Eliminación de L-canavanina durante el ensilado de Vicia villosa. ¿Se podría evitar la toxicidad producida en pastoreo?

La Vicia spp. es una leguminosa anual que se utiliza con fines agronómicos como “puente verde” para la fijación de nitrógeno y evitar la erosión del suelo, entre otros aspectos. También suele utilizarse para pastoreo en bovinos durante el invierno. Sin embargo, el consumo de Vicia villosa por bovinos puede provocar un cuadro tóxico, principalmente cuando la planta se encuentra en estado de floración o fructificación. Si bien no está completamente dilucidado cual es el principio tóxico, se cree que la L-canavanina, aminoácido no proteico podría estar involucrada. El objetivo de este trabajo es determinar si la concentración de L-canavanina disminuye en el ensilado de V. villosa para brindar una alternativa al pastoreo realizando reservas forrajeras.

El Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado del INTA Balcarce realizó una visita en diciembre de 2020 a un establecimiento ganadero ubicado en el departamento de Chapaleufú, provincia de La Pampa en donde se reportaron casos de intoxicación por consumo de V. villosa. Se tomaron muestras de partes aéreas en estado de floración de V. villosa de diferentes potreros (potrero problema y control). Las muestras se mantuvieron a 4ºC hasta su posterior procesamiento. Para el ensilado, se cortaron las plantas a un tamaño máximo de 5 cm y se incorporaron a microsilos de PVC, con un peso medio de 5 kg, se compactaron para generar un estado de anaerobiosis y se agregaron 5 mg de inoculante (Silobac 5®, CHR HANSEN) para generar un medio ácido. Luego de 2 años, se abrieron los microsilos para su análisis. Para el henificado, se dejaron secar las muestras a temperatura ambiente durante dos días. Se conservaron en un lugar seco a temperatura ambiente hasta su análisis. Para ambos potreros se utilizaron las partes aéreas y las semillas para su análisis individual.

La detección y cuantificación de L-canavanina se realizó por cromatografía en capa delgada en un equipo automatizado (CAMAG). Como control se usó una solución de 1mg/ml de L-canavanina (Sigma-Aldrich®). A partir de 2 g de cada una de las muestras vegetales, se realizaron extracciones sucesivas. Primero se agregaron 50 ml de una mezcla etanol:agua (80:20), se sonicó por 15min y se filtró. A los restos vegetales se le agregaron posteriormente 50 ml de HCL 0,1N siguiendo el mismo procedimiento descrito. Este último paso se repitió una segunda vez. Se utilizaron placas de Silica Gel 60 F254 (Merck) y se sembraron 5 μl de cada una de las muestras y cantidades variables de testigo (0,5-4 ug). La placa fue desarrollada bajo condiciones controladas de temperatura (24 ºC) y humedad (33%). Se utilizó como fase móvil butanaol:agua:acido acético (2:1:1). La placa fue revelada con ninhidrina (0,3%) y calor y se observó bajo luz visible y UV 365. Posteriormente la placa fue analizada densitometricamente a 500 nm. Se integraron las áreas bajo la curva para realizar la curva de calibración con testigo de Lcanavanina y cuantificar su presencia en cada una de las muestras. Además, se realizó espectro de absorbancia de la banda de la L-canavanina posterior a la derivatización

Al analizar la placa de TLC luego del revelado con ninhidrina, se observó una banda naranja-marrón a un Rf=0,29 para L-canavanina testigo, y una banda coincidente en color y Rf en las muestras obtenidas de semillas henificada de V. villosa extraídas con HCl 0,1 N. La presencia de L-canavanina en semillas concuerda con lo reportado en la bibliografía (Rosental, 1990). Cuando se analizaron las muestras totales (partes aéreas+semillas) del henificado de ambos potreros, no se detectó L-canavanina bajo las condiciones descriptas. Esto podría deberse a un efecto de dilución en el total de la muestra. La cuantificación de Lcanavanina en semillas de muestras henificadas fue de 1,55 y 2,3% P/P en muestras problema y control respectivamente. Por otro lado, no se detectó L-canavanina en las semillas ni en la muestra total (partes aereas+semillas) de V. villosa ensilada de los potreros problema y control. Sin embargo, se observa la aparición de otras bandas más polares, que podría estar evidenciando una degradación o modificación de L-canavanina o correspondiente a compuestos que no pudieron ser caracterizados aun y se encuentran en estudio.

La eliminación de la L-canavanina en la V. villosa ensilada podría indicar una buena alternativa para la utilización de este forraje, ante la sospecha de una potencial intoxicación. No obstante, hay que seguir profundizando en el análisis de los compuestos encontrados y su toxicidad.

Este es el primer reporte donde se utiliza esta técnica para la detección de L-canavanina.