Detección de genes de resistencia a antibióticos en Staphylococcus aureus aislados de casos de mastitis bovina.

INTRODUCCIÓN.

En el caso de la leche, la contaminación de esta puede darse por diferentes vías una de las más comunes es porque la vaca este enferma de mastitis y esta probablemente está originada por el microorganismo Staphylococcus aureus. Esta bacteria es sumamente ubicua y puede estar presente en la piel de humanos y animales, así como en sus fosas nasales y garganta. S. aureus se puede localizar en cualquier alimento llegando a producir intoxicación aguda que aparece entre las 2 y 12 horas después de la ingestión de la toxina que genera el patógeno provocando vómitos intensos e incontrolados, aunque no fiebre. Es una intoxicación leve que llega a desaparecer en 24 horas. El responsable del problema es una toxina de carácter termoestable, lo que permite que en alimentos cocinados se mantenga (la toxina,) aun cuando no esté presente el microorganismo. La producción de toxinas por S. aureus se asocia a la invasividad de los tejidos, a intoxicaciones alimentarias o al síndrome de choque tóxico, que en los años setenta se produjo por la falta de asepsia en la fabricación de los tampones sanitarios. En animales se ha descrito un grupo de infecciones causadas por S. aureus Asociadas a la Producción Animal (APA) de las cuales la más importante es la mastitis bovina. Otra enfermedad frecuente son los abscesos en porcinos y la otitis en perros.

Por ello, el control exclusivo de la presencia de la bacteria no es suficiente, sobre todo si el alimento se ha cocinado antes. En estos casos hay que proceder a controlar la toxina, ya que en caso contrario podría no localizarse un riesgo que hay que calificar de moderado a alto (Fig. 1). Esta bacteria se encuentra en la piel de los animales, pero también de las personas, así como en su garganta y fosas nasales, hasta el punto que la casi totalidad de la población humana podrá ser portadora del microorganismo a lo largo de su vida. Por ello, la probabilidad de contaminar los alimentos es muy alta, no solo por los manipuladores, también por los clientes al tocar u oler los alimentos.

CONTROL DE MANIPULADORES

Una vez que el microorganismo llega al alimento el control es sencillo, ya que si la temperatura de refrigeración es adecuada y no se rompe la cadena del frío, el microorganismo no será capaz de formar toxina. Si, por el contrario, las condiciones lo permiten, la toxina llegará al consumidor. Se impone entonces un especial control de los manipuladores, con el empleo de gorros y mascarillas. En este último caso, hay que cuidar que se tape la entrada de la nariz. En muchas ocasiones como es incómodo los manipuladores dejan libres sus fosas nasales, lo que permite la salida de S. aureus. Hay que evitar este foco de contaminación y forzar a tapar completamente boca y nariz (fig.2).

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La leche puede servir como un excelente medio de conservación y crecimiento para una gran variedad de microorganismos los cuales pertenecen una gran cantidad de especies de bacterias, entre la cuales sobresale S. aureus. Su reproducción depende principalmente de la temperatura y del número de microorganismos presentes así como de sus productos del metabolismo. Sin embargo una gran cantidad de bacterias patógenas importantes, tales como Mycobacterium tuberculosis y Brucella spp no se pueden reproducir en leche. Lo mismo es válido para algunas especies virales. Debido a los riesgos que representa para la salud, es importante conocer la carga inicial microbiana de la leche, sobre todo para los patógenos antes mencionados. Las temperaturas menores de 10 a 20° C inhiben a la mayoría de los microorganismos patógenos, por lo que la leche cruda debe ser enfriada a temperaturas menores de 10° C.

En el caso de la producción de leche bajo malas condiciones higiénicas y sin enfriamiento, la contaminación microbiana causa generalmente la formación de ácido láctico, lo que conduce a una rápida acidificación de la leche. El ac. láctico y algunos subproductos del metabolismo de esos microorganismos tienen un efecto inhibidor de
las bacterias patógenas.

Los microorganismos de la leche pueden proceder de:

- La vaca lechera.
- La persona que ordeña o maneja a la vaca.
- El medio ambiente.

Los microorganismos pueden caer directamente de la ubre o proceder de la piel o de las mucosas del animal así como también de los ordeñadores. Una fuente externa muy importante en un establo lechero puede llegar a ser el agua contaminada. También puede jugar un papel muy importante para la trasmisión de los microorganismos patógenos, los insectos, los roedores, la suciedad y el polvo. Jalisco uno de los principales productores de leche.

Jalisco es el primer productor de leche en el ámbito nacional con 30 vacas promedio por establo, y de 15 a 25 litros por vaca de producción diaria, pero debido a problemas como la mastitis de las vacas lecheras los ganaderos sufren pérdidas económicas muy importantes.

Los ganaderos de Jalisco forman la mayor cuenca de productores de leche en el país alcanzando casi 4 millones de litros de leche al día. La raza Holstein-friesan predomina en las ganaderías, donde se aprecian los sistemas de producción intensiva, semi-intensiva y familiar (fig. 5).

La población ganadera es estimada en 810 mil cabezas de las cuales 270 son vacas en producción y 230 mil son vaquillas, novillos y terneras de reemplazo.

El estado de Jalisco dispone de una planta industrial para lácteos importante donde se procesan e industrializan más de 6.2 millones de litros de leche al día.

Los centros de acopio de tipo comunitario e individual están estratégicamente distribuidos donde existe la mayor producción lechera, como lo es la región de Los Altos de Jalisco, donde existen establos con más de 2,000 vacas lecheras en producción.

En esta región los productores están organizados de diferentes formas, algunas son cooperativas, las cuales tienen una gran variedad de apoyos y plantas pasteurizadoras y procesadoras de la leche para que esta obtenga un valor agregado . Jalisco ocupa en México el primer lugar en producción de leche con un 17,3% por encima de la comarca lagunera, cuyos hatos son enormes y tienen establos intensivos de más de 3,000 vacas lecheras.

Inicios de la Producción lechera en México.

El consumo de leche y de productos lácteos en México tiene una tradición de más de cuatrocientos años, los españoles trajeron de España al puerto de Veracruz, los primeros bovinos, animales muy rústicos y resistentes. Entre las décadas de 1950-1970 se consolidaron diversas cuencas lecheras en nuestro país, con la consiguiente construcción de plantas pasteurizadoras e industrializadoras de productos lácteos como quesos, yogurt, leches saborizadas, etc..

La industria de la leche se consolido en México hasta los años cuarenta, debido al desarrollo industrial y la expansión del mercado interno. Durante el periodo de 1950 a 1970 se efectuó un proceso de integración de la actividad lechera, dado como resultado el surgimiento de algunas pasteurizadoras e industrializadoras de lácteos importantes, las cuales actualmente se encuentran cercanas a las cuencas lecheras de nuestro País.

Se calcula que en México existen aproximadamente 9 millones de bovinos distribuidos en establos en todo el territorio nacional y que presentan diferentes grados de tecnificación, los hay sumamente tecnificados, algunos poco tecnificados y que son de doble propósito y los demás que solo cuentan con las instalaciones básicas. Se considera que México es el segundo importador mundial de leche en polvo y que importa principalmente de Europa, Estados Unidos y Nueva Zelandia.

Calidad sanitaria de la leche y conteo de Células

Somáticas.

De acuerdo con el artículo 240 del reglamento de la ley general de salud, se entiende por leche para consumo humano, la secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas sanas y bien alimentadas. Cuando la leche proceda de otra especie animal, se designará con el nombre de ésta. Se excluye el producto obtenido quince días
antes del parto y cinco días posteriores al mismo o cuando tenga calostro.

Según la Norma oficial mexicana Nom-091-SSA1- 1994 bienes y servicios, leche pasteurizada de vaca. Disposiciones y especificaciones sanitarias.

En su apartado 6 especificaciones sanitarias dice, que los productos objeto de este ordenamiento deben cumplir con las siguientes especificaciones: Estar libres de materia extraña, Color Característico del tipo de producto que se trate, olor característico del producto, exento de olores extraños, sabor característico, exento de sabores
extraños. Deben dar reacción negativa a la prueba de fosfatasa y a la de inhibidores. Tener una acidez mínima de 1,3 o máxima de 1,7g/L expresada como ácido láctico.

Microbiológicas

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

Mesofílicos aerobios UFC/ml 30 000. Organismos Coliformes totales UFC/ml en planta 10.

Organismos Coliformes totales UFC/ml en punto de venta 20

Salmonella spp en 25 ml Ausente

Staphylococcus aureus en 25 ml (fig. 3) Ausente.

Listeria monocytogenes en 25 ml Negativo

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México es el tercer país productor de leche en América con un volumen de casi once mil millones de litros anuales. Sin embargo, no es suficiente para cubrir la demanda nacional. La producción consistente de leche de calidad es dependiente en la actualidad de la calidad y actitud en la aplicación de las prácticas de control de mastitis.

En muchas ordeñas los componentes de la leche son influenciados por la mastitis. En sus componentes mayores como grasa, proteína, y la lactosa se encuentran reducidas así como las concentraciones de proteína, caseínas y proteínas del lactosuero se alteran. Además, las concentraciones de minerales y elementos traza, enzimas y vitaminas cambian.

La causa más común del sacrificio temprano de vacas lecheras son los problemas de salud en las glándulas mamarias, además de problemas de fertilidad. El 26.5 % de las vacas lecheras sacrificadas en el continente americano se debe a trastornos ocasionados por la mastitis. Las Células Somáticas son principalmente células de defensa básicamente leucocitos, y en pequeña proporción células de descamación y algunos microorganismos.

La mastitis por sí misma es la enfermedad más costosa del ganado lechero. En total, las pérdidas económicas de las mastitis subclínicas exceden aquellas causadas por los casos clínicos. Las pérdidas económicas que se producen como resultado de una producción de leche reducida han sido predichas basándose en el conteo de
células somáticas (fig. 4). Si el promedio de producción de un hato es 7.000 kg / vaca /año, esto significa que un promedio de conteo de células somáticas de 1.000.000 es un indicativo de pérdidas de producción de (7.000 x 18/100=) 1.260 kilogramos por vaca y aún un conteo de 500.000 representa una pérdida de 420 kilos por año.

El conteo de células somáticas es actualmente un parámetro que puede interpretarse ya sea directa del cuarto o para muestra de leche del tanque y se usa ampliamente para este propósito y como un indicador de la calidad de leche.

Conteo <200,000 células por mililitro no tiene implicaciones en la salud de la ubre. Niveles normales no indicativos de mastitis en muestras de tanque son de 200,000-500,000 , sospecha de unas pocas vacas afectadas subclínicamente en el hato es de 500,000-1,000,000, Mastitis subclínica >1,000,000 células somáticas y casos masivos de mastitis subclínica >1,500,000, por lo menos la mitad de los cuartos en el hato es probable que se encuentren infectados y la producción de leche puede bajar en un 30%.

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Figura 4.- La calidad de la leche es básica para conservar la higiene de ese alimento.

Se mide la calidad sanitaria de la leche cruda en tanque, mediante cuantificación de las células somáticas y prueba de California para mastitis en ubres de las vacas, pero lo más importante son las perdidas en calidad de dicho producto, ya que bajo los efectos de las mastitis disminuye en la leche del orden de 0,2 a 0,3 décimas el contenido graso mientras que la caseína se reduce en un 20%, disminuyendo también la lactosa. Los cloruros aumentan, mientras el pH tiende a la alcalinidad.

Los referidos cambios en la composición química de la leche repercuten en las industrias lácteas que obtendrán el menor rendimiento en producción de queso y mantequilla, partiendo del mismo volumen de leche al estar disminuidas en aquéllas la grasa y la caseína.

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Figura 5. En Jalisco la mayoría de las explotaciones lecheras son familiares.

Factores de virulencia de S. aureus.

Las bacterias secretadas en leche pueden, bajo condiciones desfavorables, ocasionar intoxicaciones alimenticias al humano. Una parte de las cepas aisladas de muestras de leche tienen la capacidad de formar enterotoxinas estables al calor; por protección del consumidor esta bacteria no debe encontrarse en leche que el ganadero vende.

Una de las metas del productor a largo plazo, debe ser la eliminación de S. aureus de todo el hato lechero (fig. 6). Genes de resistencia a antibióticos de S.aureus Actualmente, la emergencia y la diseminación de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) han llegado a ser un fuerte problema para la salud pública internacional. La diseminación del MRSA ha causado ineficacia en el tratamiento alternativo antes efectivo con drogas terapéuticas en los hospitales Fig. 7). Aparte de los casos en humanos, el MRSA fue aislado de varias especies animales tales como yeguas con metritis, infecciones de heridas, mastitis bovina, perros, gatos y conejos enfermos. Recientemente, el MRSA fue aislado de las líneas clonales ST398 y ST9 en cerdos. La trasmisión de MRSA se ha registrado entre humanos, animales y en el medio ambiente, en los lugares en los que existe un contacto estrecho entre animales y humanos portadores del MRSA. Respecto al papel del MRSA en el origen de la mastitis, se encontró que fue el causante esporádico en casos de mastitis en humanos y de mastitis subclínica bovina. Sin embargo, las cepas aisladas de las vacas no pudieron ser diferenciadas de aquellas obtenidas de los trabajadores en contacto estrecho con animales.

La posible transmisión del MRSA de bovinos con mastitis (bovina) subclínica a humanos al consumir éstos la leche contaminada, es un problema real, ya que ha habido uso extensivo de la cloxacilina durante más de 30 años. Enseguida se describe una investigación propia sobre este tema. Este tipo de penicilina semisintética está en uso en los países involucrados en esta investigación. Para un diagnóstico rápido y seguro del MRSA se han desarrollado diferentes métodos moleculares y de cultivo.

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Figura 6. Los factores de virulencia, pueden ocasionar diferentes problemas de salud, por ejemplo las enterotoxinas de S. aureus.

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Figura 7. El MRSA ( S. aureus resistente a meticilina) es capaz de ocasionar infecciones nosocomiales.

MATERIAL Y MÉTODOS.

En el presente estudio, de 530 cepas de S. aureus se seleccionaron 68, procedentes de cuatro países ubicados en tres continentes, para ser investigadas fenotípica y genotípicamente y observar su resistencia a oxacilina y penicilina G. Esos aislamientos se obtuvieron de vacas afectadas con mastitis subclínica en Alemania, Indonesia, México y Brasil. La selección de los aislamientos tuvo como base el tamaño del polimorfismo del gen coa y del gen spa en su región Xr y la heterogeneidad del perfil, identificados mediante el análisis de macrorestricción con el uso de electroforesis en gel de campos pulsados. Únicamente fueron investigados los aislamientos con perfiles
genéticos diferentes.

Control de la resistencia a antibióticos

La detección de la resistencia fenotípica y genotípica a la penicilina G y la oxacilina se realizó aplicando el método de la difusión estándar en disco30 y la prueba molecular con la PCR, respectivamente. La determinación de la sensibilidad de los aislamientos a los antibióticos antes mencionados se realizó haciendo cultivo de las cepas de S. aureus en caldo de Mueller-Hinton durante 4 h a 37°C. Subsecuentemente, 10 μl de la suspensión fue inoculada en agar Mueller- Hinton. Enseguida se colocó un disco con antibiótico, que contenía 10 UI de penicilina G o 1 mg de oxacilina en el centro del medio de cultivo.

Los medios de agar se incubaron durante 24 h a 37°C. Se midió la zona de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor del disco y se comparó con los parámetros establecidos para estas pruebas. Los resultados de las pruebas se interpretaron de acuerdo con las normas del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Las cepas de S. aureus resistentes a oxacilina también fuero inoculadas en BBL Cromoagar MRSA. Los medios se incubaron de forma aerobia a 37°C y se leyeron después de 24 horas. Los MRSA tuvieron una coloración violeta y las otras colonias un color blanco, azul o azul- verde. Para verificar los resultados fenotípicos obtenidos, adicionalmente se determinó la concentración mínima inhibitoria MIC utilizando el sistema Vitek II.

RESULTADOS

Las 530 cepas de S. aureus de muestras de leche con mastitis fueron identificadas con el uso de la prueba de plasmacoagulasa y el sistema comercial de identificación API 32 Staph. Ello se confirmó fenotípicamente por la amplificación, mediante la PCR, de los segmentos específicos de S. aureus, que codifican para los genes 23S rRNA,
nucleasa termoestable (nuc), clumping factor o factor aglutinante (clfA), coagulasa (coa) y el segmento del gen que codifica para la región respectiva Xr y la región enlazante de IgG de la proteína A (spa). Dependiendo del tamaño del polimorfismo del gen coa y la región Xr del gen spa, y de acuerdo con los perfiles de macrorestricción mediante PFGE, como resultado de este estricto proceso se seleccionaron 68 aislamientos de S. aureus de los 530 aislamientos de campo iniciales, para continuar con las investigaciones. Finalmente se seleccionaron 26 aislamientos de Alemania, 16 de Indonesia, 16 de México y 10 de Brasil.

De acuerdo con los resultados de la resistencia a penicilina G y a oxacilina. 40 cepas mostraron mediante métodos fenotípicos resistencia a la penicilina G y 50 cepas fueron positivas genotípicamente al gen blaZ . La investigación genotípica para detectar el gen mecA en las 68 cepas de S. aureus analizadas reveló la presencia del gen sólo en un aislamiento originario de Brasil, si bien este resultado no concuerda con resultado negativo obtenido mediante el método estándar de difusión en disco de BBL-Cromoagar y la determinación de MIC sensible a oxacilina, por Vitek II.

En contraste a la resistencia a oxacilina y el gen mecA, el examen genotípico y fenotípico de la resistencia a penicilina G y al gen blaZ, la mayoría de las cepas de S. aureus mostraron la diseminación del gen blaZ(,) al hacer la prueba genotípica por PCR. En la mayoría de las cepas de S. aureus investigadas se localizó el gen blaZ 50 (73.5%).

Detalladamente, 18 cepas de Alemania (65.2%), 11 de México (68.75%), 8 de Indonesia (80.0%) y 13 de Brasil (81.3%) fueron positivas al gen blaZ. En contraste, en el análisis fenotípico, únicamente 40 cepas (58.8%) fueron resistentes a la penicilina G. La distribución detallada fue: 10 cepas de campo en Alemania (38.5%), 5 en México (13.3%), 5 en Indonesia (50%) y 10 en Brasil (62.4%).

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos muestran que la resistencia de las cepas aisladas de campo de S. aureus a las penicilinas semisintéticas, actualmente no es un problema importante en las vacas lecheras, a pesar del uso extensivo de esas sustancias antibióticas en el campo en los países investigados.

Se ha comprobado que es importante el manejo adecuado higiénico de las vacas lecheras y otros animales domésticos para evitar la transmisión de S. aureus que como se ha visto a través de este trabajo, puede ocasionar diversos problemas de salud infecciosos en humanos.

Capítulo del libro módulo Jean Monnet de marzo de 2018 de la Ciudad de México.

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