Métodos alternativos para el diagnóstico de Salmonella

Salmonella es uno de los principales agentes relacionado a las enfermedades transmitidas por alimentos en humanos en todo el mundo, causando una enterocolitis aguda que suele ser leve y autolimitada en la mayoría de las personas. La infección también puede presentarse como una enfermedad invasiva febril, en algunos casos con diarrea y náuseas (Stanaway et al., 2019). El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC) estima que aproximadamente 1,35 millones de infecciones y 420 muertes se reportan anualmente en los Estados Unidos por este agente (CDC, 2020). Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, pertenecientes al grupo de Salmonella no tifoidea, son responsables por la mayoría de las salmonelosis humanas. A nivel mundial, todas las Salmonelas no tifoideas son responsables por aproximadamente 93 millones de casos de gastroenteritis y 155.000 muertes anuales (Marchello et al., 2022).

La infección por Salmonella suele estar asociada a la ingestión de alimentos contaminados con la bacteria. Los alimentos de origen animal, en particular los productos de pollo y avicultura, en general, son la fuente de transmisión más común de Salmonella a los seres humanos (Sun et al., 2021). Por otro lado, La amplia variación de los serotipos de Salmonella, más de 2600 (Banerji et al., 2020) y la alta frecuencia de cambios en la epidemiología, debido a la adaptación de nuevos serotipos, poco frecuentes y resistentes a los antibióticos (He et al., 2024) han aumentado la conciencia entre los investigadores y el público consumidor, que exige cada vez más, alimentos seguros. En este escenario, el diagnóstico es una herramienta de extrema necesidad, conocer de forma precisa cuál es el agente etiológico, es decir, el serotipo relacionado con la infección o contaminación de los productos es una urgencia creciente en el mercado avícola (Shaji et al., 2023).

Tradicionalmente, el método más usado para el diagnóstico de Salmonella es la microbiología clásica (Stone et al., 1994); un ensayo basado en el aislamiento y posterior caracterización fenotípica de la bacteria (Soria and Bueno, 2016). Este método es la base de varias técnicas de detección en los análisis de seguridad alimentaria y laboratorios de salud pública a nivel mundial. En general, este método tradicional está diseñado en función de la capacidad de la bacteria para crecer en medios de agar diferenciales; por lo tanto, podemos identificar rápidamente su presencia calculando las colonias aisladas del agar (Lee et al., 2015). Sin embargo, los métodos basados en cultivos requieren mucho tiempo para interpretarse, desde la preparación del agar hasta la prueba de confirmación final. Las normas globales como ISO 6579-1:2017 describen que el cultivo de Salmonella requiere aproximadamente una semana. Además, debido a la presencia competitiva de Proteus y otras enterobacterias en las muestras, existe un riesgo considerable de resultados falsos positivos. Otra desventaja del método microbiológico de detección es la intensidad laboral de las técnicas de laboratorio que, al final del proceso entregan un resultado únicamente confirmatorio, o sea, la presencia o ausencia de Salmonella en la muestra. Es decir que aunque sean aisladas colonias de Salmonella, el método de microbiología es pobre en la identificación del serotipo (Yoshida et al., 2016).

De esta forma, posterior al método de aislamiento de las colonias se hace necesario el uso de la metodología de serotipificación por antisueros específicos de Salmonella. La serotipificación sigue siendo el primer paso para caracterizar los aislamientos, aunque no proporciona una tipificación discriminatoria suficiente para la investigación de brotes. El método tradicional para determinar un serotipo es un método fenotípico, basado en el esquema de Kauffmann-White. La primera publicación del esquema de Kauffmann-White (1934), enumeraba 44 serotipos, la última versión de 2007 contiene más de 2500 (Grimont, 2007).

La serotipificación consiste en la clasificación inmunológica de dos estructuras de superficie, el polisacárido O (antígeno O) y la proteína flagelina (antígeno H). Salmonella es la única entre las enterobacterias que comúnmente tiene dos antígenos H distintos, los antígenos flagelares de fase 1 y fase 2, que están regulados de manera coordinada de modo que sólo se expresa un antígeno flagelar a la vez (Bonifield and Hughes, 2003). En raras ocasiones, los aislamientos de Salmonella expresan antígenos flagelares adicionales. Algunos de estos antígenos adicionales han sido inestables, mientras que otros se comportan como antígenos flagelares típicos y pueden estar en grandes plásmidos (Smith and Selander, 1991).

El esquema de serotipificación de Kauffmann-White para la designación de serotipos reconoce 46 grupos O y 114 antígenos H que, en diversas combinaciones, conforman los 2.523 serotipos caracterizados (Grimont, 2007). Algunos antígenos H se componen de múltiples antígenos, denominados factores; por ejemplo, H: e,n,x es la designación de un antígeno flagelar que consta de tres factores separados, e, n y x, que se presentan juntos en un flagelo. Los 114 antígenos H se componen de combinaciones de 99 factores antigénicos distintos. Los antígenos flagelares que están inmunológicamente relacionados se conocen como complejos. Por ejemplo, el complejo G incluye todos los tipos de antígenos flagelares que contienen el factor antigénico g (McQuiston et al., 2004).

Así, la serotipificación por métodos tradicionales tiene varios inconvenientes. La complejidad del esquema de serotipificación requiere más de 250 sueros de tipificación diferentes, así como 350 antígenos diferentes para la preparación, además del control de calidad de los antisueros (McQuiston et al., 2004). Por lo tanto, no todos los laboratorios pueden llevar a cabo este método internamente y, a menudo, los laboratorios tienen que enviar los aislamientos a un laboratorio de referencia nacional, un laboratorio experto o un laboratorio comercial. Este proceso puede retrasar significativamente el tiempo de obtención de los resultados. En términos de rendimiento, el método puede dar reacciones falso positivo debido a una aglutinación débil o no específica. Además, la auto aglutinación o pérdida de expresión del antígeno, como se observa en los aislamientos rugosos e inmóviles, da lugar a serotipos no identificados (Wattiau et al., 2011).

Para evitar los problemas asociados con la microbiología y serotipificación tradicional, se han desarrollado diversas tecnologías y métodos para la detección rápida de Salmonella, que incluyen métodos inmunológicos (Keith, 1997), biosensores (Ali et al., 2020), métodos físicos como cromatografía por MALDI-TOF (Persad et al., 2022) y la espectroscopia RAMAN-SERS (Jin et al., 2022). Además, métodos basados en la secuencia de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa (qPCR) y los métodos de amplificación isotérmica (Chan et al., 2023; Lee and Oh, 2023; Shi et al., 2015). En general, los métodos basados en la secuencia de ácidos nucleicos tienen alta especificidad, buena sensibilidad y precisión. Por lo tanto, se utilizan ampliamente en la epidemiología molecular y en la detección de bacterias patógenas como Salmonella Gallinarum (Chacón et al., 2023).

Las técnicas basadas en inmunoensayos, como el ensayo VIDAS® (bioMérieux, Francia), la prueba Tecra® y la prueba 1-2 Test® (Merck) son métodos comerciales rápidos validados de uso común para la detección de Salmonella en productos alimenticios. Es necesario resaltar que ninguno de estos métodos es capaz de hacer la serotipificación de la cepa, son únicamente para confirmar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra (Tabla 1).

VIDAS® es un sistema automatizado cualitativo de inmunoensayo fluorescente ligado a enzimas que puede generar resultados positivos o negativos presuntivos en menos de 2 días. La prueba usa un enriquecimiento de las muestras en medio líquido de 20-24h, anticuerpos somáticos y flagelares contra Salmonella para detectar bacterias móviles e inmóviles. En algunos trabajos, la evaluación del kit mostró como resultado una sensibilidad del 96% para la detección de S. Typhimurium y S. Tennessee en muestras de alimentos artificialmente contaminados (Keith, 1997). Adicionalmente, un estudio más reciente sobre el uso de VIDAS® para el cribado de carne cruda y subproductos de cerdo y de bovino demostró que el sistema es un método de detección eficaz de Salmonella, con la ventaja de un tiempo de análisis reducido cuando son analizadas grandes cantidades de muestras (Meyer et al., 2010).

Otro método comercial de detección basado en inmunoensayos para alimentos es la prueba Tecra® (Paula et al., 2002). Todos los reactivos necesarios para el ensayo se proporcionan en el módulo del kit. Después de un paso de enriquecimiento de la muestra de 16 a 20h, los homogeneizados de la muestra son transferidos al módulo de prueba donde el ensayo inmunológico y detección se realizan manualmente con tiras reactivas recubiertas con anticuerpos, hay una versión automática para varias muestras. Los resultados presuntivos se pueden generar en menos de 22h, y deberán ser confirmados con métodos de cultivo tradicional, siendo así de la misma forma para el kit VIDAS®.

Para evitar los problemas asociados con la serotipificación tradicional, se han desarrollado varios métodos moleculares para la tipificación de Salmonella, especialmente métodos basados en la identificación y multiplicación del ácido desoxirribonucleico (ADN) de la bacteria (Álvarez et al., 2023). Los métodos de tipificación molecular tienen muchas ventajas sobre los métodos tradicionales, como un mayor poder discriminatorio, mejor estandarización y mejor control de la calidad en el laboratorio (Herrera-León et al., 2007). Además, los métodos basados en ADN tienen el potencial de ser más rápidos y automatizables y, en general, son más precisos que la tipificación serológica tradicional. Otro punto importante es que la tecnología para los ensayos basados en ADN es universal, lo que la hace disponible para más laboratorios que la serotipificación tradicional (Tabla 1).

Durante la década de 1990, el avance en las tecnologías basadas en ácidos nucleicos condujo al desarrollo de métodos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) más rápidos y específicos para la identificación o caracterización de aislamientos puros de Salmonella a partir de diferentes muestras (Soria et al., 2012; Whyte et al., 2002).

Los métodos de PCR para la detección de Salmonella emplean pares de cebadores o “primers” específicos para las secuencias de ADN de los genes de Salmonella. Durante el proceso de la amplificación por PCR (multiplicación de la secuencia diana), la secuencia de interés de ADN de la Salmonella es flanqueada por un par de cebadores específicos que es amplificada con una enzima ADN polimerasa (Eisenstein, 1990). Después de varios ciclos de amplificación, los productos de PCR resultantes, que son secuencias del mismo tamaño y región, pueden detectarse fácilmente mediante el uso de una electroforesis en gel de agarosa, que es básicamente la forma más barata en los laboratorios para visualizar las copias del gen/es de la Salmonella multiplicados previamente en la PCR.

Una vez entendido el proceso de multiplicación de ADN por la PCR, podemos continuar con algunas de las técnicas más frecuentes para el diagnóstico de Salmonella. En paralelo, es necesario mencionar que, con el desarrollo de la genómica, se han completado numerosas secuencias genómicas de diferentes serotipos de Salmonella. Así, los análisis genómicos comparativos de estos datos ofrecieron oportunidades para identificar regiones en el genoma que son únicas para un serotipo, o “marcadores genómicos específicos de serotipo” (Arrach et al., 2008). En ese sentido, se han desarrollado varios esquemas, incluidos PCR (PCR multiplex y en tiempo real “qPCR”) y esquemas basados en sondas (Cheung and Kam, 2012) para identificar estas regiones con el fin de predecir serotipos Tabla 1).

Tabla 1. Comparación entre diferentes tipos y pruebas para detección de Salmonella.

EnrQ: Enriquecimiento; D = días; H = horas; Tiempo: Incluido el periodo de enriquecimiento de 12 horas. *Tiempo dependiente del tipo de plataforma disponible (Oxford o Illumina).

El sistema de PCR en tiempo real es una innovación tecnológica de PCR convencional, con una gran cantidad de kits comerciales (FSIS, 2024). qPCR tiene la capacidad de generar resultados cuantitativos, lo que permite monitorear la reacción de amplificación de manera más rápida y precisa, sin la necesidad del uso de un gel de agarosa. La secuencia “diana” amplificada puede detectarse mediante el aumento de la señal de fluorescencia producida directamente proporcional al número de secuencias amplificadas (copias). El aumento de la intensidad de la fluorescencia es capturado por las cámaras del termociclador en tiempo real y transferido a un monitor donde puede ser visualizado rápidamente (Heymans et al., 2018).

El ensayo de hibridación de sondas de ADN también se utiliza ampliamente para detectar bacterias. La técnica se basa en el uso de una sonda de ADN con una secuencia complementaria a la secuencia diana del ADN de la bacteria. Las células diana se lisan y los ácidos nucleicos liberados se purifican para su posterior hibridación con una sonda de ADN. Los ensayos de hibridación con sondas de ADN presentan alta especificidad y sensibilidad, además, son eficaces para examinar rápidamente un gran número de muestras (Namimatsu et al., 2000). La aparición de reacciones cruzadas en estas pruebas se reduce considerablemente. Sin embargo, todas las pruebas requieren un paso de enriquecimiento previo de la muestra para lograr la concentración adecuada para la sensibilidad del método. Los ensayos colorimétricos de hibridación de ADN disponibles comercialmente tienen un tiempo de análisis promedio de 22 horas.

En los últimos años, los ensayos moleculares se han explorado y desarrollado intensamente para la detección de Salmonella. Entre las ventajas de las pruebas moleculares se encuentran la sensibilidad, especificidad y la posibilidad de combinar con otros métodos, permitiendo una identificación más rápida sin necesidad de obtener colonias puras. Como consecuencia de esto, existen pruebas moleculares capaces de detectar bajas cantidades de ADN en una muestra. Debido a la capacidad de detectar concentraciones bajas, los tiempos de enriquecimiento son considerablemente más cortos y pueden alcanzar los niveles necesarios para una detección confiable mediante métodos de PCR (Kawasaki et al., 2010).

Entre las pruebas moleculares, las pruebas de PCR y qPCR muestran especificidad y sensibilidad comparable a los métodos convencionales. Los ensayos basados en PCR y qPCR pueden proporcionar niveles de sensibilidad de 200 bacterias por ml (Kawasaki et al., 2010), niveles que generalmente se alcanzan después del enriquecimiento previo de la muestra. La sensibilidad y especificidad de estos métodos dependen en gran medida de la comunidad bacteriana de la muestra, la matriz del alimento, y la presencia de sustancias inhibidoras (grasas, proteínas, polisacáridos, metales pesados, antibióticos y compuestos orgánicos).

Los recientes avances en las tecnologías de secuenciación y las herramientas de bioinformática han hecho de la secuenciación del genoma completo una solución viable y avanzada para la investigación epidemiológica y la vigilancia de patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos como Salmonella (Deng et al., 2016). El término epidemiología genómica se ha utilizado cada vez más para describir la práctica de utilizar la secuenciación del genoma completo para acceder, indexar y analizar características de la secuencia de ADN de importancia epidemiológica. Los elementos genómicos que varían en los procesos de evolución bacteriana proporcionan amplios objetivos para las investigaciones epidemiológicas en diferentes escalas temporales y geográficas (Pardo-Esté et al., 2021).

Los determinantes genéticos de ciertos fenotipos, como el serotipo, la virulencia y resistencia a los antimicrobianos, brindan la posibilidad de predecir in silico rasgos fenotípicos importantes. Debido a que el genoma contiene la totalidad de la información genética de un organismo (Banerji et al., 2020). De esa forma, la secuenciación de genoma completo promete una plataforma integral para la microbiología de salud pública que proporciona una ventana única para varios objetivos de subtipificación y caracterización, aplicable a la industria y sus necesidades de entender la epidemiología de Salmonella. Por ejemplo, la secuenciación de genoma completo puede ayudar a resolver brotes al brindar un alto poder discriminatorio para diferenciar aislamientos estrechamente relacionados y ayudar a rastrear tendencias epidemiológicas al monitorear la resistencia a los antimicrobianos. Además, los archivos generados en la secuenciación de genoma completo son compatible con versiones anteriores y futuras a cualquier esquema de tipificación existente y potencial, in silico (Chattaway et al., 2021).

Los biosensores son dispositivos bioelectrónicos capaces de detectar analitos (especies químicas y/o biológicas) rápidamente, tanto cuantitativa como cualitativamente (Silva et al., 2023). Estos dispositivos se componen de dos componentes principales, un bioreceptor, una molécula que interactúa específicamente con el analito, y un transductor, que convierte la respuesta de interacción bioreceptor-analito en una señal eléctrica que puede ser medible y convertida a una escala por un dispositivo electrónico (Shen et al., 2021).

Los bioreceptores son uno de los componentes más importantes de un biosensor de Salmonella, para hacer posible una detección específica y sensible. En principio, cualquier biomolécula o conjunto que pueda reconocer el objetivo puede utilizarse como bioreceptor (Bazin et al., 2017). Entre todos los tipos de bioreceptores, los anticuerpos, los aptámeros, los bacteriófagos, los péptidos antimicrobianos (AMP) y las sondas de ácidos nucleicos son los más comunes para el reconocimiento de Salmonella. El gran triunfo de los biosensores se debe a varias características como velocidad de respuesta, sensibilidad, límite de detección, costo, y transportabilidad para uso en campo (Lee and Oh, 2023).

En los últimos años se han realizado numerosas investigaciones en este campo. Esta evolución en el desarrollo de biosensores ha sido impulsada por la comprensión molecular y bioquímica de la respuesta analítica y sus respectivas tecnologías de apoyo. Por estos motivos, hoy en día es posible encontrar dispositivos miniaturizados accesibles y de fácil uso. Actualmente existen diferentes tipos de biosensores que se clasifican por el tipo de moléculas biológicas inmovilizadas, por la interacción con el analito (catalítica o enzimática), mediante la respuesta analítica (directa o indirecta), o por el transductor (electroquímico, óptico o piezoeléctrico) (Shen et al., 2021).

Finalmente, están disponibles algunos métodos como la cromatografía por MALDI-TOF (Persad et al., 2022) y la espectroscopia RAMAN-SERS (Jin et al., 2022). Estos métodos usan procesos físicos para obtener una fotografía (espectro) de la Salmonella. Se debe tener en cuenta que cada serotipo tiene un espectro único, en ese sentido estas técnicas permiten discriminar con gran precisión y rapidez el serotipo de la muestra. Una desventaja es que en las dos técnicas (Tabla 1) es necesario el uso de colonias aisladas de Salmonella para crear los bancos de datos con los espectros, posteriormente a este desarrollo, pueden ser detectadas las bacterias usando métodos de enriquecimiento rápido de algunas pocas horas y los espectros generados comparados contra el banco de espectros.