Epidemiología molecular de mycobacterium bovis en bovinos y humanos

La prevalencia exacta de las infecciones por M. bovis en humanos es desconocida y subdiagnosticada, especialmente en varios países africanos  (Cosivi et al., 1998). Se asume comúnmente que M. bovis es menos virulento y tiene menos transmisión potencial entre poblaciones humanas que M. tuberculosis. Esto podría atribuirse a la presencia de tres mutaciones que afectan el sistema de regulación de virulencia PhoPR en M. bovis y el linaje estrechamente relacionado de M. africanum 6 (Gonzalo-Asensio et al., 2014). Sin embargo, M. bovis sigue siendo una seria infección oportunista en personas infectadas por el VIH. Por lo tanto, es importante que los encargados de formular políticas de salud pública, sean capaces de diferenciar las infecciones humanas causadas por M. bovis de las debidas a M. tuberculosis (Cosivi et al., 1998; Wedlock et al., 2002). La libre circulación de ganado dentro y entre países e incluso continentes ciertamente facilitan la distribución mundial de la tuberculosis bovina y la propagación de cepas resistentes a los antibióticos recientemente evolucionadas (Sechi et al., 2001). Por esta razón, se están haciendo grandes esfuerzos para comprender la estructura de la población de M. bovis mediante el uso de técnicas moleculares recientes, que permiten  la identificación de la cepa dominante de M. bovis en grandes ubicaciones geográficas y para el rastreo de la fuente de introducción (Kamerbeek et al., 1997; Lindstedt, 2005; Müller et al, 2009). El resurgimiento de la tuberculosis bovina entre animales y humanos es una seria preocupación mundial, especialmente en países en desarrollo. Se detectaron infecciones por Mycobacterium bovis en rebaños de ganado en 109 países en todo el mundo entre 2005 y 2010 (Ramos et al.,2014). Personas que viven en contacto cercano con ganado infectado o los niños que beben leche sin pasteurizar corren el riesgo de infección. Por otro lado, también se informó en animales, casos tuberculosis causada por M. tuberculosis que viven en contacto cercano con humanos (Cadmus et al., 2006; Srivastava et al., 2008). Se estimó que alrededor del 3,1% de los casos de tuberculosis humana en todo el mundo son causadas por M. bovis. Mientras <1% de humanos las infecciones son causadas por M. bovis en España, la prevalencia en África oscila entre el 3,9% en Nigeria, hasta el 7% en Uganda, e incluso 16% en Tanzania (Romero et al., 2006; Malama et al., 2014). Se informó que en algunos países en desarrollo que, M. bovis es responsable del 5 al 10% de casos de la tuberculosis humana y 30% de todos los casos de TB en niños (Wedlock et al., 2002). Mycobacterium bovis podría aislarse de aproximadamente 3.9–5% de pacientes con tuberculosis humana en Nigeria (Idigbe et al., 1986; Cadmus et al., 2006; Mawak et al., 2006) y 0.6-1.85% de pacientes con tuberculosis pulmonar en Burkina Faso. El patógeno también se detectó en 26.5% de muestras de leche no pasteurizada (Sanou et al., 2014). En Zambia, el espoligotyping de 49 cepas de M. bovis con origen bovino y humano reveló una alta homogeneidad entre los genotipos existentes e incluso idénticos perfiles genéticos MIRU VNTR. El mismo perfil genético caracterizado por la ausencia de espaciadores 3, 9, 16 y 39–43, SB 0120 / SIT 482 se informó en ganado tuberculoso en Argelia, Brasil, Francia y Zambia, y en pacientes humanos de Italia y Alemania.  Este perfil difiere del observado en Países de África Oriental y África del Sur (Malama et al., 2014); sin embargo, se informaron reportes similares en Etiopía y en España, donde M. bovis es aislado de humanos y bovinos, que compartían el mismo perfil genético incluso en cepas de M. bovis multirresistentes (MDR). Sin embargo, algunos espaciadores y ciertos MIRU-VNTR, que no se usan en el sistema actual de espoligotyping, podrían diferenciar entre M. bovis de origen humano y bovino. Ellos difieren en una copia en ETR-A y en QUB-3232 (Romero et al., 2006; Gumi et al., 2012).

De 55 países africanos y 36 asiáticos, solo siete africanos y siete países asiáticos aplican  medidas de control adecuadas de la enfermedad; los 77 países restantes controlan la enfermedad inadecuadamente o nada en absoluto. Alrededor del 94% del ganado y el 99% de las poblaciones de búfalos en Asia están controladas en parte por bTB o no controladas en absoluto. Por lo tanto, alrededor del 85% del ganado africano  y el 82% de la población humana en África, y el 94% de la población humana en Asia vive en alto riesgo de TB (Cosivi et al., 1998). En América Latina, alrededor del 24% del ganado y el 60% de la población humana vive en áreas donde no hay control o solo control limitado para la tuberculosis bovina (Cosivi et al., 1995; Muller et al., 2013). Esto se cree que es un resultado de reservorios de vida silvestre que propagan la infección a animales de granja, especialmente ganado bovino. Tales reservorios hacen la erradicación más complicada y extremadamente difícil, y necesitan programas especiales para controlar la enfermedad (Cosivi et al., 1998; Renwick et al., 2007; More et al., 2015).

Las herramientas epidemiológicas moleculares ahora se aplican a proporcionar información novedosa sobre la propagación de la enfermedad. y a analizar su dinámica de transmisión (Small y Van Embden, 1994; Savine et al., 2002). En África, los estudios epidemiológicos de TB son difíciles de realizar debido al costo y a la falta de información y equipos capacitados. Sin embargo, algunos  datos primarios están disponibles en ciertos países africanos. En Nigeria y Camerún, los perfiles de espoligotipos de algunas cepas aisladas de M. bovis ofrecen alguna información sobre su distribución entre poblaciones humanas y animales en África occidental (Muller et al., 2009). Fue realizado un estudio de  epidemiologia molecular, por tipificación de los aislamientos basados en espoligotyping, en la eliminación de la deleción RDAf1 y la tipificación MIRU-VNTR, resultó en la detección de 12 espoligotipos, y los datos obtenidos agruparon los 33 aislamientos de M. bovis investigados, en siete grupos, incluidos los aislados exclusivamente de ganado (5) o humanos (1) o de ambos (1). En estos aislamientos  se muestra que pertenecen principalmente al complejo clonal africano 1 (Af1) (81.8%) y, en menor medida, al supuesto complejo clonal africano 5 (Af5) (18.2%)  (Sanou et al.,2014). Con la ayuda del espoligotyping, cepas de M. bovis de origen bovino aisladas de Mali, pueden dividirse en dos grupos el primer grupo está marcado por la clara pérdida de espaciador 30 y representa el 65% de las cepas detectadas y se asemeja a las cepas detectadas en Chad, Camerún y Nigeria.

Este espoligotipo está estrechamente relacionado con el tipo BCG que domina en Francia, lo que sugiere que M. bovis podría haber sido importado a esta región durante la época colonial francesa, con 12/13 aislamientos sin espaciador 6 además con el espaciador 30. El segundo grupo (6/7 aislamientos), sin espaciadores 4 y 5, se asemeja a patrones de espoligotipos previamente identificados en Francia, España y el norte de África (Muller et al., 2008). Sin embargo, hay una fuerte relación entre el norte de África (principalmente argelino) y se esperaban aislamientos franceses debido a la importación de animales vivos de Europa a Argelia durante el período colonial francés (1830–1962) y más tarde (Sahraoui et al., 2009). En África occidental, el patrón African 1 (Af1) del espoligotipo del clon de M. bovis SB0944 dominante, se encontró en Chad, Nigeria, Mali y Camerún, indicando un antepasado separado para este clon en los países mencionados. Estos están estrechamente relacionados y caracterizados por una deleción cromosómica específica (RDAf1) y la ausencia del espaciador 30 en los patrones de espoligotipo. 

Por otra parte, se detectó un clon diferente (African 2; Af2) solo en África oriental (Etiopía, Burundi, Uganda y Tanzania), que podría ser menos virulento que Af1 debido a la falta total del operón mce2 como consecuencia de la deleción RDAf2, en el clon Af2, además del operón mce3 que ya está ausente en todas las cepas de M. bovis. Sin embargo, las cepas Af2 son capaces de causar lesiones de tubérculos típicos en bovinos. Este clon está definido por una deleción específica cromosomal (RDAf2) con la ausencia de espaciadores 3 a 7 en sus patrones. Es posible que todos los patrones de espoligotipos de Af2 se derivaron de un patrón de espoligotipo ancestral equivalente al de la cepa de vacuna BCG (SB0120, faltan espaciadores 3, 9, 16 y 39 a 43), con la eliminación adicional de espaciadores 4 a 7 (SB0133). Mientras que  las cepas del complejo clonal Af2 se detectaron solo en ganado criado en el este África, el complejo clonal Af1 se detectó solo en bovinos de África centro-occidental (Berg et al., 2011). En Mozambique y Sudáfrica, se reportan los clones no Af1 – no Af2, muy probablemente el clon europeo (europeo 1; Eu1) caracterizado por una eliminación específica llamada RDEu1 y la pérdida del espaciador espoligotipo 11 (los espaciadores 4 a 7 están generalmente presentes) según (Berg et al., 2011). El clon Eu1 es rara vez reportado en África con la excepción de Sur de África. Casi el 99% de bTB encontrado en Inglaterra e Irlanda pertenecen a la Eu1 caracterizada por la deleción del cromosoma región RDEu1 y ausencia de espaciador 11 en su patrón. Este clon también domina en ubicaciones de ex socios comerciales y colonias de habla inglesa del Reino Unido. Esto puede atribuirse a la exportación masiva de Hereford, ganado de carne en el siglo 18 desde el Reino Unido hasta su antigua colonias, que serían el vehículo para la propagación de este clon. Sin embargo, el Eu1 está presente en el 14% de los franceses y portugueses. y aislados españoles que pertenecen a este perfil y es raro en otros países europeos. Mientras tanto, con la excepción de Brasil, el complejo clonal Eu1 domina en América del Norte y del Sur, especialmente en Argentina, Chile, Ecuador, México y América del Norte. El clon Eu1 incluso se aisló en Corea y Kazajstán, pero no en África, excepto Sudáfrica (Ameni et al., 2010; Berg et al., 2011; Mwakapuja et al., 2013; Rodr iguez Campos, 2013).

El uso de herramientas modernas de epidemiología molecular permitió la identificación de tres linajes clonales de M. bovis, a saber, miembros africanos 1, africanos 2 y europeos 1. Miembros de cada grupo tienen una firma espoligotipo distinta y son caracterizado por una eliminación única presente en cada miembro del complejo Los grupos africanos 1 y africanos 2 están restringidos a África central y occidental y África oriental, respectivamente, y nunca fueron detectados en ganado fuera de estos regiones, mientras que los miembros europeos 1 están distribuidos globalmente. Se cree que esta distribución global resultó de la exportación de razas modernas de ganado, como Herefords criados en el Reino Unido en el siglo 18, a los antiguos británicos colonias Las vacas actuaron como un vehículo para la diseminación en el mundo de este grupo de cepas estrechamente relacionadas (Smith, 2012).

Descripción general de las técnicas  epidemiológicas moleculares más utilizadas. Aunque se ha realizado diferentes estudios epidemiológicos moleculares  para permitir una mejor trazabilidad de infecciones por M. bovis y detectar la fuente de brotes (Haddad et al., 2001), todavía hay varios problemas en el desarrollo de sistemas de genotipado eficaces y estandarizados de M. bovis  para crear protocolos de  genotipos estándar ampliamente aceptados (Durr et al., 2000b). Por lo tanto, diferentes técnicas han sido desarrolladas para el genotipado de M. bovis, incluidas técnicas de genoma completo (por ejemplo, restricción análisis de endonucleasa [REA],  fragmentos de restricción de longitud polimórfica / RFLP, electroforesis en gel de campos pulsados / PFGE, secuenciación del genoma completo y microarreglos de genoma completo  y las técnicas de genoma parcial como secuencias repetidas específicas (por ejemplo, secuencias repetidas al azar y secuencias repetidas no aleatorias); secuencias aleatorias (p. ej., análisis de amplificación aleatoria de ADN polimórfico  / RAPD); genes de mantenimiento (p. ej. de tipificación de secuencia multilocus / MLST); regiones de diferencia (repeticiones directas / tipificación DR) y polimorfismo de un solo nucleótido (tipificación SNP). Las secuencias repetidas al azar incluyen  la tipificación VNTR y la amplificación IS6110 mientras las secuencias no repetidas al azar incluyen el IS6110- RFLP, IS1081-RFLP, PGRS-RFLP, DR-RFLP y la tipificación espaciadora de oligonucleótidos (espoliogotyping) (Kremer et al., 1999; Durr et al., 2000a, b; Gormley et al., 2014; Jagielski et al., 2014).

No todas estas técnicas están en uso por varias razones, principalmente la falta de reproducibilidad, alto costo y complejidad. Entre las primeras técnicas de genotipado basadas en PCR se encontró el análisis de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD). Esta técnica rara vez se usa ahora debido a su falta de reproducibilidad y poca discriminación (Jagielski et al., 2014). Del mismo modo, fue usado el Ampliprinting del IS6110 dirigido al repeticiones del tándem polimórfico principal (MPTR). La región MPTR se asemeja a la región RD y consta de repeticiones directas de 10 pb separadas por espaciadores de 5 pb. El MPTR también carece de reproducibilidad y por lo tanto, no se usa como método de genotipado de rutina (Kremer et al., 1999; Collins, 2011). Porque otras regiones en el genoma de las micobacterias contienen hasta 80% de nucleótidos G C, estas secuencias ricas en GC polimórficas (PGRS) pueden usarse para la tipificación molecular; sin embargo, logran solo un alto poder discriminatorio en cepas con una copia alta número de IS6110. Por esta razón, IS6110-RFLP se convirtió en el estándar de oro para la tuberculosis humana y bovina a lo largo de muchos años. Sin embargo, su uso en la tuberculosis bovina es menos común debido al menor número de copias de IS6110 en M. bovis (Collins, 2011). Aunque el polimorfismo de un solo nucleótido, tipificado (SNP) tiene un claro poder discriminatorio, no se usa comúnmente porque es una técnica de dos pasos (PCR luego secuenciación, o PCR luego enzima de restricción), lo que lo hace costoso y consume mucho tiempo (Abadia et al., 2010; Schurch et al., 2011; Rodrigo Campos, 2013; Jagielski et al., 2014).

La tipificación de los aislados de TB usando el fragmento de restricción IS6110. El análisis  de fragmentos de restricción de longitud polimórfica  (RFLP) se describió por primera vez epidemiológicas moleculares (van Soolingen et al., 1991) e incluso se considera el "estándar de oro" actual y el método de tipificación más aplicado del complejo M. tuberculosis (van Soolingen et al., 1991). La técnica detecta la variación tanto en el número como en posición genómica de IS6110 y al hacerlo, genera patrones reproductivos específicos de la cepa (Hayward y Watson, 1998). Sin embargo, el uso de la tipificación molecular de M. bovis en Inglaterra basado en RFLP indicó que la mayoría de las cepas en el Reino Unido contienen solo una copia de IS6110, que limita La utilidad de este método (Smith et al., 2006).  Adicionalmente, tiene un bajo poder discriminatorio, especialmente para las cepas con un bajo número de copias  de IS6110 (Kremer et al., 1999; Serraino et al., 1999). Entre todas las técnicas de RFLP para la tipificación de M. bovis, PGRS-RFLP tiene el mejor poder discriminatorio. Sin embargo, en contraste a todas las técnicas de RFLP, que requieren extracción de ADN, grandes cantidades de ADN,  alta tecnicidad, y que tienen problemas con su reproducibilidad y llevan mucho tiempo, el  espoligotyping no solo es rápido, simple y reproducible, sino también se puede llevar a cabo en lisados celulares o especímenes clínicos (Dvorska et al., 2001; Haddad et al., 2001).

Espoligotyping. La introducción de "oligonucleótido espaciador" o "espoligotyping" para la tipificación molecular de MTBC comenzó en 1997 (Kamerbeek et al., 1997). Es un método basado en PCR, como otro técnicas, pero evita las dificultades técnicas que enfrenta IS6110 RFLP tipificando. Al principio, espoligotyping mostró un valor limitado para la transmisión epidemiológica cuando se usa solo, por lo que se combinó con análisis IS6110 RFLP (Kremer et al., 1999). Espoligotyping es ahora cada vez más utilizado en epidemiología molecular de MTC como así como en la diferenciación de especies y cepas. Esta técnica depende de las diferencias genéticas entre cepas debido a pérdida de espaciadores en la región de repetición directa (DR) en MTC (Kamerbeek et al., 1997).  La espoligotyping es más discriminatoria que IS61110 RFLP, pero igualmente tan discriminatoria como DR-RFLP, que identifica el polimorfismo del genoma en la región DR. Sin embargo, el espoligotyping sigue siendo la técnica preferida ya que es fácil de hacer e interpretar (Durr et al., 2000b).

Como la introducción de cualquier mutación (por ejemplo, deleción) en una cepa, será heredada por todos sus descendientes, puede ser usada para rastrear complejos clonales. Sobre estas bases, fue desarrollado el espoligotyping. El espoligotyping es un método simple y rápido, una herramienta para la tipificación molecular de M. bovis que no requiere ADN purificado El espoligotyping es una mezcla de PCR y técnicas de hibridación. En 1993, agrupados regularmente se descubrieron repeticiones palindrómicas interespaciadas (CRISPR) en el MTBC. Esta región de repetición directa (DR) consiste de múltiples repeticiones directas de 36 pb separadas por espaciadores en longitud de 25 a 41 pb. Mientras tanto, una variante directa repetida (DVR) consiste en una sola repetición directa (DR) y su espaciador adyacente. La tipificación de las cepas depende de la presencia o ausencia de los diferentes separadores. El uso de espoligotyping depende de la detección de 43 de 104 espaciadores identificados Para espoligotyping, las DR son blanco de los oligonucleótidos de PCR se amplificarán y se secarán para detectar los espaciadores actuales Los datos pueden ser digitalizados y almacenados como código binario, y cada patrón de espoligotipo se convierte en un identificador único cuando se envía al banco internacional de patrones de espoligotipo en www.Mbovis.org. El código utilizado incluye el prefijo SB seguido de uno a cuatro dígitos en que 0 y 1 representan la ausencia o presencia de espaciadores, respectivamente. Esto permite la comparación y el rastreo de la relación evolutiva entre cepas,  los espaciadores pueden solo  perderse, pero no se pueden recuperar. Los espaciadores están frecuentemente perdidos independientemente, en diferentes linajes (homoplasia) (Muller et al., 2008; Sahraoui et al., 2009; Berg et al., 2011; Rodriguez Campos, 2013). El espoligotyping se considera el análisis epidemiológico más común de tipificación molecular para M. bovis. La aplicación de espoligotyping para la trazabilidad  espacial (geotipado) y temporal (cronotipado) de los brotes, es práctica y útil (Haddad et al., 2001). Esto depende de identificación de los polimorfismos en las unidades espaciadoras de la región de repetición directa (DR) del cromosoma. Esta  región consiste en una variante directa múltiple, prácticamente idéntica de unidades de repetición (DVR),  secuencias de 36 bp intercaladas con espaciadores de ADN de un tamaño similar. La región DR puede contener más de 60 unidades DVR. Sin embargo, 43 de estas unidades fueron elegidas del genoma de la cepa de M. tuberculosis (H37RV) y la cepa de M. bovis BCG (P3) que se utilizará como estándar para la espoligotipificación de todos los miembros del complejo M. tuberculosis. Sin embargo, con la amplificación de algunos  se descubrió que los espaciadores (14, 15, 18, 39 y 40) eran problemáticos debido a mutaciones de secuencias (Abadia et al., 2010; Rodriguez Campos, 2013).

Cada patrón de espoligotipo tiene un identificador dado y un nombre internacional (por ejemplo, "tipo 9" en el Reino Unido y SB0140, respectivamente) según (Smith et al., 2006). La técnica entrega datos digitales que se pueden analizar y compartir fácilmente entre laboratorios con un alto poder discriminatorio entre los miembros de MTBC. También puede definir clados y familias de M. tuberculosis en estudios filogenéticos (Brudey et al., 2006). Para la detección de los espaciadores actuales, se requiere la tecnica de transferencia de línea inversa (RLB reverse line blotting). La mancha de espoligotiping se puede realizar en una membrana de hibridación o en una membrana de espoligotyping comercial (Plataforma Luminex). Se descubrió que este último es más rápido y más fácil,  para aumentar la reproducibilidad (Jeffries et al.,2009).

Una desventaja importante del espoligotyping es su incapacidad para lidiar con la infección mixta ya que los datos entregados serán de los espaciadores actuales de todas las cepas existentes. El VNTR en contraste, se puede aplicar incluso si se sospecha una infección mixta, ya que esto se visualizará como una doble banda. Adicionalmente, y opuesto al espoligotyping,  el número variable de repeticiones en tándem  (VNTR) también conocido como tipificacion multilocus de objetivos repetidos en tándem de número variable (MLVA)  tiene como objetivo, loci polimórficos de repeticiones en tándem distribuidos por todo el genoma (Rodriguez Campos, 2013).

La comparación de perfiles genéticos entre los aislados animales y humanos de M. bovis nos permiten detectar la (s) fuente (s) de infección y la (s) rutas de transmisión, y para predecir el panorama futuro de la progresión de la enfermedad vale la pena mencionarlo que el poder discriminatorio de los diferentes tipos.

Las técnicas disponibles para M. bovis varían según el país, y los genotipos de origen humano de M. bovis son paralelos a los del ganado dentro del mismo país, lo que apoya la presencia de un vínculo epidemiológico entre casos humanos y animales de tuberculosis por M. bovis (Lari et al., 2011). Al comparar ambos aislados humanos y bovinos de la Toscana, Italia, los aislados con el perfil espoligotipo ST482 / SB0120 dominaron en ambas especies Se detectaron en 63.8% y 54.6% de aislados humanos y rebaños infectados, respectivamente (Boniotti et al., 2009; Lari et al., 2011). El mismo espoligotipo domina entre bovinos aislados de Francia, Alemania  y España (Aranaz et al., 1996; Haddad et al., 2001; Kubica et al., 2003), pero no en el Reino Unido o Irlanda. También se informaron otros perfiles en aislamientos de M. bovis de humanos en Italia, incluido el espoligotipo ST482 / SB0120, que también se detectó en el 20% de los pacientes alemanes y el 1% de pacientes británicos,  el perfil SIT665 / SB0134, presente en 5.8% de aislados bovinos, el perfil SB0934 en 1.3%  aislados de bovinos  y finalmente los perfiles menos significativos SB0927, SB0950 y SB0867, que estaban presentes en <1% de los rebaños (Aranaz et al., 1996; Kubica et al., 2003; Lari et al., 2011). El número total de espoligotipos en Francia es muy alto, indicando más heterogeneidad de cepa en comparación con otras regiones como el Reino Unido, Australia, Camerún y Tanzania, y conduce a la baja prevalencia de los tipos dominantes entre la población de M. bovis. En Francia, el espoligotipo más común es el grupo tipo BCG, que se asemeja a la cepa de vacuna M. bovis BCG aislada en Francia en el siglo XIX. Sin embargo, la prevalencia de los dos principales espoligotipos (BCG-like y GB54) en Francia es bajo en comparación con la prevalencia de los dos principales espoligotipos presentes en el Reino Unido (70% de los aislados), Irlanda (52% de los aislamientos), Italia (66,6%), España (46%) y Australia, Canadá e Irán (88%) (Haddad et al., 2001).

Es notable que los espoligotipos en Francia difieran de los detectados en el Reino Unido; los espoligotipos predominantes en el Reino Unido se detectaron en un porcentaje muy bajo en Francia y viceversa. Por otro lado, las cepas dominantes en el Reino Unido también dominan en lugares tradicionalmente vinculados al Reino Unido, como los países de la Commonwealth y países sudamericanos. También es inusual que el tipo BCG like, que domina en Francia nunca ha sido reportado en el Reino Unido, pero se detecta con frecuencia en otros países europeos como Bélgica, Italia y España, y también en el norte de África (Haddad et al., 2001; Smith, 2012; Lamine-Khemiri et al., 2014). En Francia, el dominio del espoligotipo tipo BCG durante décadas indica la alta estabilidad de la región  RD en comparación con otros marcadores como IS6110. Mientras tanto, la detección de más variantes de espoligotipos en el tipo BCG grupo junto con la disminución continua de la prevalencia de los aislados de BCG, indica la evolución progresiva de los espoligotipos (Haddad et al., 2001).

Hoy en día, la mayoría de los laboratorios dependen de técnicas basadas en PCR, como el análisis de variables multilocus (MLVA) para el tipificado M. bovis  ya que son más rápidos, fáciles, reproducibles y rentables (Romero et al., 2006). El análisis MLVA, también referido como unidad repetitiva intercalada micobacteriana, número variable de repeticiones en tándem (MIRU-VNTR) (Allix et al., 2006) depende de la variación de la cepa indicada por la diversidad alélica en estos loci múltiples. El uso del análisis MLVA para la investigación de transmisión de M. bovis ayuda a entregar  datos altamente informativos cuando se combinan con datos tradicionales epidemiología (Allix et al., 2006). Para aumentar el poder discriminatorio de espoligotyping, la tipificación VNTR se utiliza para subtipos adicionales de grupos de cepas inicialmente identificados por espoligotyping, ya que la tipificación VNTR permite una mayor discriminación que el espoligotyping (Muller et al., 2008; Sahraoui et al., 2009). Además, el espoligotyping permite la diferenciación de especies, basado en la ausencia de ciertos separadores en ciertos miembros de MTB, por ejemplo, la ausencia de número espaciador 3, 9, 16 y 39–43 en M. bovis y espaciadores 1, 3–16, 28 y 39–43 en M. caprae (Dvorska et al., 2001; Rodriguez Campos,2013).

En general, la herramienta de epidemiología molecular  más comúnmente aceptada es la tipificación por números variables de repeticiones en tándem (VNTR). Es una tipificación basada en PCR fácil y barata que ofrece discriminación reproducible y precisa entre aislamientos de MTBC. Incluye la tipificación de diferentes loci genómicos, tales como repeticiones tándem exactas (ETR) (Frothingham y Meeker-O’Connell, 1998), unidades repetitivas intercaladas micobacteriales (MIRU) (Supply et al., 2000; Mazars et al., 2001) . La tipificación de repetición en tándem de nucleótidos variable (VNTR) detecta la variación en los números de diferentes conjuntos de repetición dispersos por todo el genoma y es similar al concepto de tipificación mini-satélite. Los loci usados ya están bien caracterizados. Sin embargo, no existe una demarcación aguda entre estas clasificaciones, es decir, algunas regiones genómicas son ETR y MIRU al mismo tiempo (Smith et al., 2006). Sin embargo, hay muchas diferencias entre MIRU y otros VNTR, como la presencia de algunos reguladores elementos en las MIRU como codones de inicio y parada o secuencias de consenso y el hecho de que las MIRU generalmente se superponen a los codones de inicio y parada de los genes flanqueantes (Supply et al., 2000; Romano et al., 2005).

Queen’s University en Belfast (QUB) y repetición en tándem exacta (ETR) son otros conjuntos de repeticiones de secuencia VNTR. Consisten en muchas copias de unidades de 56 a 60 bp de largo y muestran alta reproducibilidad. Sin embargo, su mayor desventaja es su bajo poder de discriminación para las cepas con un alto número de copias de IS6110 en comparación con aquellos con un bajo número de copias. En general, el análisis VNTR permite la discriminación de cepas no relacionadas de M. bovis mejor que el espoligotyping (Hilty et al., 2005; Skuce et al., 2005). Seis repeticiones en tándem llamadas repeticiones en tándem exactas (ETR) se reportaron, a saber, A, B, C, D, E y F. Varían en tamaño de 53 a 79 pb. Se encontró que los primeros cinco (A a E) ofrecen suficiente discriminación (Filliol et al., 2000). También fueron reportadas 40-50 unidades repetitivas micobacterianas intercaladas (MIRU) que varían en tamaño de 46 a 101 pb. Aunque la mayoría las repeticiones se encuentran en las regiones intergénicas, algunas de ellas están ubicados dentro de un ORF que indica variación en la secuencia proteica y eventualmente también actividad fisiológica. Mientras algunos investigadores suponen que el polimorfismo en el los espacios intergénicos pueden afectar la expresión de genes downstream (3’), por ejemplo, ETR-A se encuentra en el promotor región del gen katG, otros no están de acuerdo con esta teoría porque la posición de los loci no siempre se conserva entre los miembros del MTC (Goyal et al., 1994; Rodriguez Campos, 2013). Sin embargo, se reportó una asociación entre el tipos de espoligotipo-VNTR y la virulencia de M. bovis  en ganado (Garbaccio et al., 2014). Debido al creciente número de secuencias tándem descubiertas (VNTR, MIRU, ETR y QUB) y la confusión en su nomenclatura entre investigadores (por ejemplo, ETR-D y ETR-E son MIRU al mismo tiempo), fueron llevados a cabo ensayos para estandarizar un sistema de nomenclatura de cuatro dígitos para facilitar la comparación de datos (Filliol et al., 2000; Rodriguez Campos, 2013). En los últimos años, la tipificación VNTR se ha convertido en el nuevo estándar para la tipificación de cepas MTBC. Sin embargo, la diversidad estandarizada y alélica de loci puede variar en diferentes países y entre miembros de cepas complejas de M. tuberculosis. Las razones por las que VNTR sea el método de elección para la tipificación de MTBC es su breve tiempo de respuesta, el hecho de que ofrece una comparación simple de los resultados digitales y su aplicabilidad a pequeños volúmenes de ADN (Lindstedt, 2005). También tiene un poder de alta discriminación para aislamientos de M. tuberculosis (Andersen et al., 1996; Le Fleche et al., 2001, 2002, 2006; Pourcel et al., 2004). Solo 12 de 41 loci MIRU bien caracterizados mostraron polimorfismo y tuvieron una discriminación significativa  (Supply et al., 2000). Sin embargo, su combinación con otros tipos de loci polimórficos como ETR, que contienen grandes unidades de repetición que varían en tamaño de 53 a 79 pb, mejoraría el poder discriminatorio (Frothingham y Meeker-O’Connell, 1998). En 2004, la Agencia de Protección a la salud (HPA) estandarizó sus protocolos de tipificación en diferentes laboratorios de TB combinando ambos ETR y loci MIRU en un conjunto de 15 loci. Más tarde, en 2006, se desarrolló un panel de 24 VNTR para optimizar la discriminación y reproducibilidad de la prueba, que involucró los 15 VNTR propuestos anteriormente más 9 adicionales VNTRs. En 2009, este protocolo se convirtió en el nuevo panel estándar global para tipificación (Goyal et al., 1994; HPA, 2012; Rodriguez Campos, 2013) Además, este sistema de paneles también  encontró que era útil para la tipificación de M. tuberculosis no miembros del MTBC (Stone et al., 2012). Varios investigadores reportaron que la aplicación de QUB3232, ETR-A, ETR-B, QUB11a, QUB11b y QUB26 en comparación con MIRU4, 10, 16, 26 y 31 para M. caprae resultó en la mayor discriminación entre diferentes aislamientos de M. bovis (Dvorska et al., 2001; Lari et al., 2011).

Hasta el momento, ninguna de las técnicas de escritura conocidas puede ser aplicada de forma única. Cada herramienta tiene ventajas y desventajas. Sin embargo, el uso de espoligotyping en combinación con otro MIRU-VNTR (número variable de repeticiones en tándem de unidades repetitivas interespaciadas de micobacterias) mejora el poder discriminatorio entre las cepas (Ramos et al., 2014).