Primera evidencia de la detección de la cepa de bronquitis Asia/South America II (A/SAII) en pollos comerciales de Perú

IBV es el principal patógeno viral presente en todas las regiones con producción avícola intensiva (OIE World Organization for Animal Health 2008). La enfermedad es altamente contagiosa, manifestando severos signos clínicos como: afecciones del tracto respiratorio, daño a los riñones y sistema reproductivo (Cavanagh 2007), reduce la producción de huevos, como también incrementa la susceptibilidad a otras infecciones permitiendo el ingreso de otros patógenos.

Las mutaciones y la recombinaciones en el virus incrementa la aparición de nuevos serotipos (y genotipos) con baja o nula protección cruzada entre variantes (Mo et al. 2013). IBV pertenece al género Gammacoronavirus, familia Coronaviridae, orden Nidovirales (International Committee on Taxonomy of Viruses 2014), y su genoma consiste de ARN de hebra simple de sentido positivo de aproximadamente 27,6 kilobases. Codifica 4 proteínas estructurales que son esenciales: La glicoproteína de la espícula (S), la glicoproteína de membrana (M), la nucleocapside (N) y la envoltura (E) (Mo et al. 2013).

La proteína S es clivada post-traduccionalmente en 2 sub-unidades: La S1 y la S2. La sub-unidad S1 es considerada como el principal inductor de la respuesta inmune por poseer epítopes antigénicos asociados a 3 regiones hipervariables (HVR 1, 2 y 3) (Cavanagh et al. 1988; Bourogâa et al. 2012). La región que codifica la sub-unidad S1 es aproximadamente de 1644 nucleótidos de longitud, y su secuencia de aminoácidos puede diferir hasta 50% entre serotipos. Esto ocasiona que la región codificante de S1 sea un blanco ideal para genotipificación de las cepas de IBV, el cual ha sido analizado con técnicas moleculares previamente citadas en la literatura científica (Mondal & Cardona 2007; Ababneh et al. 2012). En el presente estudio, hemos han genotipificado un aislado de IBV de una granja del norte del Perú obtenido el 2014.

Las muestras fueron obtenidas de un pollo broiler proveniente de granjas del norte de Lima-Perú en 2014. La sintomatología clínica de las aves afectadas se caracterizó por inflamación del riñón con un color pálido y presencia de cristales de urato en los túbulos. Hubo escasa mucosidad en las tráqueas. La información sobre la mortalidad y morbilidad no pudo ser obtenida. Las tráqueas y riñones frescos fueron homogenizados en PBS estéril, clarificados, filtrados a 0.22 µM e inoculados en la cavidad alantoidea de huevos embrionados libres de patógenos (SPF). El fluido alantoideo (FA) fue cosechado después de 72 horas, confirmándose la presencia de IBV en la muestra inicial y en el FA por PCR (RT-PCR en tiempo real) (Meir et al. 2010) (datos no mostrados) y al aislado positivo se le designó como VFAR47.

El ARN viral proveniente del tejido homogenizado y del FA fue extraído usando el kit QIAamp MinElute Virus Spin (Qiagen) de acuerdo a instrucciones del fabricante. La amplificación de gene S fue realizada en un volumen final de 25 µl, 0.6 µM de cada primer (Feng et al. 2012) y 5 µl de ARN con el kit Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen) con 50°C de incubación inicial por 30 minutos, 95°C por 15 minutos, 40 ciclos (94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos) y 72°C por 5 minutos, en el termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

Los productos obtenidos fueron analizados en gel de agarosa al 2% y enviados a secuenciar por triplicado a la empresa koreana Macrogen. La secuencia obtenida fue revisada y depositada en el GenBank con el código KT159229. Los análisis bioinformáticos se realizaron en el programa MEGA 6 (Tamura et al. 2013) usando diversas cepas referenciales de IBV (Martin et al. 2014).

El alineamiento múltiple fue realizado usando el algoritmo ClustalW considerando los codones. Para la reconstrucción filogenética se hizo un árbol inicial usando el algoritmo Neighbour-joining, y a partir de allí se hizo un nuevo árbol filogenético inferido con el algoritmo Minimum Evolution con el modelo Maximum composite likehood, una tasa de variación entre posiciones y con 1000 repeticiones de bootstrap para asignar niveles de confiabilidad entre las ramas generadas. El árbol filogenético ha mostrado que la cepa VFAR47 pertenece a la rama tipo-LDL (Han et al. 2011).

La cepa representativa del grupo tipo-LDL (IBV cepa CK/ CH/LDL/971) fue reportada en China en 1996 (Yu et al. 2001), encontrándose por primera vez implicaciones en el proventrículo y nefritis en pollos, pero recientemente también se han reportado aislados a partir de tráqueas. La cepa de IBV CK/CH/LDL/971 represento el 3.2 % del total de cepas de IBV aisladas en China en un estudio de 15 años (Han et al. 2011).
Las cepa del genotipo A/ SAII han sido reportadas previamente en otros países de Sur América como Chile, Colombia (Jackwood 2012), Uruguay y Argentina (Marandino 2013; Marandino et al. 2015); pero no en el resto del continente. La distancia geográfica existente entre Sur América y China genera diversas hipótesis sobre la dispersión del genotipo de la cepa A/SAII en Latinoamérica.
Este virus podría haber llegado a Sur América por medio de las aves migratorias, ó por el intercambio comercial de pollos infectados (Marandino et al. 2015), ó la importación de vacunas basadas en IBV tipo-LDL.
Éstas cepas vacunales pudieron haber revertido o ganado virulencia después de pasar de entre aves, siendo capaz de establecerse como una infección latente (Liu et al. 2006). Esta última hipótesis es preocupante porque esta posibilidad representa un peligro para la salud pública que puede extender a todas las granjas que utilicen éstos tipos de vacunas, por ello se hace indispensable realizar mayores estudios para descartar esta posibilidad.