Salmonella enteritidis

La paratifosis en animales de granja es un problema mundial importante, no sólo por las pérdidas económicas directas causadas por mortandad de aves jóvenes, la cual varía según la serovariedad involucrada y el estado sanitario e inmunidad maternal de las aves, sino principalmente por ocasionar una disminución de la ganancia de peso y un aumento de los costos sanitarios y de prevención. Por otro lado, las heces de los animales infectados provocan una amplia diseminación de la bacteria debido a la contaminación de suelos, agua, plantas, implementos e instalaciones pecuarias, etc (Suárez & Mantilla, 2000).

Algunas aves pueden presentar la enfermedad de forma asintomática, lo que contribuye a la transmisión al hombre mediante el procesamiento de aves portadoras aparentemente sanas para la elaboración de alimentos de origen avícola que resultan así contaminados en forma directa o indirecta en las plantas de faena (Sandoval et al., 1989; Guard-Petter, 2001; Cogan & Humphrey, 2003; Terzolo, 2006). La globalización, la apertura económica y el crecimiento de la industria avícola han incrementado el consumo y distribución del pollo, huevos y sus subproductos, y por lo tanto también ha aumentado el riesgo de transmisión de la Salmonelosis producida por S. Enteritidis (SE), por lo que el control de esta zoonosis adquiere cada vez mayor importancia (Suárez & Mantilla, 2000; SAGPyA, 2009).

En los últimos años, la utilización de antimicrobianos y vacunas inactivadas y atenuadas para limitar o prevenir las infecciones con Salmonella spp. en medicina veterinaria ha sido cuestionada debido al desarrollo de resistencia bacteriana a los antibióticos, como así también a los riesgos potenciales de los residuos de los antibióticos y de los adyuvantes de las vacunas en productos alimenticios derivados de animales para el consumo humano (Kramer et al., 2001, Hasenstein et al., 2006). Debido a ello se ha restringido gradualmente su uso y se han explorado otras herramientas para el control de esta enfermedades, tales como la exclusión competitiva administrando prebiótios y probióticos (Edens et al., 1997; Rahimi et al., 2007). Una herramienta complementaria para la prevención de enfermedades de las aves y la generación de productos y subproductos alimenticios con mayor seguridad microbiológica es la Tecnología IgY. Esta biotecnología se basa en la utilización de inmunoglobulinas de yema de huevo (IgY) que pueden producirse mediante la inmunización de gallinas con diferentes antígenos (Chacana et al., 2004).

Se han realizado distintos ensayos relacionando las IgY con Salmonella. Por ejemplo, se demostró que las IgY podrían ser utilizadas para tipificación de las distintas serovariedades del microorganismo (Terzolo et al., 1998), así como también se ha evaluado la potencialidad de IgY específicas para el control de las salmonelosis en las aves. Lee et al. (2002) realizaron un estudio de reacciones cruzadas entre IgY producida contra SE y Salmonella Typhimurium (ST). Luego de hiperinmunizar a diferentes gallinas con ambas bacterias inactivadas, estos investigadores elaboraron huevo en polvo hiperinmune mediante liofilización de la fracción hidrosoluble de la yema del huevo. Mediante pruebas de ELISA específicas para ambas serovariedades, se demostró que los anticuerpos producidos contra SE presentaban reacción cruzada contra ST en un 55,3% y, en forma inversa, las IgY producidas contra ST reaccionaban contra SE en un 42,4%. Además, los autores demostraron que la incubación de SE y ST junto con los anticuerpos disminuyó significativamente el desarrollo de estos microorganismos en medios de cultivo líquidos.

Estos resultados indican la necesidad de evaluar la capacidad protectora de las IgY específicas en ensayos de laboratorio y de infección experimental en aves, utilizando productos que contengan inmunoglobulinas específicas y que puedan ser fácilmente escalables para la elaboración industrial de aditivos y suplementos nutricionales. Por ello, el objetivo de este trabajo fue la evaluación del efecto de la administración de huevo en polvo de gallinas hiperinmunizadas contra SE sobre la excreción de la bacteria en un modelo de infección experimental en pollitos BB.

Materiales & Métodos

Huevo en polvo
Se utilizó huevo en polvo completo (yema y clara), elaborado a partir de huevos de gallinas hiperinmunizadas (huevo en polvo hiperinmune) con una bacterina contra la cepa regional SE INTA 86/360 fagotipo 4 (Sandoval et al.,1989) . Además, se utilizó huevo en polvo elaborado a partir de huevos de gallinas no hiperinmunizadas (huevo en polvo control). El título de anticuerpos aglutinantes anti-SE del huevo en polvo se determinó mediante microaglutinación en placa de 96 pocillos con fondo en U. Se realizaron diluciones seriadas en base log₂ tanto del huevo en polvo hiperinmune como del huevo en polvo control.

Preparación de alimento adicionado con huevo en polvo
Se preparó alimento adicionado con 10% (p/p) de huevo en polvo hiperinmune ó 10% (p/p) de huevo en polvo control. El alimento fue mezclado con el huevo en polvo para asegurar su correcta homogenización.

Desafío experimental de pollitos BB
Cepa utilizada. Para llevar a cabo el modelo de infección experimental, se utilizó la cepa de SE INTA 1222 que fue aislada a partir de un caso de paratifosis aviar.

Aves. Se utilizaron 56 pollitos de engorde de un día de vida (línea Cobb-Vantress 508) provistos por la empresa Toledo S.A., Mar del Plata, Provincia de Buenos Aires. Estas aves provenían de reproductores pesados de 28 semanas de edad. Los pollitos se alojaron en la sala de desafíos del bioterio de aves de la EEA Balcarce, INTA. Al arribar se realizó un muestreo de meconio de todas las aves para verificar ausencia de Salmonella spp. Durante todo el período de experimentación, los pollitos recibieron agua y alimento ad libitum. Las aves se alimentaron con un alimento balanceado comercial libre de Salmonella, elaborado sin productos de origen animal y libre de aflatoxinas (Tapia, 1985). La ausencia de Salmonella spp. en el agua de bebida y en el alimento se verificó mediante cultivos de enriquecimiento selectivo para Salmonella spp en caldo tetrationato adicionado con verde brillante 0,1 % v/v y caldo lactosado, respectivamente. Para los subcultivos se utilizaron placas de agar xilosa-lisina-desoxicolato con el agregado de tergitol 4 al 0,46% v/v (XLDT).

Tratamientos
Los pollitos BB se dividieron en tres grupos de 20 pollitos cada uno. A partir del primer día de vida y durante 14 días los pollitos se alimentaron con: 1) alimento convencional; 2) alimento suplementado con 10 % p/p de huevo en polvo hiperinmune;3) alimento suplementado con huevo en polvo control. Todas las aves se sacrificaron mediante dislocación cervical de la articulación occípitoatloidea a los 15 días de vida.

Infección experimental
A los 5 días de vida los pollitos de cada grupo se desafiaron individualmente con 10⁵ UFC/ave de SE INTA 1222 fagotipo 4, utilizando una sonda por vía ingluvial.

Toma de muestras
Se tomaron muestras mediante hisopado cloacal de todos los pollitos de los grupos experimentales al 3° y 6° día post infección (PI). Cada una de las muestras se incubó en caldo tetrationado durante 48 hs a 37ºC. Luego se tomó una alícuota de cada uno de los caldos y se sembró sobre placas de agar XLDT. Las placas se incubaron durante 24hs a 37ºC. Finalmente se observó la presencia de colonias con características típicas de Salmonella, cuya identificación primaria fue corroborada mediante la prueba bioquímica del metabolismo de urea para diferenciarlas de otros posibles microorganismos con características macroscópicas similares a Salmonella. La diferencia porcentual en la proporción de pollitos infectados entre los diferentes grupos experimentales fue analizada estadísticamente mediante una prueba de contingencia de Chi-cuadrado. Valores de P menores a 0,05 se consideraron significativos.

Título de anticuerpos anti-SE en el huevo en polvo. El título de anticuerpos anti-SE determinado según microaglutinación en el huevo en polvo hiperinmune fue 1:640, mientras que el huevo en polvo control presentó títulos menores a 1:10. Por lo tanto, las aves alimentadas con alimento adicionado con huevo en polvo hiperinmune recibieron un nivel de anticuerpos específicos 64 veces mayor que las alimentadas utilizando como aditivo huevo en polvo control.
Excreción de SE. Al 3° día PI no se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos de aves y, los porcentajes de aislamiento de SE a partir de los hisopados cloacales en el grupo adicionado con huevo en polvo control y en el que recibió alimento sin adición de huevo en polvo, ambos fueron muy bajos. La Salmonella inoculada pudo ser re-aislada sólo de algunas de las aves examinadas en estos grupos. Por el contrario, en el grupo de pollitos tratados con alimento adicionado con huevo en polvo hiperinmune no se aisló la bacteria en ninguna de las aves (Tabla 1). Las bajas tasas de excreción de SE en los grupos no tratados durante el 3er día PI son las esperadas según el modelo de infección utilizado. Al 6° día PI la administración de alimento adicionado con huevo en polvo hiperinmune logró disminuir un 30% la excreción de SE con respecto a las aves que sólo recibieron alimento convencional. Esta disminución significativa se debió a la presencia de anticuerpos IgY anti-SE en el huevo en polvo hiperinmune.

Tabla 1. Número de aislamientos (Positivos/Total) de SE 1222 en los días 3 y 6 post-infección a partir de hisopados cloacales de grupos de pollos alimentados con alimento convencional, alimento adicionado con 10% p/p de huevo en polvo control ó alimento adicionado con 10% p/p de huevo en polvo hiperinmune.

La excreción de SE en las aves que recibieron alimento adicionado con huevo en polvo control fue sólo un 6% menor respecto a la excreción en el grupo de aves alimentadas sólo con alimento convencional. El bajo título de IgY anti-SE presente en el alimento adicionado con huevo en polvo control (1:10) no sería suficiente para lograr una disminución significativa de la excreción de SE. Para que la excreción de SE disminuya de forma significativa, el alimento balanceado que consuman las aves debe ser adicionado con huevo en polvo con alto título de IgY anti-SE, como se pudo comprobar mediante la utilización de huevo en polvo hiperinmune.