INTRODUCCIÓN
Un probiótico se define como “un microorganismo vivo que ingerido en cantidades adecuadas confiere un beneficio al huésped”. Dentro de este grupo, existen numerosos microorganismos, siendo las bacterias ácido lácticas (BAL) del género Lactobacillus las que se encuentran presentes en el tracto gastrointestinal (TGI) de los animales domésticos, incluidas las aves. Entre los beneficios se destacan su uso como promotores de crecimiento, la estimulación de la inmunidad, la producción de sustancias antimicrobianas y el mejoramiento de la homeostasis de la microbiota del TGI.
Las bacterias del género Lactobacillus se caracterizan por ser bacilos largos y extendidos o muy cortos (cocobacilos), inmóviles, Gram positivas, negativas a catalasa y nitrato. Sus colonias son de medianas a pequeñas, convexas, de bordes enteros, opacas y sin pigmentación. Sus requerimientos nutricionales son complejos incluyendo: carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y nucleótidos. Transforman la glucosa y otras hexosas en ácido láctico por homofermentación; o en ácido láctico y otros productos adicionales (ácido acético o dióxido de carbono) por heterofermentación. Estas bacterias crecen bajo condiciones microaerofílicas o anaeróbicas con una temperatura que oscila entre los 5 y 53 ºC y pueden multiplicarse en medios ligeramente ácidos.
Para que un microorganismo sea considerado probiótico debe cumplir ciertos requisitos como: resistir las condiciones gástricas, inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos, colonizar el intestino, ser inocuo para el animal y estable para su almacenamiento3. En el año 2006, la Unión Europea prohibió el uso de antibióticos en dosis subterapéuticas como promotores de crecimiento en animales de granja, aunque no todos los países del mundo han adoptado esta medida. La administración de dosis subterapéuticas ha generado el aumento de la resistencia a antimicrobianos cuando deben ser utilizados en forma terapéutica y una mayor incidencia de enfermedades en aves.
En Argentina, a partir del año 2019, el SENASA prohibió el uso de antibióticos en alimentos elaborados para animales, de acuerdo con las recomendaciones internacionales, mediante la resolución 1119/18. Por lo tanto, surge la necesidad de buscar nuevas herramientas para reemplazarlos y el uso de los probióticos es una de ellas. Jha y col.6 reportan que la utilización de los probióticos ha mejorado diferentes aspectos como: el rendimiento del crecimiento, la digestibilidad en el TGI, la histomorfología intestinal y la inmunidad mediante la modificación de la microbiota. Resultados similares han sido reportados en nuestro país por Blajman y col., así como también la actividad antibacteriana contra patógenos. Sin embargo, existe evidencia sobre el uso de probióticos importados o provenientes de distintas especies animales que han presentado una baja eficiencia en la producción avícola. Esto podría deberse a que una cepa aislada de una especie animal, no necesariamente coloniza el mismo sitio de otra especie. Por lo tanto, la especificidad de especie animal es un factor importante para determinar la colonización y la adhesión in vivo en el TGI de este tipo de microorganismos. Teniendo en cuenta lo mencionado, el objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus provenientes de intestino de pollos parrilleros del partido de Tandil y evaluar su capacidad probiótica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con el íleon obtenido en condiciones asépticas de 36 pollos línea Cobb 500® de diferentes edades (24 de 6 días y 12 de 53 días), provenientes de una granja del partido de Tandil, que habían sido anteriormente sacrificados para otro estudio. Posteriormente, se realizó un hisopado del interior de dicha porción del intestino y se colocó en 5 mL de caldo MRS (Britania®, Buenos Aires, Argentina). Se incubó a 37 ºC durante 48 h en condiciones de microaerofilia. Luego se tomó una alícuota del cultivo (1 mL) y se almacenó a -80 ºC con glicerol al 30 %.
Una ansada del cultivo congelado de las 36 muestras de pollos de distintas edades se sembró en una placa con agar MRS y se incubó de forma similar. Según la morfología se seleccionaron 12 colonias que presentaron bordes regulares, blancas, circulares, cremosas, convexas y translúcidas11,12. Posteriormente, se efectuó la caracterización fenotípica a cada una de las colonias seleccionadas mediante pruebas bioquímicas básicas, tinción de Gram, prueba de la catalasa, reducción de nitrato y capacidad fermentativa (Tabla 1).
Aquellas cepas que presentaron características fenotípicas correspondientes al género Lactobacillus, fueron seleccionadas para evaluar las capacidades probióticas: crecimiento a diferentes temperaturas, tolerancia a sales biliares, crecimiento a distintos pH y actividad antimicrobiana. Para ello, cada una de ellas se reactivó en 5 mL de caldo MRS incubado a 37ºC por 48 h en microaerofilia.
Crecimiento a diferentes temperaturas: una alícuota de 300 µL del cultivo reactivado se colocó en tubos con 3 mL de caldo MRS y se incubó a tres temperaturas diferentes (20 ºC, 37 ºC y 45 ºC) durante 24 h en condiciones de microaerofilia.
Tolerancia a sales biliares: se tomó una alícuota de 300 µL del cultivo y se colocó en tubos con 3 mL de caldo MRS con una concentración de sales biliares al 15 % (Nº 3 Britania®) e incubó a 37 ºC durante 24 h en condiciones de microaerofilia.
Crecimiento a distintos pH: se colocó una alícuota de 300 µL del cultivo reactivado de cada cepa en 3 mL de caldo MRS con HCl 1N ajustado a diferentes valores de pH: 1, 2, 4, 5 y 6,5. Se incubaron a 37 ºC durante 24 h en condiciones de microaerofilia.
Para determinar la viabilidad se realizó una siembra de cada cultivo en agar MRS e incubó durante 48 h a 37 ºC en condiciones de microaerofilia. Para determinar la turbidez se consideraron valores de DO menores a 1 (sin turbidez) y mayores a 1 (turbidez).
Actividad antimicrobiana: se realizó según la metodología descrita por Schillinger y Lucke. Cada cepa del género Lactobacillus se enfrentó con cultivos puros de las cepas Salmonella Enteritidis INTA 360 y de S. gallinarum biovar gallinarum INTA 91 aportadas por el Laboratorio de Bacteriología de INTA EEA Balcarce. Las cepas de Salmonella se suspendieron en solución salina con una turbidez de 1 de la escala de McFarland, fueron sembradas masivamente en agar Tripticasa de soya (TSA) y una vez solidificado se realizaron pocillos en el agar.
Las cepas de Lactobacillus se reactivaron en caldo MRS durante 48 h a 37 ºC en condiciones de microaerofilia. Una alícuota del cultivo bacteriano (CB), se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante libre de células (SLC). Posteriormente, se agregó una alícuota de 100 µL del CB y del SLC en un pocillo y las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 h en condiciones de aerobiosis. El ensayo se realizó por duplicado para cada cepa.
Caracterización genotípica: el aislamiento presuntivo de Lactobacillus fue identificado genéticamente mediante la técnica PCR monoplex para determinación del género Lactobacillus spp.15 y PCR multiplex para las especies L. casei, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. reuteri, L. plantarum y L. rhamnosus16. La extracción de ADN se realizó a partir de 1 mL de cultivo de cada aislamiento individual en caldo MRS a 37 °C durante 24 h. Luego, se utilizó el kit de extracción de ADN para bacterias Gram positivas (Wizard Genomic DNA Purification® Promega).
Tabla 1. Características fenotípicas y pruebas bioquímicas básicas de colonias aisladas a partir de muestras de íleon de pollos de distintas edades.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De cada muestra de íleon sembrada en agar MRS se observaron diferentes morfologías de colonias. En general, las colonias fueron blancas, circulares, cremosas, convexas y presentaron bordes regulares, aunque también se observó la presencia de algunas colonias translúcidas y solo una presentó bordes indefinidos. Al microscopio se observaron bacilos y cocobacilos. Todas fueron Gram positivas, catalasa negativas, nitrato negativas y homofermentativas (Tabla 1). Estos resultados son similares a los encontrados en otros trabajos 4,17, en los cuales se obtuvieron colonias con similares características en muestras de intestino de pollos.
Una vez realizada la caracterización fenotípica de todas las colonias analizadas, se seleccionaron cinco colonias (2, 3, 6, 9 y 12) que presentaron morfología característica del género Lactobacillus para evaluar las capacidades probióticas. Se observó que estas cinco colonias crecieron a 20 ºC y 37 ºC, mientras que solo la colonia Nº 6 demostró viabilidad a las tres temperaturas utilizadas en este ensayo (Tabla 2). Rondon y col.4 no obtuvieron crecimiento a 15 ºC, mientras que Lara Mantilla y Burgos Portacio13 observaron crecimiento a 43 ºC. Estos datos remarcan la importancia de que la temperatura es un factor que puede afectar la supervivencia de los microorganismos en futuros ensayos in vivo ya que la temperatura corporal normal de los pollos es de 40- 42 ºC.
El 80 % (4/5) de las cepas toleraron una concentración de sales biliares de 15 % en concordancia con otros trabajos en los cuales se obtuvieron colonias resistentes a la misma concentración de sales biliares (Tabla 2). Sin embargo, Wang y col.19 reportaron aislamientos resistentes a mayores concentraciones de sales biliares (30 y 50 %).
En cuanto al crecimiento a diferentes pH se observó que a pH 1 y pH 2 no hubo crecimiento en caldo ni en placa, excepto la colonia Nº 6 que presentó viabilidad a pH 2. Para verificar la muestra se realizó una coloración de Gram. En los pH 4, 5 y 6,5 se observó crecimiento de todas las cepas tanto en caldo como en placa, excepto la colonia Nº 9 que sólo creció a pH 5 en caldo y en placa (Tabla 3). Nuestros resultados coinciden con los de Gutiérrez Ramírez3, Rondon y col., Lara Mantilla y Burgos Portacio y Wang y col. quienes obtuvieron cepas que presentaron tolerancia a pH ácidos. Este dato es importante ya que le permitiría sobrevivir a las condiciones gástricas así como también garantizar la llegada en mayor número a los sitios de colonización8. Wang y col. también reportaron que a pH 4,0–6,0 el crecimiento de todos los aislamientos no se vio afectado; sin embargo, el crecimiento disminuyó significativamente cuando el pH fue menor a 4.
La colonia Nº 6 fue seleccionada como candidata para realizar la prueba de actividad antimicrobiana y caracterización genotípica, ya que fue la única que presentó tolerancia a diferentes temperaturas, concentraciones de sales biliares y ácidas in vitro. En consecuencia, esta cepa presentó actividad antagónica contra Salmonella Enteritidis y S. gallinarum biovar gallinarum tanto el CB como el SLC. Los halos de inhibición del CB fueron de 16 mm para las dos serovariedades de Salmonella, mientras que en el caso de los SLC se observaron halos de 18 mm en ambos casos. Estos datos coinciden con los reportados por Sánchez y Tromps20, quienes observaron que cepas de Lactobacillus aisladas de leche presentaron halos de inhibición similares para Salmonella Typhimurium. Si bien no se analizó el mecanismo de acción de la cepa contra las bacterias patógenas, podría estar relacionado con la producción de reuterina, que es un potente antimicrobiano.
Tabla 2. Crecimiento a diferentes temperaturas y en sales biliares 15 % de las colonias aisladas a partir de muestras de íleon de pollo.
S/T: sin turbidez; T: turbidez; S/C: sin crecimiento; C: crecimiento.Tabla 3. Crecimiento a distintos pH de las colonias aisladas a partir de muestras de íleon de pollo.
S/T: sin turbidez; T: turbidez; S/C: sin crecimiento; C: crecimiento.Mediante la prueba de PCR, la colonia Nº 6 fue caracterizada como Lactobacillus reuteri. Wang y col. y Greppi y col. reportan que esta especie es la más abundante en el tracto gastrointestinal de los pollos. Sin embargo, en el presente trabajo con pollos de diferentes edades y por ende de diferente maduración intestinal, solo se encontró una colonia que pudo ser identificada como L. reuteri.
El presente trabajo describe el aislamiento y la caracterización geno-fenotípica de una cepa de Lactobacillus reuteri con capacidad probiótica in vitro frente a condiciones gástricas simuladas como así también la actividad antimicrobiana contra Salmonella Enteritidis y S. gallinarum biovar gallinarum. Estos resultados tienen gran impacto y valor agregado porque aportan conocimientos en medicina veterinaria sobre el uso de una cepa probiótica como posible herramienta para el reemplazo del uso de antibióticos que se usan como promotores de crecimiento en la producción avícola, así como también para proteger la salud de las aves contra estas dos serovariedades de Salmonella. Sería necesario realizar estudios in vivo para evaluar la adherencia al intestino de la cepa, así como también la producción de reuterina, que es un potente sistema antimicrobiano.
Conflictos de interés
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
