Salmonella en huevo

La producción de huevos para consumo directo y productos de huevo en Argentina está creciendo en forma sostenida a razón del 3% anual, con un incremento de las exportaciones de hasta un 20% anual. Entre Ríos participa con el 21% de la producción de huevos a nivel nacional y procesa el 27% del huevo que se industrializa en Argentina (Irigoyen, 2010). Por otra parte, la epidemiología de Salmonella Enteritidis cuenta la historia de un patógeno que ha encontrado un nicho biológico en huevos de gallina y varias investigaciones informan sobre la asociación con brotes de enfermedad transmitida por huevos y productos de huevo (Gantois et al., 2009). La infección por Salmonella, constituye una de las principales causas de morbilidad en nuestro país y es uno de los patógenos más aislados en enfermedades de transmisión alimentaria (Sandoval & Terzolo, 1989; Caffer & Pichel, 2006).

Se ha observado que Salmonella pre-adaptadas a condiciones ácidas, es decir que estuvieron un contacto previo con un medio ácido, y luego inoculadas en diversas matrices (medios de cultivo, alimentos) presentaban mayor resistencia a otros factores de estrés como puede ser el calor. Este mecanismo inducible es conocido como respuesta de tolerancia al ácido. Existen diferentes formas de lograr adaptación de los microorganismos a las condiciones ácidas, en forma gradual o mediante el empleo de un shock ácido, en cuyo caso la adaptación se produce violentamente. En la adaptación mediante shock ácido los microorganismos se inoculan y desarrollan durante un período en un medio de desarrollo determinado y (con un pH final cercano a la neutralidad) y luego los mismos son sometidos a un descenso brusco de pH mediante el empleo de algún agente acidulante (pH final ácido). En la adaptación gradual, los microorganismos se inoculan durante un período, en un medio de desarrollo determinado que presenta en su composición un exceso de glucosa. Como producto de la utilización de la glucosa, se produce un descenso gradual del pH del medio provocando la adaptación de los microorganismos, presentes en el mismo, en forma lenta. La inducción del mecanismo de adaptación al ácido podría otorgar resistencia contra otros factores de estrés como es el calor (Malheiros et al., 2009).

El objetivo de este trabajo fue estudiar la resistencia térmica de serotipos de Salmonella, aislados de huevo, en albúmina deshidratada y a las temperaturas utilizadas en los procesos de pasteurización en cultivos previamente adaptados y no adaptados a ácido.

Materiales & Métodos

Aislamiento y tipificación de cepas
Se realizaron estudios de aislamiento de Salmonella en 120 lotes de 5-15 huevos de gallina elegidos intencionalmente (huevos sucios o resquebrajados) y cáscaras de huevo, durante dos años y en los meses de abril a noviembre. Se tomaron muestras en granjas comerciales y domésticas y en comercios de la ciudad de Gualeguaychú, Entre Ríos. Los huevos se mantuvieron a temperatura ambiente hasta su análisis. Para el aislamiento de cepas se utilizó la técnica: ISO 6579-2002. La serotipificación somática y flagelar se realizó según el Manual de Procedimientos Salmonella Parte I: Aislamiento, Identificación y Serotipificación del INEI-ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán y en forma conjunta con el Instituto de Producción de Biológicos del organismo mencionado. Todas las cepas fueron almacenadas a - 30 ºC en el 50% (v / v) de glicerol. Para los estudios se mantuvieron a 4 ºC en agar tripteína soya o se subcultivaron caldo en infusión cerebro corazón (BHI) a 37º C durante 24h, antes de utilizarlas en las experiencias.

Supervivencia de cepas de Salmonella preadaptadas gradualmente a condiciones acidas
Las cepas se cultivaron en forma paralela en caldo nutritivo (CN) y en caldo nutritivo suplementado con 10 g/l de glucosa (CNG). La incubación se realizó a 37º C durante 18 horas en condiciones estáticas. Luego se midió el pH del cultivo y se sembró en Agar tripteína soya para evaluar su viabilidad (Malheiros et al., 2009). Para los estudios de adaptación a ácidos en forma de shock, las cepas se incubaron en CN suplementado con ácido acético a los siguientes pH: 3.5- 4.0 y 4.5, por 24-72 h para determinar la supervivencia de los cultivos se sembraron en superficie en Agar tripteína soya (ATS) más extracto de levadura 0,6% (para la mejor recuperación de las células injuriadas) por 6 h a 37º C.

Efecto de la adaptación al ácido en la inactivación por calor de cepas de Salmonella en albúmina deshidratada
Para los ensayos de inactivación térmica de cultivos no adaptados se partió del crecimiento en BHI y para los cultivos adaptados a ácido, del crecimiento en CNG. Se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en agua de peptona 0,1% estéril hasta obtener un valor de densidad óptica entre 0.4-0,5 a 600nm. La albúmina deshidratada y pasteurizada industrialmente por proceso "hot room" a 82 ºC por 14 h, se evaluó microbiológicamente y se inoculó con aproximadamente 1ml/g de este inóculo que se dispersaron por spray, posteriormente se secó en estufa a 50ºC. En ambas matrices homogeneizadas se determinó la densidad de la población de cada inóculo por siembra en superficie en ATS a 37ºC por 24 h. Luego se cargaron tubos capilares estériles de cada una de las matrices a ensayar, se sellaron y se sumergieron totalmente en un baño de agua de temperatura controlada (Oteiza et al., 2003). A diferentes tiempos de tratamiento, se retiraron dos tubos capilares del baño térmico y se enfriaron en hielo a efectos de detener el proceso de calentamiento. Los capilares se limpiaron con alcohol y se rompieron asépticamente en un solo extremo. Se realizaron diluciones seriadas (1:10) en agua de peptona 0.1% que se sembraron en superficie y por duplicado en ATS + extracto de levadura (0,6%). Se incubó a 37ºC durante 24h. Los recuentos se expresaron en UFC/ml o g según la matriz. Para cada temperatura, se determinaron por regresión lineal los valores de inactivación térmica D (tiempo necesario para reducir el 90% de la población bacteriana) y z (incremento de temperatura necesario para reducir el 90% del valor D).

Se aislaron 14 cepas de Salmonella sp. de las cuales se serotipificaron: 2 de S. Enteritidis y 1 de S. Oranienburg de 30 lotes de huevo entero y 1 de S. Enteritidis, 3 de S. Typhimurium, 4 de S. Montevideo, 2 de S. Hadar y 1 de S. Infantis de 90 lotes de cáscara de huevo. Similares serotipos fueron informados por Gantois et al. (2009) en huevo de gallina.

Se estudiaron los microorganismos presentes en la albúmina deshidratada y pasteurizada: recuento de heterótrofos totales: 6-9x10² UFC/g; coliformes totales: 10-100 UFC/g; Hongos y levaduras:10-70ufc/g; Bacilluscereus: > 10ufc/g; Salmonella sp: ausencia en 25g.

Supervivencia en condiciones ácidas de S. Enteritidis y S. Typhimurium
Se trabajó con una cepa de cada serotipo. El pH inicial del CN antes de inocular fue de 7,37±0,12. Los valores de pH final variaron entre 4.28- 4.42±0.02 para S. Enteritidis y 4.10-4.38±0.03 para S. Typhimurium. Los recuentos iniciales y finales fueron: 8.34 log UFCml^-1-7.02 log UFCml^-1 para S. Enteritidis y 8.22 log UFCml^-1-7.30 log UFCml^-1para S. Typhimurium. Estos cultivosse inocularon en CN pH 3.5, 4.0 y 4.5 en ácido acético. Los valores D para S. Enteritidis fueron: 26.33± 4.35min a pH 3.5; 44.23± 5.7 min a pH 4.0 y 157.88± 48.7 min a pH 4.5. Para S. Typhimurium fue de 20.35± 1.75 min a pH 3.5; 36.83±18.26 min a pH 4.0 y 85.98±22.7 min a pH 4.5. El análisis de varianza mostró que existen diferencias significativas en los tiempos de reducción decimal inducidos por bajo pH de ambos serotipos y en particular a pH 4.5 (p<0.05). S. Enteritidis mostró mayor resistencia a los diferentes pH ensayados.

Efecto de la adaptación al ácido en la inactivación por calor de S. Enteritidis y S. Typhimurium en agua de peptona y albúmina deshidratada
Solo se pudieron determinar los valores D, en agua de peptona 0,1% en los cultivos adaptados a ácido, mientras que para los estudios en albúmina se utilizaron cultivos adaptados y no adaptados. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. A modo de ejemplo se presentan en la Fig. 1 los gráficos de supervivencia de S. Enteritidis en albúmina deshidratada a las tres temperaturas estudiadas.

Fig. 1. Curva de supervivencia de cultivos adaptados (A) y no adaptados a ácido (B) de S. Enteritidis en albúmina deshidratada durante el tratamiento a 72, 77 y 82ºC

 

Los dos serotipos resultaron protegidos a los efectos letales del calor por la adaptación a ácido. Los valores de D y z obtenidos se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Resistencia térmica de Salmonella

Existen diferencias significativas en los valores de D a cada temperatura según el serotipo estudiado en agua de peptona. S. Enteritidis (AA) presentó mayores valores de D que S. Typhimurium (AA). El valor D se incrementó 1270 veces para S. Enteritidis y 1400 veces para S. Typhimurium, en albúmina deshidratada con respecto a la termoresistencia en agua de peptona, atribuibles, en la albúmina, a su baja actividad de agua que fue de 0.366±0.05 así como otros constituyentes de la matriz que ejercen efecto protector sobre los microorganismos.

En albúmina deshidratada, la adaptación previa a ácido incrementó, en promedio, 3 veces el valor D para S. Enteritidis y 2,3 veces en S. Typhimurium respecto de los cultivos no adaptados.

El análisis de varianza mostró que existen diferencias significativas en los tiempos de reducción decimal a cada temperatura en los serotipos estudiados y que la adaptación a ácido tiene un efecto significante en los valores D de estas bacterias (p< 0,05).
Estos resultados resultan importantes en el campo de la tecnología de alimentos y la seguridad alimentaria, dado que debe considerarse con mayor cuidado los tiempos y temperaturas de tratamiento de pasteurización de la albúmina que aseguren la destrucción tanto de las cepas no adaptadas como las adaptadas a ácidos.

Caffer MI & Pichel M. 2006. Evolución de la salmonelosis y brotes hospitalarios por Salmonella spp. en los últimos 15 años, pp. 209-215. En Temas de zoonosis III, Cacchione RA, Durlach R, Larghi OP, Martino P (eds.). Asociación Argentina de zoonosis. Bs. As., Argentina.

Gantois I, Ducatelle R, Pasmans F, Haesebrouck F, Gast R, Humphrey TJ, Van Immerseel F. 2009. Mechanisms of egg contamination by Salmonella Enteritidis. FEMS Microbiology Reviews 33:718-738.

Irigoyen D. 2010. Los nuevos paradigmas en la expansión de la avicultura del huevo y ovoproductos. 2do. Curso Fanus 2010. Buenos Aires.

Malheiros PS, Brandelli A, Noreña CPZ, Tondo EC. 2009 Acid and thermal resistance of a Salmonella Enteritidis strain involved in several foodborne outbreaks. Journal of Food Safety 29:302-317.

Oteiza JM, Giannuzzi L, Califano A. 2003. Thermal inactivation of Escherichia coli O157:H7 and Escherichia coli isolated from morcilla as affected by composition of the produc. Food Research International 36:703-712.

Sandoval VE & Terzolo HR. 1989. Las infecciones por Salmonella enterica subsp. Enterica serovar. Enteritidis afectan seriamente a la producción avícola argentina y constituyen un problema de salud pública. Rev. Arg. Prod. Anim. 9(Sup. 1):132-134.