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V Congreso Internacional de Producción Animal Tropical 2015

Efecto del diámetro de la aguja, presión de aspiración y tamaño de los folículos sobre la tasa de recuperación y calidad de ovocitos obtenidos por aspiración folicular en bovinos

Publicado el: 25/9/2018
Autor/es:
Resumen

El presente estudio fue desarrollado con el objetivo de evaluar el efecto del diámetro de la aguja, la presión de aspiración, el tamaño de los folículos aspirados y la interacción de estos factores, sobre la tasa de recuperación y calidad de ovocitos obtenidos por aspiración folicular en bovinos. Se utilizaron ovarios de matadero, los cuales fueron llevados hasta el laboratorio en donde se procedió a aspirar los folículos, empleando un equipo para aspiración folicular transvaginal guiada por ecografía. Los datos se evaluaron empleando un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2x2x3, con desigual número de sub-muestras y análisis categórico. Empleando dos diámetros de aguja (18 y 20G), dos frecuencias de aspiración (50 y 80 mmHg) y tres tamaños de folículos (2 a 5mm, 6-10mm y >10mm Ø), fueron conformadas 12 combinaciones, una para cada tratamiento, como se aprecia en la tabla 1. Los ovocitos obtenidos fueron evaluados y se clasificaron morfológicamente de acuerdo a de Loos et al. (1989), en escala de 1 a 4, (1, 2, 3 aptos y 4 no aptos para FIV). Las agujas 18G permitieron las mejores tasas de recuperación cuando se aspiran folículos de pequeño y mediano tamaño, mientras las de 20G cuando se aspiran folículos grandes, al mismo tiempo que parecen tener poca influencia sobre la calidad de los ovocitos recuperados. Las tasas de recuperación de ovocitos fueron mejores cuando la presión de aspiración empleada fue alta. La presión de aspiración parece no tener mayor influencia sobre la calidad, sin embargo, pareciera ser que puede afectar positivamente en la recuperación de ovocitos grado 2, cuando se emplea una baja presión. Las tasas de recuperación son mejores cuando se aspiraron folículos de pequeño y mediano tamaño a la vez que aportan un mayor porcentaje de ovocitos aptos para FIV. Los folículos grandes presentan la menor proporción de ovocitos desnudos y la mayor proporción de ovocitos degenerados. Se concluye que es posible realizar distintas combinaciones de diámetro de aguja y presión de aspiración en función del tamaño de los folículos, a fin de lograr una interacción que permita la obtención de mejores resultados, tanto en la tasa de recuperación como en la calidad de los ovocitos colectados.

Palabras clave: Aspiración folicular, ovocitos, folículos, diámetro de aguja, presión de aspiración, tasa de recuperación.

Introducción

En la actualidad son utilizadas múltiples biotecnologías de la reproducción que permiten multiplicar la genética de los animales superiores y acortar el intervalo generacional, entre las cuales tenemos la producción de embriones mediante fecundación in vitro (FIV) a partir de ovocitos obtenidos por medio de la técnica de aspiración folicular transvaginal, guiada por ecografía, por su siglas en inglés (Ovum Pick-Up, OPU).

OPU fue aplicada por primera vez en bovinos en 1988 al adaptar para tal fin los procedimientos de búsqueda ultrasonográfica transvaginal utilizados en humanos y aparece como una solución luego de intentos previos de aspiración de folículos en vacas vivas mediante técnicas como la laparotomía y la laparoscopia (Nava et al. 2009).

Antiguamente la recolección de ovocitos para la producción in vitro de embriones provenía sólo de hembras sacrificadas u ovarioectomizadas, presentando grandes limitaciones puesto que no permite ser replicada, disminuyendo la producción de embriones y por tanto limitando la posibilidad de descendencia de las hembras sacrificadas (Denis, 2008). Ante esta situación la obtención de ovocitos de una hembra viva mediante OPU, parece ser la variante que representa la alternativa más viable para lograr satisfacer las necesidades de ovocitos en un sistema de producción continua de embriones (Solís et al. 2012). Asegurando Dayan (2010), que OPU no presenta efectos colaterales significativos a los animales, aun después de cinco años de punciones y permite recolectar ovocitos a hembras con problemas reproductivos, prepúberes, gestantes y que no responden a los métodos de superovulación. Sin embargo, se estima que solo entre un 50 y 70% de los ovocitos obtenidos son aptos para la fertilización in vitro, alrededor del 90% de estos son fertilizados y entre el 20 y 40% alcanzan el estadio de blastocito (Nava et al. 2009). Por lo que la necesidad de obtener el mayor número posible de ovocitos aptos para la fertilización representa una ventaja para la técnica, pues permite obtener mejores resultados.

La calidad de los ovocitos recolectados, la cual se traduce fundamentalmente en la mayor presencia de células del cúmulo que rodean al mismo, se ve influenciada según Palma (2001), por diferentes aspectos, entre los cuales se mencionan los biológicos y los técnicos. Dentro de los biológicos podemos mencionar la Raza, edad, fertilidad, categoría de la donante, estado fisiológico y condición corporal de la donante (Denis. 2008), y entre los técnicos se encuentran el procedimiento de aspiración, tipo y diámetro de la aguja, presión de aspiración y la posible influencia del bisel (Palma, 2001).

El diámetro de la aguja y la presión de aspiración empleados han sido estudiados y correlacionados entre sí, no obstante los estudios realizados por los investigadores no muestran ninguna correlación con el tamaño del folículo aspirado, lo cual a nuestro criterio puede tener un efecto significativo en los resultados, pues estudios han demostrado que el diámetro del folículo también es un factor determinante de la calidad del ovocito y posiblemente sobre el porcentaje de recuperación de los mismos como menciona Seneda et al. (2005).

Resulta entonces de nuestro interés estudiar algunos de los aspectos técnicos más relevantes que afectan la cantidad y calidad de los ovocitos colectados por la técnica de OPU, como los son el diámetro de la aguja y la presión de aspiración empleados y correlacionarlo con el tamaño de folículo aspirado.


Objetivo General:

Evaluar el efecto del diámetro de la aguja, la presión de aspiración, el tamaño de los folículos aspirados y la interacción de estos factores, sobre la tasa de recuperación y calidad ovocitos obtenidos por aspiración folicular a partir de ovarios de vacas sacrificadas.

Objetivos Específicos:

Relacionar el diámetro de la aguja con la tasa de recuperación y calidad de los ovocitos obtenidos.
Asociar la presión de aspiración con la tasa de recuperación y calidad de los ovocitos obtenidos.
Evaluar la influencia del tamaño del folículo sobre la tasa de recuperación y calidad de los ovocitos obtenidos.
Determinar si el diámetro de la aguja, la presión de aspiración y el tamaño de los folículos aspirados interactúan sobre la tasa de recuperación y calidad de folículos obtenidos por aspiración folicular.

 

Metodología

Este estudio se realizó en Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, de la Universidad de Panamá, ubicado en el corregimiento de Chiriquí, el cual está localizado a los 8°23´15.12´´ de latitud norte y 82°19´47.48´´de longitud oeste, con una elevación de 26 msnm. 

La duración de esta investigación fue de aproximadamente seis meses. Se utilizaron ovarios de matadero, los cuales fueron llevados hasta el laboratorio en donde les fueron aspirados sus folículos, empleando un equipo para aspiración folicular transvaginal guiada por ecografía (equipo para realizar OPU).

Dicho equipo consta de un monitor ecográfico (marca essaote, modelo Aquila pro), con su sonda microconvexa acoplada a una guía de agujas para punción ovárica (marca WTA), la cual se encontraba unida a una bomba de vacío (marca Pioneer, modelo PS598), mediante una mangueras de silicona (circuito de aspiración), equipadas con tubos de recolección. Los ovarios fueron manipulados manualmente, con el uso de guantes de latex; colocándolos  contra el transductor acoplado a la guía de aspiración. En ese momento será realizó una combinación de observación visual del ovario para constatar la presencia de folículos y la observación a través de la pantalla del ecógrafo para determinar su tamaño. Una vez localizado el folículo a aspirar se procedió a introducir la aguja y a ejercer presión de vacío. Los folículos viajaban de la aguja a través de mangueras de silicona y llegaban hasta el tubo de recolección contenido con medio de aspiración (PBS mas Heparina en relación 50:1).

El líquido folicular y los ovocitos aspirado junto con el medio de colecta, fueron colocados en un filtro para colecta de embriones. Se adicionaba PBS al filtro, dejando pasar la misma cantidad en adición para lograr esclarecer el contenido aspirado. Se colocó el filtrado en un plato Petri para búsqueda y mediante visión estereoscópica se realizó la búsqueda de los ovocitos.

La calidad de los complejos cumulo ovocito (COCs), fue evaluada empleando una escala de uno a cuatro, adaptada según los criterios de selección propuestos por de Loos et al. (1989). Donde COCs de grado uno fueron considerados excelentes, grado dos: buenos, grado tres: regulares y grado cuatro: malos. Los COCs de grado uno al tres se consideran aptos para fecundación in vitro en tanto que los de grado cuatro no. Los criterios de evaluación de los COCs fueron basados en el número de capas de células del cúmulus, su compactación y homogeneidad, mientras que en el ovocito se apreció la transparencia y homogeneidad del citoplasma, distribuyéndose de la siguiente manera:

 

Análisis estadístico

Los datos se evaluaron empleando un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2x2x3, con desigual número de sub-muestras y análisis categórico. Se trabajó con un nivel de significancia de α 0.05. Los parámetros evaluados fueron analizados empleando el procedimiento CATMOD de SAS (The SAS System, año 1997).

Parámetros en Estudio
Tasa de recuperación de ovocitos aspirados
Calidad de los ovocitos colectados
Modelo Lineal Aditivo
Yijk= μ + DAi + PAj + TFK+(DA*PA)ij+(DA*TF)ik+(PA*TF)jk+(DA*PA*TF)ijk+eijk
Yijk= Variable dependiente
μ= Efecto de la media
DAi= Efecto del diámetro de la aguja
PAj = Efecto de la presión de aspiración
TFK = Efecto del tamaño del folículo
(DA*PA)ij = Efecto de la Interacción del diámetro de la aguja por la presión de aspiración.
(DA*TF)ik = Efecto de la interacción del diámetro de la aguja por el tamaño del folículo
(PA*TF)jk = Efecto de la interacción de la presión de aspiración por el tamaño del folículo.
(DA*PA*TF)ijk = Efecto de la interacción del diámetro de la aguja por la presión de aspiración por el tamaño del folículo.
Eijk= Efecto del error.

 

Resultados y Discusión

La primera parte de nuestro estudio consistió en evaluar la tasa de recuperación de ovocitos obtenidos por tratamiento, tal como se puede observar en el cuadro 4.

En este cuadro se evidenció que las tasas de recuperación parecen ser mejores cuando se aspiran folículos pequeños y de mediano tamaño (Ø de 2 -5 mm y 6-10 mm respectivamente). Esto coincide con los resultados expuestos por Pieterse et al. (1991), donde puncionaron folículos con un Ø > 3 mm, en diferentes momentos del estro y obtuvieron tasas de recuperación consistentes a lo largo del ciclo y un promedio general de 55%, con una tendencia a lograr tasas de recuperación más altas al puncionar folículos más pequeños 72 % (Ø <5 mm). Goodhand et al. (1999), publicaron una mejor recuperación cuando se puncionaron ovarios que presentaban una mayor población de folículos pequeños (Ø ≤6mm).

Resultados similares fueron descritos por Seneda et al. (2001), comparando folículos <4mm y >4mm, donde se demostró que la tasa de recuperación es significativamente más alta para los folículos de menor diámetro. No obstante, en nuestro estudio, cuando la presión de aspiración fue baja (50 mmHg), la tasa de recuperación tiende a reducirse incluso al puncionar folículos pequeños. De igual forma se apreció una tendencia matemática a obtener mejores tasas de recuperación, cuando la presión de aspiración empleada fue mayor (80 mmHg), pero esta se reduce cuando los folículos aspirados son de un diámetro mayor (Ø >10mm). Por otra parte, cuando se analiza la influencia del diámetro de la aguja sobre la tasa de recuperación independientemente de la presión de aspiración, encontramos que al emplear agujas con diámetro 18 G, la tasa de recuperación parece ser mayor; excepto cuando los folículos aspirados son mayores a 10 mm Ø, donde pareciera ser que la aguja de menor diámetro (20 G), logra mejores resultados y más aún cuando se incrementa la presión de aspiración de 50 a 80 mmHg.

Nuestros resultados fueron similares a un estudio realizado por Bols et al. (1996b), donde se compararon tres diámetros de aguja (18G, 19G y 21G) y cinco presiones de aspiración (50 mmHg, 70 mmHg, 90 mmHg, 110 mmHg y 130 mmHg), quienes obtuvieron las mayores tasas de recolección con las agujas de mayor diámetro (18G), independientemente de la presión de aspiración utilizada. Mientras que para los diferentes tipos de agujas, las mayores tasas de recuperación se alcanzaron al aplicar las presiones más altas de aspiración. Al observar los datos del porcentaje de calidad de ovocitos, clasificados como aptos o no aptos para fertilización in vitro, no se encontraron diferencias estadísticas significativas, lo cual a nuestro criterio, estuvo influenciado por el hecho de que no se encontró una distribución normal de los datos analizados, de manera que se procedió a la transformación logarítmica en base 10, para obtener la distribución normal y así aplicar el diseño experimental planteado, Sin embargo, estos datos no corresponden al comportamiento biológico observado, ya que este cuadro se realizó con la finalidad de mostrar las diferencias significativas entre tratamiento, todo lo que se hace es comprimir los valores altos y expandir los pequeños obteniendo así una distribución normal de los datos. Por tal motivo solamente nos remitimos a expresar cuales tratamientos diferían entre sí, donde luego de realizar este procedimiento obtuvimos los resultados que se presentan en el cuadro 5.

Como se puede apreciar, los tratamientos: T3, T9, T6, T12, T11, T10, T2, T5 y T8 no presentaron diferencias estadísticas significativas entre sí (P>0.05), al igual que los tratamientos T4, T1 y T7. Mientras que, solo los tratamientos T3, T9 y T6, difirieron con los tratamientos T1 y T7, y el T3 y T9 con el T4 . Lo cual sugiere que el diámetro del folículo es la causal de esta diferencia, donde todo parece indicar que los folículos pequeños (<5mm Ø) y medianos (6 a 10mm Ø), aportan un porcentaje de ovocitos aptos para FIV superior a los de mayor tamaño (>10mm Ø), (LOS MEDIOANOS SON LOS MEJORES) en tanto que ni el diámetro de la aguja, ni la presión de aspiración parecen tener mayor influencia cuando los ovocitos son clasificados solamente en aptos y no aptos para FIV.

Gardon (1999), encontró que en un estudio realizado con ovarios de matadero, donde se aspiró folículos entre 1 y 6 mm Ø, empleando agujas de 18G; sobre un total de 3,180 ovarios recolectados, obtuvo 18,524 ovocitos de los cuales 5,305 (28.49%), fueron clasificados como aptos y 13,219 (71.50%), como no aptos para ser madurados in vitro. Siendo estos resultados inferiores a los nuestros (52.61 y 71.80% ovocitos aptos para FIV), cuando empleamos agujas de 18G en folículos de pequeño y mediano tamaño. Por su parte Solís et al. (2012), en un estudio in vivo, donde se empleó frecuencias de aspiración una y dos veces a la semana, de folículos entre 3 y 9 mm, utilizando agujas 18 G y presión entre 50 y 65 mmHg, encontraron un porcentaje de ovocitos aptos para FIV entre 86.00 y 88.00%; los cuales fueron resultados superiores a los alcanzados en este estudio.

El número de folículos aspirados y el total de ovocitos colectados por tratamiento, fueron tabulados, al mismo tiempo que se determinó el promedio de ovocitos obtenidos de acuerdo a los grados de calidad. No obstante, en vista de que el número de folículos aspirados fue diferente entre tratamientos; para poder efectuar los estudios estadísticos correspondientes, fue necesario realizar un análisis porcentual de cada tratamiento como se muestra en el cuadro 6.

Al igual que en el caso de la calidad de ovocitos aptos y no aptos para FIV, para estudiar los grados de calidad de ovocitos (grado 1, 2, 3, y 4), también fue necesario realizar una transformación logarítmica en base 10 para obtener una distribución normal de los datos y así aplicar el diseño experimental planteado, como se muestra en el cuadro 7.

Al analizar los grados de calidad de ovocitos encontramos que en los grado 1 prácticamente no se apreciaron diferencias entre tratamientos, excepto en el tratamiento 9 y el tratamiento 11, que si difirieron entre sí (P<0.05). Lo que a nuestro criterio se pudo deber, al mayor tamaño del los folículos en el tratamiento 9 (Ø > 10 mm), en el cual se colectaron un gran número de ovocitos degenerados (40.00%), al igual que los tratamientos T3, T6 y T12, en los que también se aspiración folículos >10 mm Ø. 

En el caso de los ovocitos con calidad grado 2, al igual que en el de los ovocitos de grado 1, se apreció una disminución del número de ovocitos, en los tratamientos donde se aspiraron folículos >10 mm Ø (T6, T9, T12), a excepción del T3, el cual mostró un porcentaje superior (35.71%) de ovocitos grado 2, lo cual pudo deberse en principio, al calibre de aguja (18G) y a la baja presión de aspiración (50 mmHg), que permitió la obtención de ovocitos con mayor número de capas de células del cúmulo y por ende mayor calidad, lo que discrepa con Bols et al. (1996), quienes encontraron que agujas con menor diámetro se relacionan con mayor proporción de COCs con cumulo compacto, y al mismo tiempo concuerda, ya que también  indicaron en este mismo estudio que a una baja presión de aspiración, la mayoría de ovocitos recuperados estaban rodeados de un cumulo compacto, a lo que Lenz et al. (1987), encontraron que un aumento gradual en la presión de aspiración provoca ovocitos morfológicamente anormales.

Para los ovocitos de grado 3, todo parece indicar que la mayor proporción de estos se obtiene cuando se aspiran folículos de pequeño (Ø <5 mm) y mediano tamaño (Ø entre 6 a 10 mm), como es el caso de los tratamientos T10, T8, T2 y T7, T11 y T1, que mostraron valores de 53.83, 50.52, 36.98, 34.97, 29.72 y 24.73% respectivamente. 

Como se aprecia en el cuadro 7, en el caso de los ovocitos desnudos, los tratamientos en los que se aspiraron folículos más grandes (tratamientos T3, T6, T9 y T12), se evidenció menor proporción de estos (0.00, 0.00, 0.00 y 8.33% respectivamente), lo cual consideramos estuvo influenciado por la proporción de folículos degenerados que presentaron estos tratamiento. Seguidamente los folículos de mediano tamaño (T2, T5, T8, y T11, con valores 14.90, 21.94, 10.57 y 20.63% respectivamente) y finalmente los tratamientos en los que se aspiraban folículos pequeños (tratamientos T1, T4, T7, T10 y con valores de 28.32, 36.96, 32.56 y 18.22% respectivamente).

Estos resultados sugieren tomar en cuenta la opinión de Seneda (1999), quien indica que los folículos más chicos son sometidos a una mayor presión intra folicular al momento de la aspiración dando como resultado una mejor tasa de recuperación a lo que nosotros consideramos este mismo fenómeno también podría traer como consecuencia un mayor número de ovocitos de grado 3 y desnudos cuando se aspiran folículos de menor tamaño. 

Cuando se analizaron el porcentaje de ovocitos degenerados, se apreció una mayor proporción de estos en los tratamientos en los que se aspiraban folículos mayores a 10 mm Ø (tratamientos T6, T9, T12, y T3, con valores de 60.00, 50.00, 41.57 y 40.00% respectivamente), en tanto que la menor proporción de estos se mostró cuando se aspiraron folículos de pequeño y mediano tamaño, lo que a nuestro criterio guarda relación con la teoría de las ondas foliculares, donde los folículos de mayor tamaño pudieran haber entrado en un proceso de atresia folicular, caracterizada como menciona Viana et al. (2004), por alteraciones estructurares y funcionales incluyendo apoptosis de las células de la granulosa, con retracción celular, perdida de la cohesión y expansión del cumulo.

Grafica 1. Porcentaje de calidad de ovocitos por tratamiento

Como se muestra en el gráfico uno, en la gran mayoría de los tratamientos se obtuvo un gran porcentaje de ovocitos grado 3, seguido de los degenerados, grado 2, desnudo y grado 1. En coincidencia con esta investigación; Solís et al. (2012), encontraron una tendencia estadística a obtener mayor calidad de ovocitos grado 3. Barcelar et al. (2010), utilizaron una escala de clasificación en su estudio muy similar a la nuestra y encontraron mayor cantidad de ovocitos de grado 3, seguido de los de categoría 2 y finalmente categoría 4 y 1, resultados comparables a los obtenidos en esta investigación.


Conclusiones

El diámetro de la aguja influye en la tasa de recuperación de los ovocitos, ofreciendo las agujas 18G, los mejores resultados cuando se aspiran folículos de pequeño (Ø<5mm) y mediano (Ø >5mm) tamaño, y las de 20G cuando se aspiran folículos de tamaño grande (Ø>10mm). El diámetro de la aguja no parece tener mayor influencia en los parámetros de calidad cuando los folículos son clasificados como aptos y no aptos para FIV, sin embargo, parece ser que el empleo de agujas 18G permite obtener ovocitos de mejor calidad cuando los folículos aspirados son de tamaño grande (Ø>10mm).

Cuando la presión de aspiración empleada es alta (80 mmHg), las tasas de recuperación de ovocitos son mejores.

La presión de aspiración parece no tener mayor influencia sobre la calidad de los ovocitos, cuando estos son clasificados como aptos y no aptos para FIV, sin embargo, pareciera ser que puede afectar positivamente en la recuperación de ovocitos grado 2, cuando se emplea una baja presión (50 mmHg). 

Cuando se aspiraron folículos entre pequeño y mediano tamaño (Ø de 2 -5 mm y 6-10 mm respectivamente), las tasas de recuperación son mejores Los folículos de pequeño y mediano tamaño (Ø de 2 -5 mm y 6-10 mm respectivamente), aportan un porcentaje de ovocitos aptos para FIV (grado 1, 2, 3) superior a los de mayor tamaño (>10mm Ø), con una tendencia a una mayor proporción de ovocitos grado 3. Los folículos grandes presentan la menor proporción de ovocitos desnudos y la mayor proporción de ovocitos degenerados.

Es posible realizar distintas combinaciones de diámetro de aguja y presión de aspiración en función del tamaño de los folículos, a fin de lograr una interacción que permita la obtención de mejores resultados, tanto en la tasa de recuperación como en la calidad de los ovocitos colectados.

 

Referencias

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