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Desarrollo de un inmuno-ensayo enzimático (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos

Publicado: 10 de julio de 2018
Por: Adriana Guadalupe Martínez Covarrubiasa, Marco Antonio Santillán Floresb, Claudia CelicGuzmán Ruizc, Lucía del Carmen Favila Humarab, Dionicio Córdova Lópezb, Efrén DíazApariciob, Laura Hernández Andradeb, Miguel Ángel Blanco Ochoaa aFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México.bCENID-Microbiología. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), carretera México Toluca km. 15.5, Colonia Palo alto. DelegaciónCuajimalpa
Resumen
Los objetivos del trabajo fueron estandarizar y desarrollar un ELISA con antígeno protoplasmático obtenido de una cepa de Mycobacterium avium paratuberculosis (Map) 3065 de origen ovino, para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos. El antígeno se fijó en las placas a concentraciones de 10, 5, 2.5 y 1.25 µg/100 µl y se probaron diluciones de los sueros control positivo y negativo de 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160. El punto de corte se estableció con un intervalo de confianza del 95 % y dos desviaciones estándar. Para determinar la sensibilidad y especificidad del ELISA se trabajó con 491 sueros de bovinos, así como también, se colectaron muestras de heces para efectuar el aislamiento bacteriológico, y la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para la detección de Map. Los resultados de las tres pruebas fueron analizadas para determinar la asociación o concordancia por medio de una prueba de Kappa La concentración de antígeno y suero que dieron mejor diferencia entre los controles fue de 1.25 µg/100 µl antígeno y la dilución del suero 1:160, el punto de corte se estableció a una densidad óptica de 0.196; la sensibilidad que se obtuvo fue 79.31 %, la especificidad 82.25 % y el índice de concordancia de 0.2763 del ELISA con respecto al cultivo. Los resultados obtenidos permiten recomendar el ELISA con antígeno protoplasmático de la cepa de Map 3065, como una alternativa para el diagnóstico de la paratuberculosis en bovinos.
 
PALABRAS CLAVE: Paratuberculosis bovina, ELISA, Antígeno protoplasmático, Mycobacterium avium paratuberculosis.
INTRODUCCIÓN
La paratuberculosis (ptb) o enfermedad de Johne, es una enteritis granulomatosa de curso crónico que afecta a rumiantes domésticos (bovinos, ovinos, caprinos), así como también a antílopes, camellos, llamas y otras especies animales. Su distribución es mundial y su prevalencia varía de 5 a 25 %(1).
El agente causal es Mycobacterium avium paratuberculosis (Map). Es un bacilo ácido-alcohol resistente cuya característica la confiere su compleja pared celular, la cual es relativamente resistente al agua y rica en ácidos micólicos, peptidoglicano y arabinogalactano. El bacilo está clasificado dentro del complejo Mycobacterium avium-intracelullare (M. avium subsp. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum y M. intracelullare) y se diferencia de las otras subespecies del complejo por su dependencia a micobactina para su crecimiento in vitro, y la estimulación de su crecimiento con piruvato(2,3,4).
Los animales clínicamente enfermos excretan en forma masiva al bacilo en el excremento, la concentración bacteriana en materia fecal puede sobrepasar valores de 108 unidades formadoras de colonia (UFC)/g(5), siendo ésta la principal fuente de infección para los animales; otra forma en la que los animales se llegan a infectar es durante la lactancia, por la eliminación directa del microorganismo a través de la leche y calostro, además de la contaminación de la ubre con heces(2,6).
La infección por Map, usualmente ocurre en los primeros meses de vida de los animales, pero los signos clínicos se observarán después de un largo periodo de incubación y generalmente aparecen entre los dos y cinco años de edad. A este largo periodo de incubación se le atribuye el difícil control de la enfermedad, ya que los animales con infección subclínica comienzan a excretar la micobacteria en las heces antes de progresar al estado terminal de la enfermedad(6).
Los signos que se observan son diarrea (al principio intermitente, más tarde permanente), pérdida de la condición corporal aunque el apetito se mantiene, disminución de la producción láctea y edema submandibular y ventral causado por hipoproteinemia. Se estima que por cada caso clínico hay 25 casos subclínicos; de ahí la importancia de contar con pruebas de diagnóstico que puedan detectar a los animales infectados(7).
No se puede afirmar en forma definitiva si Map puede ser considerado un agente zoonótico, ya que su participación en la etiología y patogénesis de la enfermedad de Crohn es un tema de intenso debate(8).
El perfil inmunológico a la infección por Map consiste en una respuesta mediada por células durante la etapa subclínica y una respuesta de tipo humoral durante la etapa clínica de la enfermedad(1,2,6,8). Las pruebas basadas en la detección de la respuesta inmune humoral no resultan factibles durante etapas tempranas de la infección (fase subclínica) porque no se producen anticuerpos contra Map(9), pero en animales clínicamente afectados su sensibilidad y especificidad son relativamente altas(10).
El diagnóstico de la ptb por medio del ensayo inmuno-enzimático o ELISA (por sus siglas en inglés) se ha utilizado para la detección de ptb, principalmente en bovinos, ovinos y caprinos; generalmente el antígeno que se ha empleado para realizar el ensayo se obtiene de una cepa de Map, la cual ha sido evaluada como antígeno sonicado y filtrado cepa 19698 TTCC(8), células completas inactivadas con formaldehído, antígenos de superficie, cepa Linda(9,11), antígeno protoplasmático cepa 18(3,12), y proteínas de secreción temprana cepa JTC 303(13); la sensibilidad obtenida con los diferentes antígenos varia de 8.9 a 32.1 % en animales que eliminan bajas cantidades de bacilos en el excremento, y del 30 al 95 % animales que eliminan una mayor cantidad(8,11,12). Actualmente existen paquetes comerciales para realizar el diagnóstico de ptb, pero se tiene el inconveniente que son de importación y su precio es elevado, razón por lo cual no se lleva a cabo el diagnóstico de forma rutinaria en los laboratorios de salud animal en México.
La ptb ocasiona importantes pérdidas económicas a la industria pecuaria, por lo que es indispensable el contar con pruebas diagnósticas para detectar a los animales infectados y poder establecer las medidas de control necesarias; el objetivo del trabajo fue desarrollar y estandarizar un ELISA para el diagnóstico de ptb en bovinos, empleando un antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 de origen nacional.
 
MATERIALES Y MÉTODOS
Elaboración del antígeno
El antígeno protoplasmático se obtuvo de un aislamiento de Mycobacterium avium paratuberculosis cepa 3065, proveniente de excremento de un caso clínico de ovino. La cepa se inoculó en medio líquido de Proskawer y Beck adicionado con micobactina (2 mg/L) y se incubó a 37 °C por ocho semanas. Las bacterias se concentraron por centrifugación a 900 xg durante 10 min, se lavaron tres veces con solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2, 1M (PBS), y fueron sonicadas (Ultra Soni Procesor) durante 20 ciclos de 59 seg cada uno; el material obtenido fue centrifugado a 900 xg durante 90 min y el sobrenadante se dializó a 4 °C en una membrana de celulosa (21 a 33 mm de diámetro promedio) (Sigma-Aldrich) durante 18 h, el dializado fue congelado a -170 °C durante 2 h, para posteriormente liofilizarlo. La concentración de proteína se determinó utilizando el paquete comercial Micro BCA Protein Assay Reagent Kit® y se comparó con la concentración de proteína del antígeno PPA-3 (Paratuberculosis Protoplasmic Antigen, Allied Monitor Inc®) de Map(14).
Estandarización del ELISA
El antígeno se fijó en las microplacas de ELISA a concentraciones de 10, 5, 2.5 y 1.25 µg/100 µl, diluidos en solución amortiguadora de carbonatos pH 9.6, 0.06 M. Se colocaron 100 µl de antígeno por pozo, se mantuvieron en incubación a 37 °C, durante 24 h, se lavaron cuatro veces con 300 µl de solución de lavado PBS-tween 20 (PBST)(0.05%) pH 7.4 y por pozo se depositaron 100 µl de solución de bloqueo albúmina 1%, (Fluka Biochemika), las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h, se realizaron cuatro lavados con PBST, y se almacenaron a 4 °C envueltas en plástico y papel aluminio, hasta su uso. Se trabajó con un suero testigo positivo (Allied Monitor, Inc®) y con un suero testigo negativo, diluidos en una solución al 0.02% de M. phlei en una solución amortiguadora de fosfatos con 0.1% de gelatina y 0.05% de tween 80 (Sigma), a concentraciones de 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160. Se utilizó un conjugado anti IgG bovino marcado con peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma) a diluciones de 1:750, 1:1500 y 1:2000.
En cada placa se colocaron en sus pozos correspondientes 100 µl de los sueros testigo negativos o positivos; todos los sueros fueron probados de manera pareada, se incubaron a temperatura ambiente por 30 min, se lavaron con 300 µl de PBST cuatro veces, se agregaron 100 µl de conjugado anti IgG bovino-HRP en cada pozo, se incubó a temperatura ambiente por 30 min, se eliminó el contenido de la placa y se lavó con PBST cuatro veces; a cada pozo se agregaron 100 µl de solución de sustrato 2-2´ azino-di-(3-etilbenzothiazol-sulfona-6)–(diamonio) (ABTS) (AMRESCO), se mantuvieron en obscuridad a temperatura ambiente y agitación por 30 min. La lectura se realizó a 650 nm en un espectrofotómetro de ocho canales (ELx800, BioTek)(15).
Determinación del punto de corte, sensibilidad y especificidad
Se trabajó con 50 sueros de bovino positivos a aislamiento de Maptb y con 50 sueros negativos provenientes de hatos libres a ptb y tuberculosis. El punto de corte se estableció por Intervalos de Confianza al 95% y dos desviaciones estándar utilizando la siguiente fórmula(15):
Desarrollo de un inmuno-ensayo enzimático (ELISA) para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos - Image 1
Evaluación con muestras de campo Se determinó la Se y E del ELISA evaluando 491 sueros de bovinos de la raza Holstein mayores a dos años de edad, procedentes de hatos lecheros de los estados de Hidalgo, México y Aguascalientes.
La determinación de los valores positivos vs negativos, se obtuvo con los valores promedio de las OD de acuerdo a lo descrito por Martínez(15); se consideró que la prueba de comparación de poblaciones de Ji2 de Pearson para dos muestras independientes como evaluación estadística de los grupos, cuya hipótesis nula (Ho) planteada fue que las pruebas diagnósticas en paratuberculosis bovina son iguales. Respecto a Se, E, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo, se calcularon mediante tablas de contingencia de 2X2; para evaluar la concordancia entre cada diagnóstico (ELISA, PCR y cultivo) se calculó mediante los valores de la prueba de Kappa de Cohen:
 
 
 
 
Se colectaron 5 ml del sobrenadante y de la fase intermedia, se centrifugaron a 180 xg durante 10 min, se decantó el sobrenadante y a la pastilla obtenida se le adicionaron 3 ml de cloruro de benzalconio (Zephiran) al 3%, dejándolo en reposo por 30 min, posteriormente se centrifugó a 180 xg por 10 min. Se decantó el sobrenadante conservando aproximadamente 1 ml, en el cual se homogenizó la pastilla y se realizó la siembra por duplicado en medio de Herrold adicionado con yema de huevo con y sin micobactina, dejando incubar las muestras a 37 °C durante 8 a 16 semanas(14,15,16).
Extracción de ADN a partir de excremento
Se colocaron 2 g de materia fecal en 50 ml de HCP al 7.6 %, se mantuvieron en agitación durante 60 min y 18 h en reposo. Del sobrenadante se tomaron 20 ml que se centrifugaron a 180 xg por 10 min. Se decantó el sobrenadante y se realizaron tres lavados con 5 ml de PBS a la pastilla.
Finalmente, la pastilla se resuspendió en 1.5 ml de PBS y se transfirió a tubos de 2 ml, para centrifugarlo a 1,260 xg durante 5 min, se eliminó el sobrenadante y la pastilla fue resuspendida en 500 µl de Te-Triton X100 y transferida a criotubos de 1.5 ml. Las muestras se colocaron tres veces en nitrógeno líquido (-170 °C) a intervalos de 5 min y en calor seco a 100 °C, para la lisis celular. A cada muestra se le agregaron 450 µl de isotiocionato de guanidina 5M y 250 µl de acetato de amonio 7.5 M (pH 6.3) y se mantuvieron en hielo por 15 min. Las muestras se transfirieron a tubos eppendorf donde se les agregó en dos ocasiones 500 µl de cloroformo-alcohol isoamílico (1:24), se centrifugó a 1,260 xg 15 min. La fase acuosa se transfirió a un tubo eppendorf de 2 ml y se le agregaron 450 µl de isopropanol, para precipitar los ácidos nucleicos. Los tubos se colocaron a -20 °C toda la noche. Las muestras se centrifugaron a 1,260 xg por 15 min y se eliminó el sobrenadante. Se realizaron dos lavados con 1 ml de etanol al 70%. Se eliminó el sobrenadante y la pastilla se dejó secar a temperatura ambiente, para posteriormente resuspenderla en 100 µl de agua bidestilada. Las muestras de ADN se mantuvieron a -20 °C hasta su uso en la PCR anidada(17,18,19).
PCR anidada
A las muestras de ADN obtenidas a partir de excremento, se les realizó la PCR anidada. Se utilizaron iniciadores para el elemento de inserción IS900 que es específico para Map, descritos por Erume et al(17) Paratb1 (5´ TGA TCT GGA CAA TGA CGG TTA CGG A 3´) y Paratb 4 (5´ CGC GGC ACG GCT CTT GTT 3´) para la primer reacción de PCR, obteniendo un producto de 563 pares de bases y para la segunda reacción Paratb 2 (5´ GCC GCG CTG CTG GAG TTG A 3´) y Paratb 3 (5´ AGC GTC TTT GGC GTC GGT CTT G 3´) obteniendo un producto final de 210 pares de bases. Para la primer reacción se utilizaron 2 µl de ADN obtenidos a partir de excremento de bovino; las condiciones para 48 µl de premezcla fueron 5 µl de amortiguador de reacción 10X (67 mM/µl) (Biogénica), 4 µl de MgCl2 30 mM 20 X (Biogenica), 1 µl DNTP (200 mM), 1 µl Paratb 1 (25 pMol) (Invitrogen), 1 µl Paratb 4 (25 pMol) (Invitrogen), 0.25 µl de polimerasa (5 U) (Amplificasa, Biogénica) y 35.75 µl de agua bidestilada. La amplificación se realizó en un termociclador (Thermo Electron Corporation) utilizando el programa: un ciclo a 95 °C por 5 min, 35 ciclos a 95 °C por 1 min, 65 °C por 1 min, 72 °C por 1 min, un ciclo más por 1 min a 72 °C y un ciclo a 4 °C por 5 min. Para la segunda reacción, se tomaron 3 µl de la primera reacción y se transfirieron a microtubos de PCR, que contenían la misma cantidad y concentración de reactivos ya descritos, excepto que los iniciadores Paratb 1 y Paratb 4, fueron sustituidos por los iniciadores Paratb 2 y Paratb 3. Se utilizó el mismo programa del termociclador. Se incluyó como testigo positivo ADN de la cepa de Map (ATCC 19698), las muestras se corrieron en una cámara de electroforesis (GIBCO BRL Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) a 100 volts por 1 h y los productos de la amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio(18,19).
 
RESULTADOS
Determinación de la concentración de proteínas Una vez resuspendido el antígeno protoplasmático se determinó su concentración de proteínas utilizando el paquete comercial Micro BCA Protein Assay Reagent Kit, se hizo la lectura a una absorbancia de 563 nm, obteniendo un promedio de 178 µg/100 µl, mientras que el antígeno PPA-3 de Map tuvo un promedio de concentración de proteínas de 174 µg/100 µl.
Estandarización del ELISA
Para la estandarización del ELISA, se evaluaron diferentes concentraciones de antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 (10, 5, 2.5 y 1.25 µg/100 µl), los testigos positivos y negativos se diluyeron a 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160, así como también el conjugado anti IgG bovino-HRP el cual fue probado a 1:750, 1:1500 y 1:2000. La mayor diferenciación entre testigos positivos y negativos, se obtuvo empleando el antígeno a 1.25 µg/100 µl y 1:2000 de conjugado anti IgG bovino-HRP. Las diluciones de suero 1:80 y 1:160, permitieron detectar una diferencia tres veces mayor entre los testigos positivos y negativos; sin embargo, con la última dilución los sueros testigo negativos mostraron una OD promedio de 0.143 y los testigo positivos se mantuvieron elevados con un promedio de 0.532 OD; por esta razón se consideró que la mejor dilución del suero era 1:160 para llevar a cabo la evaluación del ELISA (Cuadro 1).
Determinación del punto de corte, sensibilidad y especificidad
Los valores promedio obtenidos fueron de 0.01 (OD) el valor más bajo, y 1.43 (OD) el valor más alto; los resultados obtenidos con las 100 muestras, permitieron establecer un punto de corte de 0.196 (OD), por lo que los valores iguales o mayores a este valor fueron considerados como positivos (Figura 1).
Además que se logró clasificar de una manera semicuantitativa los 50 sueros positivos en escalas de fuerte, positivo y débilmente positivos en base a la intensidad de respuesta de los sueros y los valores promedio de las densidades ópticas (Figura 2).
 
 
 
Evaluación con muestras de campo
Se obtuvieron 68/491 (13.84 %) muestras positivas y 423 negativos al ensayo. Se calculó la sensibilidad y especificidad para la prueba, empleando los resultados de cultivo y PCR como “pruebas de oro”. Los resultados obtenidos indican que el ELISA tuvo una Se=79.31 %, E=82.25 %, con un valor predictivo positivo de 22 % y un valor predictivo negativo de 98 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.2763 con respecto al cultivo. Al compararla con la PCR se tuvo una Se= 67.8 %, E= 84 % con un valor predictivo positivo de 38 % y un valor predictivo negativo de 95 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.394 Al determinar la Se y E de la PCR con respecto al cultivo bacteriológico fue de 62.7 % y 91.13 % con un valor predictivo positivo de 30.5 % y un valor predictivo negativo de 97.45 %, con una concordancia entre las pruebas de 0.66. Las observaciones de cada técnica diagnóstica, corresponden a grupos independientes, ya que con la prueba de Ji2 empleada, se obtuvo un resultado altamente significativo P<0.01, Los resultados indican que tanto PCR como el cultivo son técnicas diagnósticas muy parecidas, sin embargo comparado con ELISA existe diferencia entre ellas.
Aislamiento bacteriológico
Se realizó el cultivo bacteriológico de las 491 muestras de excremento, obteniendo 29 aislamientos positivos (5.9 %). Se observó crecimiento de colonias bacterianas a partir de la octava semana de incubación; únicamente en los medios que fueron adicionados con micobactina y con la tinción de Ziehl-Neelsen se observaron bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). La identificación definitiva de los aislamientos compatibles con Map se realizó por medio de la prueba de PCR anidada ya descrita.
Reacción en cadena de la polimerasa
Se probaron las 491 muestras de excremento, y en total amplificaron 59 muestras (12.01 %), obteniendo un producto final de 210 pares de bases que corresponde a la región IS900 que es específica de Map (Figura 3).
 
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran que el ELISA con antígeno de Map cepa 3065, presentó una Se y E relativas de 79.31 % y 82.25 %, respectivamente, al compararla con el aislamiento bacteriológico, el cual es considerado como la prueba de oro. Dichos resultados coinciden con los obtenidos en diversos estudios, donde se han realizado evaluaciones con diferentes antígenos de Map, en ELISAs para el diagnóstico de ptb, en los cuales la Se del ensayo va de un 30 al 95 %(20,21,22).
La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el estado de un animal o población con respecto a una infección, es la consideración más importante para la validación de un ensayo, por lo que se deben considerar factores que pueden influir en el resultado, en este caso al desarrollar el ELISA para determinar la presencia de anticuerpos contra Map, se sabe que en ocasiones los animales negativos a ELISA pueden resultar positivos a PCR o al aislamiento bacteriológico, debido a que en etapas tempranas de la infección la respuesta inmune predominante es de tipo celular, y la eliminación del bacilo en excremento comienza a darse de manera intermitente. Otra razón por la cual la producción de anticuerpos se puede ver afectada es a causa de la pérdida de respuesta inmune ante la infección; esta actividad supresora es denominada anergia, y se presenta cuando los animales son viejos o la infección está en su etapa final, de manera que estos animales pueden estar excretando el bacilo y no ser detectados con las pruebas serológicas(20-23).
De las 491 muestras trabajadas, 59 fueron positivas a PCR anidada y se obtuvieron 29 aislamientos de Map, lo que equivale al 12.01 y 5.9 %, respectivamente. Estos resultados coinciden con lo descrito por Erume et al(17), quienes detectaron una mayor cantidad de animales positivos a paratuberculosis a partir de excremento, utilizando la PCR anidada y una menor cantidad mediante el aislamiento bacteriológico, el cual es considerado como la prueba de oro para el diagnóstico de ptb en bovinos, pero que presenta algunas limitantes, pues el procedimiento requiere de 8 a 16 semanas de incubación como mínimo para el aislamiento de Map. Otra desventaja que presenta el cultivo es la contaminación de las muestras con otros microorganismos, principalmente hongos. La PCR anidada es capaz de detectar bacterias viables y no viables, además tiene la ventaja de que los resultados a partir de esta prueba se pueden obtener en tres días, lo que representa una ventaja de tiempo en comparación con el aislamiento bacteriológico(17,18,19).
La concordancia entre las distintas pruebas ELISA, PCR anidada y cultivo bacteriológico utilizadas en el presente trabajo, fue considerada de baja a discreta; sin embargo cabe señalar que cada método, detecta a los animales en diferente etapa de la infección, pero su uso de manera complementaria, contribuyó a que se incrementara la sensibilidad de la prueba serológica(23).
Estudios de tipo epidemiológicos transversales realizados en ganado bovino de los Estados de Guanajuato y San Luis Potosí; indican que existe una seroprevalencia de ptb del 10.71 y 31.3 % respectivamente; en el presente trabajo se incluyeron muestras de animales que procedían de los Estados de Hidalgo, Aguascalientes y Estado de México, de las cuales se obtuvieron 68 animales positivos de los 491 animales evaluados con el ELISA con antígeno protoplasmático de Map 3065, esto corresponde a una frecuencia de 13.84 %, si bien este dato no proviene de un estudio con diseño epidemiológico, pone de manifiesto que la enfermedad, se encuentra ampliamente distribuida en hatos de distintos Estados del País y que se requiere el realizar estudios con los que se pueda determinar la situación real de la enfermedad, y el impacto económico que representa para la ganadería nacional(24,25,26).
Los antígenos protoplasmáticos de Map, que se utilizan en las pruebas serológicas, son mezclas complejas de lípidos, carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos que contienen determinantes antigénicas en común para la mayoría de las cepas de Map sin importar que sean de origen ovino o bovino(21,22). Existe un alto grado de conservación genética entre las cepas de Map de origen ovino y bovino, por lo que comparten determinantes antigénicos, los cuales son reconocidos por los anticuerpos presentes en los sueros que resultan positivos a las pruebas serológicas. Se considera que una de las limitantes por las cuales no se lleva a cabo el diagnóstico de la ptb en el ganado en México, es por la falta de antígenos o paquetes comerciales de ELISA, ya que los que existen en el mercado, tienen un precio alto y el tiempo de entrega del material tarda demasiado tiempo, al ser productos de importación; razón por la cual es importante el realizar estudios con cepas de Map de origen nacional, para la obtención de antígenos que sean evaluados como candidatos para poder llevar a cabo el diagnostico de la enfermedad.
La cepa de Map 3065 que se empleó para obtener el antígeno, se obtuvo de un caso clínico de ptb en ovino, procedente de un rebaño de Toluca, Edo. de México; la evaluación del antígeno fue realizada por Hernández(14), quien describe el perfil proteínico de ocho bandas que tienen un peso que va de 20 a 160 kD, y una concentración de proteínas de 104 µg/100 µl. Los resultados obtenidos en el ELISA empleando antígeno protoplasmático de la cepa de origen ovino, son mejores comparados con los de Singh et al(22), quienes estandarizaron un ELISA con antígeno protoplasmático de una cepa de Map “tipo bisonte” de origen caprino, con la que han evaluado sueros de búfalos, bovinos y caprinos, teniendo una Se 50 y E 90 %. Se coincide con este trabajo en que el ensayo se puede utilizar con muestras de suero de distintas especies animales, independientemente del origen (ovino, bovino, caprino) de la cepa de Map con la que se elabore el antígeno para el ELISA.
Estudios realizados por Park et al(8) y por Speer et al(9), con un ELISA usando antígeno sonicado elaborado con una cepa de referencia de Map de origen bovino, con una concentración de proteína de 400 ng/100 µl, y 3200 ng de proteína por pozo (100 µl) respectivamente, la Se y E para ambos casos fue de 95.2 y 96.7 % respectivamente; sin embargo se considera que la prueba tiene la desventaja de que es costosa y que requiere de entrenamiento para alcanzar resultados confiables y constantes. Los resultados del presente trabajo, se obtuvieron utilizando una concentración de proteína de 178 ng por cada 100 µl de buffer de carbonatos; y se comprobó que a menor cantidad de antígeno, la divergencia entre los valores de los sueros positivos y negativos aumentaba, permitiendo una mejor diferencia entre estos.
Pinedo et al(3) analizaron 328 muestras de suero, sangre y excremento y determinaron la asociación entre ELISA, cultivo, PCR de sangre y excremento para el diagnóstico de Map (P<0.05).
La prueba Chi2 (ji cuadrada de Pearson), se emplea cuando las observaciones de una investigación corresponden a muestras independientes y las mediciones se tienen en escala nominal, y el análisis corresponde a dos o más grupos, de dos o más variables. Los resultados obtenidos con esta prueba fueron significativos (P<0.01), por lo que existen diferencias entre las pruebas evaluadas. El análisis estadístico realizado en ambos estudios determina que al menos uno de los grupos es diferente y que dependiendo del número de observaciones obtenidas, se elegirá el análisis estadístico a aplicar(3).
Se considera importante que para determinar o clasificar las muestras positivas de las negativas de un ELISA, se recomienda agregar al valor promedio que se emplea como punto de corte dos o tres desviaciones estándar, para incluir en teoría al 95 ó 99 % de la población seronegativa, teniendo como inconveniente que al utilizar dos desviaciones estándar se pueden dar resultados falso positivos, pero al trabajar con tres desviaciones estándar existe la probabilidad de dar resultados falsos negativos, es decir se subestima o sobre estima la población susceptible(27). Al trabajar con los 50 sueros positivos a PCR y cultivo, que fueron empleados para estandarizar el ensayo, siete fueron clasificados como débilmente positivos (0.19 a 0.29 OD), si el punto de corte se hubiera establecido con tres desviaciones, estos hubieran sido clasificados como falsos negativos.
Diversos trabajos sobre la evaluación de los ELISA, para el diagnóstico de ptb, establecen el punto de corte entre 0.23 a 0.25 OD(11,21,28). El punto de corte que se determinó en este trabajo fue de 0.196 OD y se obtuvo mediante dos desviaciones estándar y un intervalo de confianza del 95 %, lo cual permitió detectar una mayor cantidad de animales infectados y que fueron también positivos al cultivo bacteriológico y PCR anidado, con esto la sensibilidad de la prueba fue mayor en animales que comenzaban a presentar los signos clínicos de la enfermedad(13,23); al utilizar un punto de corte mayor a 0.23 OD, se tiene la posibilidad de dar un resultado falso negativo, y dejar animales dentro del hato que posteriormente desarrollarán la enfermedad(23).
En las pruebas de tamiz y diagnóstico, la probabilidad de que un individuo con una prueba positiva, sea realmente positivo (es decir que este cursando con la enfermedad), se le denomina valor predictivo positivo, mientras que el valor predictivo negativo, se refiere a la proporción de individuos con un resultado negativo a la prueba que no tienen la enfermedad. Es importante remarcar que el valor predictivo, está asociado a la sensibilidad y especificidad de la prueba, así como también que es altamente dependiente de la prevalencia de la enfermedad en la población donde se aplica la prueba(29). Bench-Nielsen et al(30), al evaluar un ELISA elaborado con extractos de antígeno sonicado de la cepa de Map ATCC 19698, y preabsorber los sueros con una solución de M. phlei, obtuvieron un valor predictivo positivo del 100 %, pero solamente incluyeron en el experimento sueros provenientes de animales con cultivo positivo a Map y sueros negativos de hatos libres. En la primera parte del trabajo al estandarizar el ELISA se obtuvo un valor predictivo positivo y negativo del 100 %, por haber utilizado sueros con las mismas características descritas anteriormente, pero al evaluar el ensayo con muestras de campo el valor predictivo positivo bajó considerablemente a 22 % con respecto a cultivo y 38 % a PCR, esto se debe a que las muestras trabajadas procedían de diferentes Estados del País, y de distintos hatos donde se han presentado casos de ptb, pero que se desconoce su prevalencia; además la ptb es una enfermedad de tipo crónico y generalmente la detección de anticuerpos contra Map, es posible realizarla hasta que el animal tiene entre 18 a 24 meses de edad. Cabe hacer mención que el valor predictivo negativo fue de 98 % con respecto a cultivo y 95 % a PCR, por lo que las muestras de animales de campo con resultado negativo al ELISA, fueron correctamente clasificadas, ya que correspondieron a los verdaderos negativos.
Otra situación que hay que tomar en cuenta, son las posibles reacciones cruzadas. Yokomizo et al(12), demostraron que al dar un tratamiento a sueros, con una solución de M. phlei para absorber los anticuerpos no específicos, se reducían los resultados falso positivos ocasionados por infecciones con Nocardia, Corynebacterium, Mycobacterium bovis y otras micobacterias; este método no afecta los niveles de anticuerpos producidos contra Map, e incrementa la sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas(12,21,30). En la evaluación realizada se trabajaron con varias diluciones de los sueros en la solución de M. phlei, la dilución de 1:160 fue con la que se obtuvieron los mejores resultados. Los sueros clasificados como positivos, fueron confirmados por cultivo y PCR, además considerando que se tuvo un valor predictivo negativo elevado, se podría pensar que no se tuvieron problemas con posibles reacciones cruzadas.
Al momento se han trabajado con 20 sueros de bovinos que fueron positivos al PPD bovino, y el resultado fue negativo. Al trabajar con 20 sueros de bovinos que fueron positivos al PPD aviar en la prueba cervical comparativa, siete fueron detectados como positivos a ptb por el ELISA y confirmados por PCR, lo que implica que se puede utilizar para realizar el diagnóstico diferencial con tuberculosis. Si bien son pocas muestras las que se han trabajado, esto permite tener un criterio más amplio de lo que está pasando en los hatos donde existen las dos enfermedades (datos no publicados).
 
CONCLUSIONES E IMPLICACIONES
La ptb es una enfermedad que causa grandes pérdidas económicas en la ganadería, por lo que, se requieren de pruebas diagnósticas sensibles y específicas para lograr la detección y posterior eliminación de los casos clínicos y subclínicos de los hatos, para que, de esta manera se reduzca la exposición de los animales jóvenes que son los más susceptibles a infectarse con Map. Además de que se hace indispensable el contar con técnicas diagnósticas que sean de fácil implementación en los laboratorios, y que puedan ser utilizadas para desarrollar estudios de tipo epidemiológico sobre la enfermedad en diversas especies de animales domésticos y silvestres, para poder determinar las medidas necesarias para su control. Los resultados obtenidos en el presente estudio, permiten recomendar el uso del ELISA con el antígeno protoplasmático de Map cepa 3065 (cepa nacional) como una alternativa para el diagnóstico de la ptb bovina, considerando que el diagnóstico de la enfermedad se debe llevar a cabo con una prueba serológica y una prueba confirmatoria como lo es el PCR o el cultivo.
 
AGRADECIMIENTOS
Proyecto financiado parcialmente por Fondos Mixtos CONACYT-SAGARPA 48176.
 
LITERATURA CITADA
1. Pino RV, Villarroel NR. Paratuberculosis: una amenaza emergente para la ganadería tropical. Manual de ganadería doble propósito Maracaibo-Venezuela. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Zulia. 2005.
2. Cocito C, Gilot P, Coene M, De Kesel M, Poupart P, Vannuffel P. Paratuberculosis. Clin Microbiol Rev 1994;7:328-345.
3. Pinedo PJ, Rae DO, Williams JE, Donovan GA, Melendez P, Buergelt CD. Association among results of serum ELISA, faecal culture and nested PCR on milk, blood and faeces for the detection of paratuberculosis in dairy cows. Transbound Emerg Dis 2008;50:125-133.
4. Abalos P. Actualidad en Paratuberculosis. TECNOVET 2001 Diciembre;7(3). [en línea] http://www.tecnovet.uchile.cl/ index.php/RT/article/viewArticle/5291/5171. Consultado Oct 5, 2010.
5. Kreeger JM. Ruminant paratuberculosis a century of progress and frustration. J Vet Diagn Invest 1991;3:373-382.
6. Craven JA, Morgan IR. Epidemiology and Pathogenesis of Paratuberculosis in cattle. A literature survey prepared for animal health Australia. 2000. [on line] http:// www.animalhealthaustralia.com.au/wp-content/uploads/2011/04/ Epidemology-and-Pathogenesis-of-Johne%E2%80%99s-Diseasein-Cattle.pdf. Accessed Oct 5, 2010.
7. Harris BT, Barletta GR. Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin Microbiol Rev 2001;14(3):489-512.
8. Park KT, Ahn J, Davis WC, Koo HC, Kwon NH, Jung WK, Kim JM, Hong SK, Park YH. Analysis of the seroprevalence of bovine paratuberculosis and the application of modified absorbed ELISA to field sample testing in Korea. J Vet Sci 2006;7(4):349-354.
9. Speer CA, Scott MC, Bannantine JP, Waters WR, Mori Y, Whitlock RH, Eda S. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Iifections (Johne´s Disease) in cattle. Clin Vaccine Immunol 2006;13(5):535-540.
10. Klausen J, Huda A, Ekeroth L, Ahrens P. Evaluation of serum and milk ELISAs for paratuberculosis in Danish dairy cattle. Prev Vet Med 2003;58(3-4):171-178.
11. Eda S, Bannantine JP, Waters WR, Mori Y, Whitlock RH, Scott MC, Speer CA. A Highly Sensitive and subspecies-specific surface antigen enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Johne´s disease. Clin Vaccine Immunol 2006;13(8):837-844.
12. Yokomizo Y, Yugi H, Merkal RS. A method for avoiding falsepositive reactions in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis of bovine paratuberculosis. Jap S Vet Sci 1985;47(1):111-119.
13. Sung JS, Donghee Ch, Collins TM. Diagnosis of bovine paratuberculosis by a novel enzyme-linked immunosorbernt assay based on early secreted antigens of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Clin Vaccine Immunol 2008;15(8): 1227-1281.
14. Hernández COA. Obtención de un antígeno protoplasmático de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis para el diagnóstico de la enfermedad de Johne en ovinos [tesis Licenciatura). México: FESC-UNAM; 2006.
15. Martínez CAG. Desarrollo de un ELISA, para el diagnóstico de paratuberculosis en bovinos [tesis Licenciatura]. México: FMVZUNAM; 2009.
16. Payeur JB, Jarnagin JL, Marquardt JG, Schaper LA, Martin BM. Laboratory Methods in Veterinary Mycobacteriology for the Isolation and Identification of Mycobacteria. Iowa, USA: USDA, Animal and plant health inspection service. Natl Vet Serv Lab. 1993:39-40.
17. Erume J, Spergser J, Rosengarten R. Rapid detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from cattle and zoo animals by Nested PCR. Afr Health Sci 2001;1(2):83- 89.
18. Jaimes MNG. Aplicación de la PCR anidada para el diagnóstico de Paratuberculosis a partir de heces de ovinos [tesis licenciatura]. México: FESC –UNAM; 2006.
19. Jaimes NG, Santillán FMA, Hernández COA, Córdova LD, Guzmán RCC, Arellano RB, Díaz AE, Tenorio GVR, Cuellar OA. Detección de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, por medio de PCR-anidada a partir de muestras de heces de ovino. Vet Mex 2008;39(4):377-386.
20. Bernardelli A, Cicuta ME, Nicola A, Roibón WR, Boehringer SI, Benítez MC, Barceló MC, et al. Paratuberculosis ovina en Corrientes, Argentina. Rev Sci Tech Off Int Epiz 2000;19(3):800- 809.
21. Gonzales SRA, Ramírez CIC. Método de adsorción de anticuerpos no específicos y obtención de un antígeno protoplasmático, para el diagnóstico de la paratuberculosis. Tec Pecu Mex 1986;52:99- 104.
22. Singh SV, Singh AV, Singh R, Sharma S, Shukla N, Misra S, Singh PK, et al. Sero-prevalence of bovine Johne´s disease in buffaloes and cattle population of North India using indigenous ELISA kit based on native Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis “Bison type” genotype of goat origin. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008;31(5):419-433.
23. Clark DL, Koziczkowski RP, Radcliff RA, Ellingson JLE. Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis: Comparing fecal culture versus serum enzime-linked immunosorbent assay and direct fecal polymerase chain reaction. J Dairy Sci 2008;91(7):2620-2627.
24. Santillán FMA, Córdova LD, Guzmán RCC, López MJ, Rosado RMI, Mojarro JFJ, Zermeño PA, Patiño ZP. Seroprevalencia de paratuberculosis en ganado bovino del estado de Guanajuato. Congreso Nacional de Buiatria. Morelia, Michoacán, México. 2004:127-130.
25. Santillán FMA, Córdova LD, Guzmán RCC, López lJ. Paratuberculosis en el ganado bovino del Edo. de Guanajuato. Reunión anual CONASA, Pachuca Hidalgo. 2004:125-130.
26. Córdova LD, Guzmán RCC, Santillán FMA, Favila HLC, Urrutia MJ, Gámez V. La paratuberculosis en la ganadería bovina de San Luis Potosí, México. Congreso Nacional de Buiatría. Monterrey N.L. México. 2010.
27. Fajardo-Gutiérrez A,Yamamoto-Kimura L, Yañez-Velasco L, Garduño EJ, Martínez GMC. Utilidad de las curvas de sensibilidad y especificidad conjunta en la aplicación de una prueba de diagnóstico. Salud Pública Mex 1994;36(3):311-317.
28. Soto JP, Kruze J, Leiva S. Comparación de tres métodos de diagnóstico de Paratuberculosis bovina en rebaños lecheros infectados. Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile. Arch Med Vet XXIV 2002;2;265- 273.
29. Kokuina E, Chico A, Estévez M, Pérez D, Gutiérrez A, Cruz C. Utilización y valor predictivo de la determinación de anticuerpos antinucleares en un Hospital de Referencia Nacional de Salud. Rev Cubana Med 2006;45(3):520-530.
30. Bench-Nielsen S, Jorgensen JB, Ahrems P, Feld NC. Diagnostic accuracy of Mycobacterium phlei-absorbed serum enzime-linked immunosorbent assay for diagnosis of bovine paratuberculosis in dairy cows. J Clin Microbiol 1992;30(3):613-618.
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Autores:
Dionicio Córdova López
INIFAP México
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Miguel Angel Blanco Ochoa
UNAM - Universidad Nacional Autónoma de México
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Marco Antonio Santillan Flores
INIFAP México
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Pablo Hernández J Alvarez
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Hector Luis Salaverria
Neogen Corporation
29 de octubre de 2018
Estimado Dr. Francisco Giménez, Le agradezco sus opiniones tan informativas para todos los foristas. Sin embargo, disiento de sus opiniones pues la nueva tecnología del Actiphage no es el caso de un simple diagnostico aislado. Científicamente ha demostrado ser el diagnóstico más adelantado y revolucionario, frente a la única herramienta que por más de un siglo se ha venido utilizando con magros resultados. El devenir del Gamma Interferón como prueba auxiliar y complementaria de la reacción tuberculinica creada y utilizada por los australianos para lograr que la OIE los reconociera como país libre el 31/12/ 1997, resulto un test que no ha sido aún utilizado cabalmente en la región Latinoamericana, hecho que me consta en mi carácter de distribuidor de dicho test por más de 20 años. En Octubre del 2001 supe poner por vez primera a la disposición del SASA los test Bovigam y Paracheck. Logrando que México y más recientemente Panamá si la implementaran en forma masiva. En Venezuela, la Dirección de Sanidad Animal (SASA), poco la utilizo.El MV. MSc. José Francisco Giménez del Laboratorio de Zoonosis (UCLA-DCV) supo adquirir un test Bovigam de 10 placas en el 2008.. Aunque recuerdo muy bien que si evaluaron la tuberculina PPD Bovina de CSL- Biocor Animal Health en un informe de los resultados obtenidos en pruebas a campo (Lote 74201 del 13/2 al 28.2.2002 (informe que desde ya pongo a su disposición). Mas recientemente en el 2016 Fundaim evalúo y certifico una tuberculina PPD de similares características de la elaborada por Asurequality de NZ, semejante a la antes citada evaluada por el SASA, ofreciendo además un producto final que no requería cadena de frio. Ignorándose en el ínterin que otras tuberculinas se utilizaron en Venezuela y si estas fueron evaluadas frente a los patrones internacionales. Sería muy útil que nos brindará copia de los informes científicos que ofrecen un diagnostico global como el que usted menciona, que permitan realizar un diagnóstico superador del test de Actiphage, el que con solo una muestra de sangre y/o leche pueda producir resultados en 6-8 horas, detectando el 100% de los animales con lesiones visibles y al menos el 93% de los animales con lesiones no visibles, distinguiendo entre animales vacunados y animales infectados o convaleciente y que además permita detectar viable MAP en la leche cruda, la leche en polvo para lactantes, queso, y en la sangre de los animales infectados. Quedo a su disposición por cualquier otra información que desee recabar.
francisco gimenez
Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado
28 de octubre de 2018
Estimados foristas desde mi experiencia la pasteurización no elimina completamente el MAP de la leche eso está demostrado ni siquiera en Venezuela donde las temperaturas de pasteurización son más altas que el estándar internacional ya que la calidad organoléptica y nutricional de la leche líquida no se aprecia por ser la leche de mayor consumo enlace población la leche pulverizada. Más si tomamos en cuenta que Map infecta a los animales en los primeros meses de vida los más inportante entonces es determinar en los animales adultos quienes están infectados y quiénes están sanos para así seleccionar de este rebaño sano vacas para pueden suplir calostro y leche para la alimentación de las crias. Asegurando así que dicha leche proviene de animales son infección con Map. Por otro lado el diagnóstico de la enfermedad en mi experiencia no es tan simple como la utilización de un ELISA para Ac ya que muchos animales jóvenes comienzan a muy temprana edad a excretar bacilos en las heces mucho antes que generen una respuesta humoral que pueda ser detectada por un kid de Elisa de Ac. Por la tanto esos animales podemos detectarlos a través de la detección del patógenos a través de sus heces ya sea por cultivo o por RTpcr para poder eliminar lo más rápido posible esas fuentes de contaminación.
Claudio E. Glauber
UCES
11 de octubre de 2018
Opino que el concepto" vacas sanas para producir leche sana e inocua" es para MAP más que valido. Las herramientas diagnósticas tienen indudablemente gran valor. Como responsables y coresponsables de la salud e inocuidad animal y humana, la producción primaria y la salud de sus vacas lecheras en el origen tiene un valor a veces no reconocido. El concepto de la pasteurización como reemplazante o justificativo de inocuidad en la industria láctea sin considerar enfermedades con riesgo de transmisión a través de leche pasteurizada es peligroso. No todos pasteurizan con eficacia. Atentamente, Claudio Glauber
Hector Luis Salaverria
Neogen Corporation
10 de octubre de 2018
Para su mejor informacion: International Conference on Food Microbiology - August 08-10, 2016,Birmingham, UK/ http://foodmicrobiology.conferenceseries.com/ Title: Detection of viable Mycobacteria in milk and milk products – implications for the dairy industry and human health Name: Dr Catherine Rees , Division of Food Sciences, University of Nottingham, LE12 5RD, UK La introducción de la pasteurización rutinaria de la leche y un programa de erradicación de la tuberculosis dio como resultado una reducción drástica en el número de casos de TB humana en el Reino Unido, de más de 50,000 casos por año en la década de 1940 a menos de 50 casos de infecciones humanas por Mycobacterium bovis. reportado por año desde la década de 1990. Sin embargo, hay muchos informes de detección de Mycobacterium paratuberculosis (MAP) viable en la venta de leche y productos lácteos, lo que indica que este grupo de bacterias puede sobrevivir a la pasteurización comercial. Sin embargo, hay muchos informes sobre la detección de Mycobacterium paratuberculosis (MAP) viable en la venta de leche y productos lácteos, lo que indica que este grupo de bacterias puede sobrevivir a la pasteurización comercial. Aunque no es un organismo zoonótico reconocido, se ha establecido una asociación entre el MAP y el desarrollo de la enfermedad de Crohn, y los organismos reguladores han aconsejado que el MAP se debe erradicar de la cadena alimentaria por un principio de precaución. Hemos desarrollado un método para detectar de forma rápida y sensible las micobacterias patógenas en la leche y hemos demostrado que se puede usar para detectar MAP viable en los productos lácteos, incluida la fórmula en polvo para lactantes. Hemos estado trabajando con productores de queso de leche cruda para desarrollar métodos para detectar M. bovis en leche cruda para garantizar la seguridad de sus productos. Dado el creciente interés de los consumidores en el consumo de leche cruda y el resurgimiento de la TB bovina en el Reino Unido, estos métodos proporcionarán nuevas formas de permitir que se realicen pruebas de garantía de calidad. Revisaré el trabajo que hemos realizado y también discutiré cómo esta técnica también puede usarse para desarrollar nuevos enfoques para erradicar estas enfermedades endémicas del ganado de cada día para mejorar aún más la seguridad alimentaria.
Claudio E. Glauber
UCES
10 de octubre de 2018
Dinamarca, 2005, 8º Congreso mundial paratuberculosis, posible transmisión a través de leche cruda pasteurizada.
Hector Luis Salaverria
Neogen Corporation
9 de octubre de 2018
Aquellos países que aún continúan dependiendo de la respuesta inmunitaria del animal mediante pruebas tuberculinas (ano caudal y cervical comparativa utilizando antígenos PPD bovis y aviar, han tenido que asumir luego de casi un siglo desde que se adoptara dicho standard de diagnóstico, que tal método observa una falla del 33%. La llegada del Gamma Interferón demostró su eficacia en Australia y luego fue adoptada por los laboratorios de todo el mundo. Lamentablemente no todos tuvieron la capacidad de aplicarlo eficazmente que les permitiera consolidar las amplias ventajas y bondades que dicho test posee. A lo largo de mis 25 años de experiencia he conocido a varios investigadores que se han dedicado a validar técnicas de diagnóstico que promovieron como superadoras, pero que en la realidad no ha sido así hasta el presente. Llegamos así a la nueva tecnología del test Actiphage cuya eficacia viene siendo comprobada en distintos países del mundo. Dependerá entonces de que despertemos a esta nueva realidad o que prefiramos como el avestruz meter la cabeza en un hoyo. Cordialmente, Lic. Héctor L. Salaverria (1993- 2018 exRepresentante de CSL y Biocor Animal Health de Australia, Pfizer, Prionics, AsureQuality de NZ, Pronabive de México, Diachemix, Viral Antigens, Institute Pourquier, y actual representante de PBD Biotech Ltd.del Reino Unido)
Pablo  De  Maria
9 de octubre de 2018
Le comento al Sr Felipe Casanova : en España existe una vacuna, que se usa en cerdos. Por un comentario de un técnico del laboratorio, manifestó que hicieron una experiencia en vacunos y anduvo bien limitando los síntomas clinicos........pero en los paises que hay tuberculosis en el gdo, no se puede usar, pues da reacción cruzada con la tuberculina ppd que se realiza en el pliegue ano caudal ( intradermo reacción ) para detectar los posibles portadores de la tuberculosis. Lo único que se puede controlar y lleva muchos años son con medidas de manejo en todo el predio y esto incluye tambien la pasteurización. Recomiendo leer un trabajo del Dr Kruze de la Universidad Austral de Chile que está muy completo pues trabajó años en el tema Cualquier aclaración mi correo es pdemaria@adinet.com.uy
Claudio E. Glauber
UCES
9 de octubre de 2018
Dr Lopez. Podrá precisar su concepto: "ayuda a disminuir el riesgo" o"disminuye el riesgo de transmisión". Respetuosamente: La pasteurización en tiempo y forma realizada convenientemente destruye la bacteria? Entiendo que algunas publicaciones manifiestan lo contrario. Agradezco de antemano su aclaración, estamos frente a un microorganismo responsable etiológico de la Enfermedad de Crohn en humanos, la Enfermedad de Johne es una zoonosis grave en algunos países. El efecto de la pasteurización cuando se trata leche cruda proveniente vacas enfermas puede ser determinante y peligrosa. Saludo a Ud atentamente, Claudio E. Glauber.
Hector Luis Salaverria
Neogen Corporation
9 de octubre de 2018
EXISTE Y SE DISPONE DEL NUEVO TEST ACTIPHAGE DE PBD BIOTECH LTD.FAVOR VER PÁGINA WEB: PBD BIOTECH.COM EN MÉXICO EL DR.TOMAS RENTE RÍA DE MEXICALI LES PODRÁ BRINDAR AMPLIO ASESORAMIENTO. CORDIALMENTE, LIC.HECTOR L.SALAVERRIA hsalaverria@hlsvbp.com
Claudio E. Glauber
UCES
10 de julio de 2018
Muy buen trabajo. Quisiera saber opinión respecto a resistencia microbiana a la pasteurizacón del MO responsable de la paratuberculosis. La leche cruda de una vaca enferma o la leche mal pasteurizada o pasteurizada puede ser transmisor de la enfermedad? Gracias
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