Detección y cuantificación rápida del virus de anemia en pollos (CAV) por virometría de flujo

El virus de anemia en pollos (CAV) es un virus ADN de aproximadamente 25 nm de tamaño, causante de inmunosupresión en aves jóvenes y pérdidas económicas en la industria avícola. Su diagnóstico se basa comúnmente enPCR entiempo real, una técnica sensible pero incapaz de distinguir entre partículas virales infectivas y no infectivas. Como alternativa, la virometría de flujo, una técnica basada en citometría permite detectar y cuantificar partículas virales individuales de forma rápida mediante tinciones específicas.

El objetivo del presente estudio fue elaborar un protocolo de virometría de flujo para la detección y cuantificación eficiente del CAV. Para ello, el virus fue previamente concentrado y diluido en serie. Se evaluaron colorantes de ADN (SYTO9, YOYO M-1 y TO-TO-1) y se probó la marcación específica con anticuerpo anti-apoptina VP3 en distintas concentraciones. Los resultados mostraron que SYTOX permitió una tinción más efectiva en comparación con los otros colorantes. La marcación con anticuerpo presentó alta concordancia con los valores obtenidos mediante PCR en tiempo real, comprobando la especificidad del método.

Aunque el citómetro de flujo utilizado reporta un límite teórico de detección de 90 nm, el protocolo permitió identificar partículas virales de menor tamaño (25 nm), demostrando una sensibilidad superior. Además, el sistema de conteo volumétrico del equipo permitió expresar los resultados directamente como partículas por microlitro (partículas/μL). El procedimiento se completó en un lapso de 2 a 4 horas. Estos hallazgos respaldan la virometría de flujo como herramienta útil para el diagnóstico del CAV en laboratorios de producción y control de vacunas.

• Virus de la anemia aviar

• Perlas de control de calidad SpectroFlo® (Cytek Biosciences)

• Tinción SYTO Fisher Scientific, EE. UU.) 13,TOTO y YOYO (Thermo

• Anticuerpo primario anti-VP3 (Ab193612, Abcam)

• Anticuerpo secundario conjugado

Software:

• SpectroFlo®

Las muestras sin diluir presentaron baja resolución y señales aplanadas en el citómetro Northern Lights (Cytek®), atribuibles a agregación de partículas. El análisis de diluciones seriadas permitió identificar que la dilución 1:512 ofrecía la detección más estable, con delimitación clara de la población viral y reduccion del ruido de fondo (Figura 1).

Figura 1. Optimización de la dilución viral para la detección de partículas del virus de anemia aviar (CAV) mediante virometría de flujo.

La evaluación de YOYO-1, TOTO-1 y SYTOX Green mostró diferencias marcadas en sensibilidad. YOYO no generó señal detectable, TOTO-1-1 permitió detectar una baja densidad de eventos (2.13 × 10⁵ partículas/µL), mientras que SYTOX Green produjo una señal intensa, homogénea y reproducible (7.05 × 10 6 particulas /ul), con la mejor correlacion con qPCR y una alta relacion señal/ruido (Figura 2).

Figura 2. Comparación de colorantes fluorescentes para la detección de partículas de CAV.

El marcaje con Apoptina-FITC, dirigido al antígeno estructural VP3, permitió detectar partículas VP3⁺ entre 1.43 × 10⁶ y 2.83 × 10⁶ partículas/µL. Los controles negativos presentaron fluorescencia inespecífica mínima (7.2 × 10⁴–1.8 × 10⁵ partículas/µL), confirmando la especificidad del ensayo y la ausencia de marcaje cruzado (Figura 3).

Figura 3. Detección inmunológica del antígeno VP3 mediante Apoptina-FITC.

La cuantificación molecular del gen VP2 mediante qPCR mostró una carga viral de 2 × 10⁸ copias/µL, en concordancia con los recuentos obtenidos por virometría de flujo. En conjunto, SYTOX Green demostró ser el colorante más sensible para la cuantificación total, mientras que Apoptina-FITC aportó especificidad frente a VP3. La combinación de ambos permitió una detección rápida, reproducible y específica del CAV (Figura 4).

Figura 4. Comparación descriptiva entre la cuantificación por virometría de flujo y qPCR.

La virometría de flujo mostró ser una técnica rápida, sensible y reproducible para cuantificar el CAV, capaz de diferenciar partículas dentro de un rango de dilución óptimo y evitar la coincidencia de eventos en muestras concentradas.SYTOX Green presentó la mejor eficiencia y correlación con qPCR, atribuida a su afinidad por ácidos nucleicos de viriones intactos. El uso de Apoptina-FITC permitió confirmar la presencia del antígeno VP3, con mínima fluorescencia inespecífica, validando la especificidad del marcaje.La combinación de SYTOX Greeny Apoptina-FITC permitió distinguir partículas totales y completas, integrando detección genómica y estructural. Frente a la qPCR, la virometría ofrece resultados más rápidos, sin amplificación ni sobreestimación por fragmentos de ADN.

Se estableció un protocolo optimizado para la detección y cuantificación del virus de la anemia aviar (CAV) mediante virometría de flujo, empleando colorantes nucleicos y validación inmunológica con anticuerpos anti VP3. El uso de SYTOX Greenmostró la mejor correlación con los valores obtenidos por qPCR, confirmando su eficacia para estimar partículas virales totales.La virometría de flujo demostró ser una técnica sensible, rápida y reproducible, capaz de diferenciar partículas completas de vacías, constituyendo una alternativa sólida a los métodos moleculares tradicionales y una herramienta prometedora para el control de calidad en bioproductos y vacunas virales.