Probióticos – Los principales criterios de selección y su papel en la salud intestinal

En los últimos años, la demanda de los consumidores por una producción animal sostenible y alimentos seguros aumentó la presión sobre la forma clásica como se aplican los antibióticos promotores de crecimiento (APC). Siguiendo la tendencia general de los países de Europa, Norteamérica y gran parte del Sureste Asiático, los países de América del Sur, como Brasil, Argentina, Chile y Colombia, se dispusieron a debatir de forma más incisiva sobre el tema de la producción de animales libres de APC. Hoy por hoy, el sector de producción animal busca alternativas que puedan sustituir los APC, siempre trabajando en la tríada gestión, bioseguridad y el uso de productos alternativos. A nivel global, la avicultura confía cada vez más en los probióticos debido a sus funciones beneficiosas para el ecosistema intestinal, y la industria de alimentos balanceados está adoptando cada vez más productos probióticos con distintas alegaciones beneficiosas. Sin embargo, han prevalecido ciertas percepciones equivocadas sobre el uso de probióticos. Por ello, este artículo aborda cuestiones técnicas relativas a los probióticos en la avicultura.

Los probióticos a base de Bacillus subtilis mostraron ser una alternativa eficiente al uso de antibióticos en la alimentación de aves con miras a asegurar un rendimiento sostenible. Sin embargo, elegir cepas que tengan rendimiento consistente suele ser un desafío. Mediante una metodología completa de análisis, se desarrolló una nueva cepa de Bacillus subtilis con doble acción: estimular el rendimiento zootécnico tanto en condiciones normales como bajo el desafío de enteritis necrótica por Clostritium perfringens.

Los criterios de selección son numerosos, principalmente: 1) seguridad para el huésped, lo que significa no causar citotoxicidad o hemólisis; 2) estabilidad en el procesamiento de alimentos balanceados y condiciones gastrointestinales; 3) beneficios para la salud intestinal mediante la mejora en la función de barrera y la inmunidad intestinal; 4) capacidad de mejorar el rendimiento de las aves, especialmente en condiciones desafiantes; 5) ausencia de genes de resistencia a antibióticos; y 6) que no sea muy difícil para los usuarios finales efectuar evaluaciones de calidad.

Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), los probióticos se definen como “microorganismos vivos que, cuando administrados en cantidades correctas, brindan un beneficio a la salud del huésped” (FAO, OMS 2001; FAO 2016). Entre una gran variedad de probióticos, algunas cepas son más prevalentes, como las de los géneros Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus y Bacillus, así como especies de levaduras. Pueden clasificarse como bacterianos o no bacterianos (levaduras); formadores de esporas (Bacillus) o no formadores de esporas (Lactobacillus, Bifidobacterium); multiespecies o especies únicas; alóctonos (no presentes en el TGI, como levaduras) o autóctonos (como Lactobacillus).

El probiótico ideal debe ser no patogénico, específico para el huésped, capaz de sobrevivir a condiciones gastrointestinales tales como acidez, sales biliares y enzimas digestivas, capaz de modular la microbiota gastrointestinal y/o parámetros de salud intestinal tales como integridad de la barrera intestinal, respuesta inmune, estatus inflamatorio y prevención del desarrollo de bacterias patogénicas, además de sobrevivir al procesamiento y almacenamiento. Entre las características de un probiótico ideal, podemos destacar, además, la capacidad de resistir a las condiciones industriales de producción de alimento balanceado. Por ejemplo, especies de Bacillus son capaces de formar endósporas, lo que proporciona características de termoestabilidad, estabilidad gástrica, resistencia a sales biliares y al estrés químico y físico. Así se tornan muy atractivos para la producción animal.

Selección de los probióticos

Con el objeto de seleccionar la cepa ideal para un probiótico, se testearon más de 800 cepas de la amplia colección de bacterias y hongos de Novozymes (empresa de biotecnología). Cepas de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus pumilus que la Generally Recognized as Safe (GRAS) y la Association of American Feed Control Officials (AAFCO) incluyen en su listado de cepas seguras, se aislaron independientemente y se estudiaron en el proceso de selección.Los criterios de selección fueron:

Ausencia de beta-hemólisis evaluada según recomienda la European Safety Food Authority (EFSA) en medio TSA (tryptic soy agar) + 5% de sangre de oveja (EFSA, 2011).
Ensayo de difusión radial para actividad relevante al rendimiento en diferentes patógenos.
Conformidad con la directriz de EFSA para resistencia a antibióticos (EFSA, 2012).
Además, se realizaron pruebas de termoestabilidad, estabilidad gástrica y germinación precisa para perfeccionar dicha etapa de selección.

El 32% de las 800 cepas inicialmente incluidas en la selección eran no-hemolíticas, y cerca del 10% fueron positivas en el ensayo de difusión radial. Solo 26 aisladas satisfacían todos los criterios mencionados arriba. Tras testear la susceptibilidad a los antibióticos, de acuerdo con la directriz de EFSA y la acción no inflamatoria en células Caco, solo seis cepas satisfacían los criterios planteados. A continuación, se sometieron estas cepas a pruebas in vivo en condiciones normales y con desafío; al final, solo pudo seleccionarse una cepa, Bacillus subtilis 29784, para las pruebas subsiguientes.

Con miras a estudiar la filogenia de las cepas testeadas, se llevó a cabo un análisis comparativo de las secuencias del gen gyrB. Esto se realizó esencialmente para los Bacillus subtilis y cepas de Bacillus relacionadas, utilizando secuencias parciales del gen gyrB de cerca de 1200 nucleótidos (Wang et al., 2007). Dicho análisis mostró que el Bacillus subtilis 29784 es distinto de todos los tipos de cepas de Bacillus subtilis ya conocidos y presenta diferencias considerables con relación a las subespecies Bacillus subtilis subsp. Spizizenii y Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum (cercanas en la escala filogenética). Por esto, el Bacillus subtilis 29784 fue clasificado como una nueva subespecie de Bacillus subtilis (Figura 1). El producto X del mercado presentó una estrecha relación con una cepa tradicional de Bacillus subtilis subs subtilis, pero con una diferencia del 10% en su estructura genética cuando comparado con Bacillus subtilis 29784.

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^{Figura 1 Árbol filogenético mostrando la relación entre Bacillus subtilis 29784 y las cepas de referencia de la especie Bacillus y el producto del mercado}

Se llevaron a cabo tres estudios de rendimiento en tres instalaciones de investigación diferentes con miras a testear distintas condiciones experimentales y distintas cepas de probióticos en pollos de engorde. El diseño experimental fue semejante en todos los estudios, con tres tratamientos (1- Control, 2 - Producto X y 3 - B. subtilis 29784). Se utilizaron dietas similares en los estudios, con formulación a base de harina de soya y maíz; lo que las diferenció fue la presencia o ausencia de proteína animal y fitasa. Se calcularon los niveles de nutrientes de la dieta para satisfacer los requerimientos mínimos de los animales, de acuerdo con las recomendaciones relativas al linaje. Se analizó el rendimiento animal el día 35 de vida de las aves.

Se analizaron de manera independiente los resultados de los tres estudios (Tabla 1). Bacillus subtilis 29784 mejoró significativamente el rendimiento en los tres estudios, con mejora media del 3,8% en ganancia de peso (GDP) y el 3,2% en conversión alimenticia (CA). El producto del mercado (Probiótico X) mejoró significativamente el GDP y/o la CA en solo uno de los estudios (mejora media en los 3 estudios: el 1,7% para GDP y el -2,2% para CA).

Tabla 1. Rendimiento de los pollos de engorde a los 35 días

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Además, la cepa 29784 se probó también en condiciones desafiantes, usando un modelo bien establecido de desafío de enteritis necrótica. El desafío fue perjudicial, pues elevó la mortalidad y redujo el rendimiento. Los resultados mostraron que, al añadirse Bacillus subtilis 29784, se recuperó el rendimiento animal (ganancia de peso y conversión alimenticia), con resultados estadísticamente similares a los de los animales no desafiados y los animales suplementados con APC (Rhayat et al., 2017).

Una serie de pruebas experimentales y a campo han estado mostrando la consistencia del Bacillus subtilis 29784 en diferentes situaciones. Una de dichas evaluaciones consistió en que observamos que la cepa de Bacillus subtilis 29784 puede sustituir, de manera eficaz y consistente, el uso de enramicina en dietas de pollos de engorde alimentados con dietas que contienen distintos niveles de energía metabolizable aparente (EMA). En resumen, el Bacillus subtilis 29784 mejoró el peso final, la conversión alimenticia y el índice de eficiencia productiva (IEP) de los pollos de engorde con relación a enramicina 10 ppm (Quinteiro-Filho et al., 2018).

Discusión

Bacillus subtilis pertenece a una especie bacteriana que abarca una diversidad genética bastante amplia, lo que se percibe al comparar los análisis de secuenciamiento de su genoma (Earl et al., 2012). La especificidad de las cepas resulta crucial cuando se trata de la eficacia del probiótico, y se requiere de un proceso de selección sumamente riguroso para obtener un probiótico seguro y funcional. Nuestros estudios profundizados sobre la interacción huésped-microorganismo demostraron mejoras en la salud general del intestino, tales como en la integridad de la barrera intestinal, en la función inmunológica y la reducción de la inflamación en el intestino delgado de aves. La consistencia que se observó en ensayos in vivo con Bacillus subtilis 29784 sugiere que esta cepa es la que más naturalmente se comporta en el sistema intestinal de pollos de engorde, y es más eficiente que las cepas ya conocidas y utilizadas en avicultura.

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