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Validación de Real-Time PCR: Detección y Cuantificación del Virus de Laringotraqueitis Infecciosa Aviar para la industria biofarmacéutica

Publicado el: 29/8/2016
Autor/es:

Introducción:

El desarrollo y validación de técnicas cuantitativas no normalizadas es una actividad analítica clave y necesaria para asegurar la dosificación de las vacunas en aves. Los métodos empleados para la cuantificación de partículas virales producidas en fluido alantoideo (FA) como por ejemplo: el ensayo en placa y dosis infectiva al 50% en embrión de pollo (DIE50) resultan ser costosas y pueden demandar demasiado tiempo; por el contrario los métodos moleculares tipo Real-Time PCR (qPCR) son más rápidas hasta de menor costo. Pero muy pocos son los laboratorios en la industria avícola que desarrollan métodos de qPCR con un proceso correcto de validación y sobretodo que evalúen su rendimiento. Esta alta exigencia está siendo implementada a nivel mundial según las guías de la “International Conference on Harmonization” de la Food and Drug Administration (ICH - FDA por sus siglas en inglés), es por ello que presentamos la validación de una sistema de cuantificación por qPCR para dosificar el virus de Laringotraqueitis Infecciosa Aviar (ILTV virus por sus siglas en inglés), en el cual se evidenció científicamente los parámetros de rendimiento como: Precisión, sensibilidad, especificidad, límite de blanco (LoB), límite detección (LoD) y el límite de cuantificación (LoQ). 

Objetivo:

Validar basándose en parámetros de rendimiento un método de qPCR para cuantificar ILTV en fluido alantoideo

Metodología:

Durante el proceso de validación se siguieron los principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio y las guías para la industria establecidos por la FDA. Se empleó ADN de una línea celular de fibroblasto de pollo (línea DF1). Se propagó una cepa tipificada de ILTV en huevos embrionados SPF y se aisló el ADN viral del fluido alantoideo (FA). Se caracterizó la integridad, pureza y ausencia de otros patógenos aviares. Se diseñó un par de cebadores que anclan una región conservada del gen de la glicoproteína B (gB) de ILTV. Se clonó un plásmido con la secuencia del gen gB y el número de copias del plásmido se determinó teóricamente, haciéndose diluciones del plásmido para la curva estándar. Todas las muestra fueron amplificadas en un termociclador LightCycler®480 (Roche, Alemania) y los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. El número de copias de ILTV fue estimado como número de copias gB por µL.

Resultados:

Las medias de las las repeticiones (precisión) fueron homogéneas [p>0.05] lo que permitió crear gráficos de control X. Empleando ADN procedentes de aislados con otros virus (sin presencia de ILTV) la qPCR tuvo una especificidad del 100% (Fig.01). Diluciones sucesivas (Fig.02) de la cepa ILTV permitió: (a) obtener la deriva de los picos de fluorescencia –d (d/dT) que logró determinar el LoB en 0.044 y el LoD en 1.56 (10170 copias/µL de FA) y (b) Determinar el LoQ=16.6fg/ul (33900 copias/µL de FA) (Fig.03). El valor del LoD asumió una estrategia diagnóstica (sensibilidad diagnóstica) en que valores ?1.56 denota “presencia ILTV” y valores ≤ 1.56 denota “ausencia ILTV” (Tabla)

Figura 1: Electroforesis para la evaluación de la especificidad 

 

Figura 2. LoD y LoQ del qPCR (LightCycler®480). 

La curva estándar del qPCR usada para cuantificar ILTV fue generada de diluciones
seriadas al décimo del plásmido con inserto de gB (1x10
8 a 1x10copias)

Figura 3. Picos melting de los productos de qPCR y el límite establecido

 

Para determinar el LoD y LoQ a partir del pico formado por ADN de DF1 LightCycler®480).

Tabla. Resumen estadístico de los valores hallados en la validación del qPCR.

Conclusiones:

Se validó un método de qPCR para la cuantificación de ILTV en fluido alantoideo con alta especificidad de detección, ajustándose a la mejora continua de la producción de vacunas eficaces y los parámetros precisión, exactitud y reproducibilidad pueden ser verificables en el tiempo.

Además de ajustarse a los principios de Good Laboratory Practices (GLP) y de la FDA se estableció una estrategia confirmatoria para la detección de ILTV “a dos plataformas”. 

 

 

 

Palabas Clave: Validación, qPCR, ILTV, vacunas

Pg: 1pg =0,000000000001 o la billonésima parte de un gramo

Fg: 1fg = 0,000000000000001 o la milbillonésima parte de un gramo


 Trabajo de investigación publicado en los medios avícolas: Actualidad Avipecuaria, MAP, Engormix y Sector Pecuario, Agosto 2016.

 
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