Huevos contaminados

Ante la problemática de la presencia de Salmonella sp. en los huevos y la importancia en la salud pública, es necesario implementar medidas de control eficaces, destinadas a garantizar la seguridad de los alimentos para el consumo humano (Berchiere, 2000). En este contexto, destacamos la importancia de buscar nuevas tecnologías que tengan rapidez en los resultados, alta sensibilidad y bajo costo para la detección de esta bacteria.
La Reacción de Cadena de Polimerasa-PCR, parece ser una estrategia útil para la detección de bacterias del género Salmonella en diferentes sustratos como carnes, sangre, leche y huevos. Para el uso de la técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa es esencial la obtención de ADN de buena calidad para así conseguir buenos resultados en las pruebas, donde los excesos de estructuras celulares y proteínas pueden inhibir el proceso de amplificación. Las extracciones de ADN deben proporcionar una buena estandarización en las bandas, con cantidad y calidad suficiente para no causar interferencia en los patrones de migración de geles de electroforesis.
Eso indica que nuevos protocolos aun necesitan ser probados para diferentes sustratos, con el objetivo de desarrollar nuevas tecnologías e incluso mejorar los ya existentes. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia de tres métodos para la extracción de ADN de Salmonella sp. en huevos de gallinas libres de patógenos específicos (SPF).

Las muestras de Salmonella sp y Escherichia coli fueron liofilizadas en el laboratorio de Estudio de Sanidad Avícola de la Universidade Federal de Viçosa. Estas bacterias fueron activadas en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) a 37ºC por 18 horas.
Se utilizaron 75 huevos blancos de gallinas libres de patógenos específicos (SPF), los cuales fueron divididos en 5 grupos con 15 huevos cada uno. Los huevos fueron inoculados en la cavidad alantoidea: Inicialmente cada huevo fue desinfectado con una solución de tintura de yodo al 10% en el sitio de la perforación de la cascara, luego los huevos fueron perforados en la cámara de aire con ayuda de una aguja de acero inoxidable adaptada a una goma de calibre 30 x 12 mm. Se inocularon los huevos con una jeringa de tuberculina de 1mL, 0,1mL. Los huevos fueron inoculados con cultivos bacterianos, tres grupos de esos fueron inoculados con Salmonella sp. a una concentración de 10⁵ UFC/ml, otro grupo fue inoculado con una cepa de E. coli en la misma concentración que los anteriores y los huevos del grupo control fueron sometidos a los mismos procedimientos empleando solución salina a 0,85%, taponada y esterilizada. Para hacer la inoculación se utilizo una aguja de calibre 12,7 X 0,33 mm que fue introducida en la cámara de aire colocado el contenido en la cavidad alantoidea, en un ángulo aproximado de 30°. Después de la inoculación los orificios fueron sellados con pegamento y los huevos transferidos a bandejas donde permanecieron por 24 horas a temperatura ambiente.
Después de este tiempo las yemas de cada grupo fueron recogidas asépticamente y colocadas en un beaker estéril y homogenizados. Luego se trasladaron 10 ml del homogenizado de yema a los tubos de centrifuga. Se centrifugaron 2.500 x g a temperatura ambiente. El sobrenadante fue descartado, y los sedimentos fueron resuspendidos en igual volumen con PBS pH 7,2. y centrifugados nuevamente eliminado el sobrenadante. El sedimento obtenido de cada grupo fue almacenado a -20°C, hasta la extracción de ADN.
La extracción de ADN bacteriano con el kit comercial- GenElute Bacterial Genomic ADN (Zigma^®) se realizó según las instrucciones del fabricante. El ADN obtenido fue cuantificado y analizado en gel de agarosa (1%); el mismo fue teñido con bromuro de etidio y visualizado con luz ultravioleta.
Los dos otros protocolos que utilizaron partículas de sílice con DNAzol o NaI fueron basados en el trabajo de Boom et al. (1990).
A las muestras se le adicionaron 600 µL de NaI (o Dnazol), se calentaron a 55°C y agitadas suavemente por cinco minutos. El material obtenido fue centrifugado por 5 minutos a 12.000 x g a temperatura ambiente y el sobrenadante fue colectado con ayuda de una pipeta. A continuación se le agrego a la mezcla 50 μl de suspensión de sílice (dióxido de silício- Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) y fue homogenizada con un vórtex. La mezcla fue incubada en un agitador end-over-end (Speci-Mix, Thermolyne) por 10 minutos a temperatura ambiente, después se centrifugó por 30 segundos a 12.000 x g a temperatura ambiente, se desecho el sobrenadante por inversión del tubo. El sedimento fue enjuagado dos veces con 1 mL de tampón de lavado (50%, 50mM Tris-HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8). Después de la centrifugación por 30 segundos a 14.000 x g a temperatura ambiente, todo el tampón de lavado fue removido con una pipeta.
Luego se adiciono 1 mL de acetona y fue homogenizado en el vórtex y centrifugado por 30 segundos a 14.000 x g a temperatura ambiente. El sobrenadante fue descartado y el residuo de acetona se evaporo del sedimento por el tubo con tapa abierta a una temperatura de 56°C durante 10 minutos. El ADN adherido al sílice fue eluido por adicción de 50 μl de TE (5 mM TRIS-HCl pH 8, 0,5 mM EDTA pH 8), incubado a 50°C por 5 minutos y centrifugado por 30 minutos a 14.000 x g a temperatura ambiente para solidificar el sedimento. El sobrenadante fue retirado con una pipeta, las muestras de ADN fueron extraídas analizadas y cuantificadas por lectura en espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), que estima la cantidad de ADN de la muestra en μg/ μl y la cantidad del material por el valor obtenido en la razón DO260nm/ DO280nM.
Con las alícuotas de cada muestra de ADN, obtenidas a partir de los dos protocolos de extracción, se realizaron las reacciones de amplificación, con un volumen final de 50 µL que contenía: 2µL de DNA, 5 µl de tampón 10X ( 200mM Tris-HCl, pH 8, 500mM KCL- Invitrogen^®) 1,0 µL de DNTP a 10mM ( Datp, dTTP, Dctp, Dgtp - Invitrogem), 1,5 µL de MgCl2 a 50 mM, 1µL de cada primer a 25 pmol , 0,3µL Taq polimerasa a 1U/µL y agua ultra pura q.s.p.

El par de primers para la amplificación de el DNA fue sintetizado con base en la secuencia: 5' GTA AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA 3' (primer 1) e 5' TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 3' (primer 2), para amplificar un fragmento de 284 pares de base del gen invA de Salmonella sp. La reacción PCR fue realizada con todas las muestras de las extracciones en termociclador. Las condiciones de amplificación fueron de un ciclo inicial de desnaturalización a 94°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, calentado a 60°C durante 30 segundos y luego se aumento la temperatura a 72°C por 30segundos, y por ultimo, se aumento la temperatura a 72°C durante 7 minutos. La detección de los productos de PCR se realizó por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como marcador de peso molecular se utilizó un ADN ladder de 100pb (GibcoBRL). La visualización fue realizada mediante un transiluminador UV.

A pesar de haber sido posible la extracción de DNA bacteriano a través de los protocolos en los que se utilizaron las partículas de sílice junto al reactivo DNAzol o NaI, estas reacciones no fueron las deseadas. Las muestras presentaron valores inferiores de 1,8, lo que indica contaminación del ADN por proteínas. Por ello, es necesario ajustes en el protocolo de extracción.
En cuanto al kit comercial - GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Zigma^®), no fue posible visualizar la amplificación de ADN en las muestras extraídas. Sin embargo, fue posible visualizar la amplificación de todas las muestras obtenidas en los tres protocolos por PCR. Fueron utilizados los primers derivados de el gen invA, obteniendo una banda de amplificación de ADN con 284 pares de bases como lo esperado en todas las muestras de Salmonella sp., no siendo observada ninguna amplificación de ADN de E. coli. Con esto podemos afirmar que el gen invA Salmonella sp. contiene secuencias únicas y demostró que este gen es un objetivo adecuado para PCR, con posibles aplicaciones diagnósticos de Salmonella sp.
El mejor resultado se obtuvo cuando el ADN fue extraído por medio de partículas de sílice con NaI, por la presencia de bandas mas intensas de ADN, indicando mayor representación de material genético (Fig. 1). Por lo tanto, la extracción de ADN por este método puede ser utilizado de manera segura en las pruebas de PCR, reduciendo así los costos de la técnica, principalmente en lo que se refiere a la adquisición de kits de extracción de ADN.
Rahn et al., (1992), usando un par de oligonucleotidos del gen invA, lograron detectar 626 cepas de Salmonella en 630 pruebas, a partir de una colonia aislada e incorporada directamente en el PCR. Ellos obtuvieron una sensibilidad del 99,4% y una especificidad del 100%, pues no observaron una reacción positiva en ningún control negativo pertenecientes a otras 33 enterobacterias evaluadas.
Según Rohland & Hofreiter (2007), el método de extracción utilizando partículas de sílice tiene algunas ventajas sobre otros protocolos, ya que es rápido y fácil, pudiendo utilizarse pequeñas cantidades de la muestra. Además, es muy fácil de implementar, ya que emplea un equipo estándar de laboratorio y pocos productos químicos. Por otro lado, posee eficiente remoción de inhibidores para PCR.

Figura 1. Patrón electroforético de los productos amplificados por PCR de ADN de Salmonella sp, extraídos por los métodos de partículas de sílica con DNAzol^® y NaI

M: marcador de peso molecular de 100pb ; EC: muesstra de E. coli; SO,S1,S2,S3 muestras de Salmonella sp; C+: control positivo de un cultivo de Salmonella sp; DNAzol DD: control negativo; B: Blanco.

El protocolo que utiliza las partículas de sílice permite la extracción y la obtención de ADN genómico de Salmonella sp de buena calidad, integridad y adecuado para la amplificación.

Berchiere Junior A. 2000. Salmoneloses aviárias. pp. 185-195. In: Doenças das Aves. Berchiere Junior A, Macari M (ed.). FACTA, Campinas, Brasil.

Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen PM, Wertheim PME, Noordaa JVD. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503.

Rohland N & Hofreiter M. 2007. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nature Protocols 2:1756-1762.

Rhan k, De Grandis SA, Clarke RC, McEwe SA, Galán JE, Ginocchio C, Curtis R, Gyles CL. 1992. Amplification of invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cel. Probes 6:271-279.