencia a una mayor concentración de lipoproteínas HDL en las vacas que recibieron una dieta baja en Se, mediante un mecanismo que no está completamente dilucidado en el bovino y cuya comprobación requiere de la realización de estudios posteriores con un mayor número de animales. Por el momento, la implicancia que tiene esta observación sobre el metabolismo lipídico del bovino sugiere que la suplementación con Se en animales eutiroideos puede producir una disminución en la concentración de HDL, afectando el metabolismo en el inicio de la lactancia o induciendo cambios en las funciones donde se requiere esta lipoproteína.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Henry Mesa por sus amables sugerencias para el mejoramiento en el análisis de los resultados.
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