Residuos de enrofloxacina y ciprofloxacina en músculo de pollos parrilleros

Introduccion

El presente trabajo tuvo su inicio a partir de la consulta de un productor avícola de la zona de influencia de la Universidad Nacional de Río Cuarto. En uno de los galpones los pollos parrilleros presentaban una patología respiratoria, con diagnóstico clínico de micoplasmosis. El productor requería conocer tratamiento adecuado y el tiempo de espera para la faena y comercialización de los animales en buenas condiciones de salud y bajos niveles de residuos. Muchos fármacos poseen la capacidad de generar residuos, entendiendo que estos son todas las sustancias químicas, ya sean los componentes originales y/o sus metabolitos, que permanecen en las carnes, leches u otros alimentos derivados del animal al que se administró el producto veterinario en cuestión (11, 13). Por otro lado, la casi totalidad de los trabajos de investigación en residuos han sido efectuados en animales sanos.

La micoplasmosis aviar es una enfermedad ampliamente difundida por todo el mundo, pudiendose presentar como enfermedad respiratoria cronica o como sinovitis infecciosa, siendo Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae respectivamente los responsables de las mismas. Si bien la mortalidad en estas dos formas de presentacion es baja, la morbilidad es muy alta, lo cual se traduce en importantes perdidas economicas producto del bajo incremento de peso en los planteles de pollos parrilleros (2). Las condiciones atmosfericas y ambientales adversas, junto con infecciones asociadas de origen bacteriano o vírico, desempeñan un importante papel en la propagacion de micoplasmosis respiratorias clínicas, en granjas avícolas (17).

Ciprofloxacina (CFX) y enrofloxacina (EFX) son fluoroquinolonas de segunda generación con un amplio espectro de actividad antimicrobiana. Ambas poseen buena biodisponibilidad luego de la administracion oral y excelente distribucion en los tejidos. En nuestro país EFX es empleada en los planteles avícolas y porcinos, con propositos preventivos y terapeuticos. CFX fue introducida en medicina humana siendo efectiva frente a un gran numero de infecciones, debido a su amplio espectro e intensa actividad frente a Gram negativos, y a la propiedad de no poseer resistencia cruzada con beta lactámicos y aminoglucósidos (15). Se ha indicado su empleo en perros y gatos, pero no en animales de produccion, debido al riesgo que implica para los consumidores, la presencia de residuos de esta fluoroquinolona en los alimentos.

Los Límites Máximos de Residuos (LMR) para diferentes medicamentos veterinarios son establecidos en diseños experimentales que utilizan animales sanos o a partir de los resultados de estudios de farmacocinetica plasmatica obtenidos, en la amplia mayoría de los tratamientos, en dosis unica.

El objetivo del presente trabajo fue establecer durante 5 dias pos-tratamiento los niveles de residuos de Ciprofloxacina (CFX) y enrofloxacina (EFX) en músculo de pollos tratados con estos antimicrobianos, para determinar el tiempo de espera para faena y comercializacion de los animales, sin riesgos para la salud publica.

Materiales y metodos

Antimicrobianos
Enrofloxacina, base, polvo liofilizado 100% de pureza y Ciprofloxacina clorhidrato, equivalente a 87% de CFX, fueron usados como estandares para el analisis por cromatografía liquida de alta presion (HPLC). Baytril oral, solucion al 10% y Ciprofloxacina clorhidrato fueron empleadas para la administracion de EFX o CFX a los animales. Las soluciones estandares de los antimicrobianos (500 µg/ml de agua deionizada) para estudios de HPLC se prepararon mensualmente. Las soluciones de antimicrobianos para la administración a los animales se prepararon 24 h antes de los ensayos en animales.

Animales
El trabajo se llevo a cabo en la Unidad Avicola Experimental de la Facultad de Agronomia y Veterinaria de la Universidad Nacional de Rio Cuarto, con pollos parrilleros provenientes de un establecimiento situado en la zona rural de Rio Cuarto, Cordoba. De un galpon de 5000 pollos parrilleros de la linea COBB con sintomatologia respiratoria se muestrearon 30 animales. Los pollos, de 44 días de edad con 1.73 + 0.15 kg de peso estaban vacunados contra Marek y Gumboro y carecian de tratamiento antibacteriano. Los animales recibieron agua y alimento ad libitum y fueron mantenidos en habitacion cerrada, con pared y piso de cemento, cubierto con cascara de mani. El alimento balanceado fue a base de maiz y sorgo, sin aditivos, ni antimicrobianos. Todos los animales estuvieron sometidos al mismo manejo y los ensayos fueron conducidos sin someterlos a sufrimiento alguno.

En Argentina existen pocos estudios sobre Micoplasmosis Aviar, los cuales fueron de mucho valor como antecedentes de esta enfermedad en las granjas de nuestro medio rural (2). La evaluacion clinica del cuadro respiratorio compatible con micoplasmosis se efectuo diariamente, en la mañana y en la tarde, y se evaluo la presencia de ruido pulmonar, la reaccion a estimulos externos y el consumo de agua y alimento. Los animales fueron distribuidos al azar en dos grupos de 15 individuos cada uno. Un grupo fue tratado con una dosis diaria de 5 mg/kg/12h de EFX en bolus oral durante 5 dias, y el otro grupo con un esquema terapeutico identico de CFX.

Tres animales de cada grupo, elegidos al azar, fueron sacrificados a las 24, 48, 72, 96 y 120 h despues de finalizado el tratamiento. Luego del sacrificio por decapitacion y desangrado, se extrajeron aproximadamente 10 g de musculo pectoral y se congelaron a -20 °C hasta el momento del procesado de la muestra. Con el tratamiento con CFX, el ruido pulmonar comenzo a desaparecer al segundo día de iniciado este, y al tercer dia de iniciado con EFX. No se observo ausencia de respuesta a estimulos, y tampoco inapetencia.

Procesado de las muestras
Se pesaron 200 mg de musculo pectoral sin aponeurosis. Se homogeneizo cada muestra con 2 ml de buffer fosfato. Los homogeneizados de musculo se desproteinizaron con diclorometano (8 ml), se agitaron manualmente y con vortex 1 min y se centrifugaron a 4000 rpm a 4 oC durante 20 min. Las fases acuosa y organica obtenidas se separaron por filtracion con papel separador de fases, colectando esta ultima. El precipitado se re-extrajo con 6 ml de diclorometano y las fases organicas obtenidas se evaporaron a sequedad a 50 oC bajo corriente de nitrogeno para luego resuspenderlas en 200 µl de fase movil. Las fluoroquinolonas presentes se cuantificaron por cromatografia liquida de alta presion (HPLC), con deteccion por fluorescencia a 295 nm de excitacion y 500 nm de emisiin (8, 9). El ensayo fue lineal desde 0.00375 a 0.1 µg/ml. Los antimicrobianos pudieron ser cuantificados con buena resolucion de ambos picos y ausencia de interferencias por la matriz biologica empleada.

Los limites de cuantificacion fueron 0.0119 y 0.0557 µg/g para EFX y CFX respectivamente. Los indices de recuperabilidad de los metabolitos en musculo se obtuvieron restando la concentracion de los antimicrobianos de las muestras inicialmente adicionadas con EFX y CFX (0.01 y 0.1 µg/ml) respecto de muestras de musculo con incorporacion de los antimicrobianos en igual concentracion pero luego del procesado de la muestra. Los promedios fueron 77.47 % para EFX y 87.7 % para CFX.

Resultados

Los residuos de antimicrobianos en musculo de pollo pudieron ser cuantificados por HPLC con detector de fluorescencia. EFX eluye a los 2.70 + 0.50 min y CFX a los 4.02 + 0.15 min. Las concentraciones de residuos de ambas fluoroquinolonas en musculo se muestran en la tabla 1. CFX alcanzó su nivel maximo a las 72 h de finalizado el tratamiento con 0.027 + 0.014 µg/g. Desde las 24 a las 120 h los niveles de CFX oscilaron entre valores mínimos de 0.012 + 0.002 y máximos de 0.027 + 0.014 µg/g. En los pollos medicados con EFX, la maxima concentracion de antibacteriano en musculo se alcanzo a las 24 h de suspendido el tratamiento (0.073 + 0.006 µg/g), descendiendo gradualmente hasta 0.0004 + 0.0002 µg/g a las 120 h.

Residuos de enrofloxacina y ciprofloxacina en músculo de pollos parrilleros - Image 1

^{Tabla 1. Residuos de enrofloxacina (EFX) y ciprofloxacina (CFX) en músculo pectoral de pollos parrilleros después de finalizado el tratamiento (24-120 h), con dosis de 5 mg/kg/12h por vía oral durante 5 días}

Como se observa en la figura 1, los niveles de CFX se mantuvieron casi constantes en el tiempo del ensayo, promediando los 0.0166 + 0.0068 µg/g. Por el contrario, la concentracion de EFX en musculo descendio en forma rapida y constante despues de finalizado el tratamiento, alcanzando a las 120 h la concentracion mínima.

^{Figura 1.}^{Residuos de enrofloxacina (EFX) y ciprofloxacina (CFX) en músculo pectoral de pollos parrilleros después de finalizado el tratamiento (24-120 h), con dosis de 5 mg/kg/12h por vía oral durante 5 días}

Discusión

Si bien la efectividad terapeutica no fue el objetivo de este trabajo, cabe recordar que los niveles tisulares de EFX y CFX se determinaron en un lote de pollos con micoplasmosis. Los trabajos de residuos en tejidos de pollos en proceso infeccioso son escasos en la bibliografía. Soliman (18), evaluo la distribucion tisular de EFX en pollos sanos e infectados con Escherichia coli, tratados en un esquema de dosis multiple, observando diferencias de concentraciones antimicrobianas entre ambos grupos de animales, siendo menores en pollos enfermos. Los limites maximos de residuos (LMR) son en general establecidos en animales sanos a partir de los ensayos farmacologicos y toxicologicos pertinentes y de los metodos analiticos desarrollados. La practica veterinaria nos enfrenta a situaciones donde es necesario lograr efectividad clinica antimicrobiana en animales enfermos y lograr carnes aptas para el consumo.

El metodo empleado en este trabajo para investigar la presencia de dos fluoroquinolonas simultaneamente en musculo de pollo es simple y economico (9); es simple porque se demora tres horas desde la recepcion de la muestra hasta la obtencion de los resultados, y economico porque la extraccion liquido-liquido es accesible para paises como el nuestro, sin la necesidad de la importacion de insumos de alto costo como son los cartuchos de extraccion en fase solida.

Las concentraciones de estos antimicrobianos en musculo en el tiempo muestran un comportamiento cinetico tisular diferente con niveles constantes para CFX y declinacion rapida para EFX, como se observa en la Tabla 1 y la figura 1. En trabajos previos de farmacocinetica plasmatica en pollos(7) y en cabras (6) se observo una rapida eliminacion de CFX. Esto tambien fue observado por otros autores en varias especies como caninos, equinos y ovinos (1, 4, 14). Esos trabajos midieron la disminucion de CFX en plasma en el tiempo, y en todos se resalta la rapida eliminacion de este antimicrobiano. Los presentes resultados en musculo abren un interrogante, ya que la declinacion plasmatica de CFX no parece ser un reflejo de la eliminacion tisular de este farmaco del animal, sino a su amplia distribucion en los tejidos. Otros autores, en un estudio de farmacocinetica plasmatica y concentracion tisular de danofloxacina y EFX en pollos parrilleros, informan que ambas drogas en las concentraciones tisulares exceden ampliamente las concentraciones plasmáticas (12).

A partir de los estudios farmacocineticos, en los que se infiere la posible distribución tisular de los fármacos, CFX es presentada como una de las fluoroquinolonas con mejores cualidades. Sin embargo, los presentes resultados hacen suponer la existencia de una disociacion entre la cinetica plasmatica y tisular, al menos en esta especie y con este esquema terapeutico. Se resalta entonces, la importancia de efectuar estudios de farmacocinetica tisular de farmacos en tejidos de importancia terapeutica o economica. En un trabajo anterior, se analizo la presencia de residuos de EFX y CFX en huevos de gallinas ponedoras, cuantificandose mayor concentracion en clara que en yema, y se determino que se debería contemplar un tiempo de espera de 6 días para EFX en plantas productoras para evitar niveles de residuos violatorios de este antimicrobiano en estos productos (10).

La Food and Drug Administration (FDA) (5) establecio una tolerancia de 0.3 µg/g para residuos de EFX en musculo de pollos y pavos. Paralelamente la Comision del Codex Alimentarius (3), un organo creado por la FAO y la OMS para el desarrollo de estandares de residuos de farmacos en alimentos seguros, no determina los LMR para fluoroquinolonas, y solo danofloxacina y sarafloxacina estan bajo evaluacion con tolerancias tentativas de 0.2 µg/g y 0.01 µg/g respectivamente. Los LMR permitidos por la Union Europea para EFX y su metabolito CFX son 100 y 300 µg/kg en musculo de pollo. Los resultados obtenidos en los animales tratados con EFX muestran en los diferentes tiempos niveles de residuos inferiores a los establecidos por los organismos internacionales. Todo lo expuesto nos permite establecer que en pollos parrilleros con infeccion respiratoria por micoplasma, una vez finalizado el tratamiento con EFX 5 mg/kg/12h durante 5 días, los animales estan en condiciones aceptables de consumo con niveles de residuos por debajo de los estandares internacionales. Resultados similares se obtuvieron con CFX, una alternativa terapeutica de uso actual en medicina humana, pero cuyo posible uso futuro en medicina veterinaria no deberia excluirse en produccion animal, como algunos autores expresan en sus trabajos (7, 15, 16). A nuestro criterio es necesario analizar la posible presencia de residuos en distintos productos y tejidos animales comestibles, e incluir estudios de distribucion tisular, en la determinacion de los valores de tolerancia.

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