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Perspectiva del Diagnóstico en Aves

Publicado el: 13/6/2010
Autor/es: MVZ MC Juan Carlos Valladares de la Cruz, Asesoría Avícola Independiente. Nuevo León, México
OBJETIVO: Actualizar sobre los nuevos desarrollos tecnológicos para el diagnóstico de enfermedades de importancia sanitaria y económica en las aves de producción comercial.


INTRODUCCION:


El incremento en la tecnificación de la industria avícola moderna ha modificado los sistemas de producción, manejo y alimentación de las aves destinadas a la producción comercial, para hacer a ésta industria más eficiente y competitiva.

La modernización de la Industria Avícola se ha debido a la integración de grandes compañías de producción y a la globalización de la economía y la comercialización de los productos agropecuarios. Factores inherentes a temas como la seguridad alimentaria, la protección al medio ambiente, el cuidado del bienestar animal y las restricciones en el uso de antibióticos en la alimentación animal han modificado las características de los sistemas de Producción. La Industria Avícola Mexicana es la principal proveedora de proteína de origen animal para la población, a través del huevo y la carne de pollo.

La Patología Aviar también ha evolucionado a través del tiempo. La selección genética de las aves ha modificado la fisiología y el desarrollo corporal, los requerimientos nutricionales y la susceptibilidad a diversas enfermedades. Los agentes infecciosos han evolucionado, apareciendo adaptaciones, mutaciones, variantes e incluso la nuevos agentes, lo que ha modificado la presentación de las enfermedades y la aparición de nuevos Síndromes Multifactoriales y Metabólicos. Los sistemas de diagnóstico en aves comerciales están enfocados a la detección de las enfermedades que afectan la salud y la productividad de las aves, a la detección de los padecimientos que afectan la calidad de los productos avícolas y a la detección de los agentes que afectan a la salud de los consumidores.


RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL LABORATORIO DE DIAGNOSTICO


Para que los resultados de los estudios de laboratorio sean útiles, los análisis deben estar incluidos dentro de un programa de trabajo constante y permanente como parte del sistema de producción. El uso constante del laboratorio permite crear un historial de pruebas y resultados cuya interpretación es más fácil y adecuada; la interpretación de un solo grupo de resultados es difícil y puede conducir a conclusiones erróneas. Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas técnicas, los mismos reactivos y personal constante para minimizar los errores atribuidos a los procedimientos utilizados. Las técnicas usadas deben estar estandarizadas (científicamente validadas y universalmente aceptadas), considerando su sensibilidad, especificidad, repetibilidad y reproducibilidad; además deben ser prácticas, accesibles y no ser demasiado costosas; las ventajas que se obtienen con su uso deben ser superiores al costo del análisis. Los resultados deben ser relevantes y de presencia cuantificables.


CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES DE LAS AVES


De manera similar a lo ocurre con las demás especies domésticas, las enfermedades de las aves se han clasificado de acuerdo impacto potencial en términos socioeconómicos, de sanidad animal, de salud pública y de comercio nacional e internacional de aves y sus productos.

La Organización Mundial de Salud Animal (OIE) clasifica a las enfermedades en dos listas, la Lista A, que incluye enfermedades transmisibles con un gran potencial de rápida diseminación internacional, consecuencias graves de tipo socio económico y/o de salud publica y/o en el comercio internacionales de animales y sus productos, en aves las enfermedades son la Influenza Aviar Altamente Patógena y la Enfermedad de Newcastle. La Lista B, incluye enfermedades transmisibles que tienen efectos considerables de tipo socio económico y/o de salud pública dentro de los países y que pueden ser importantes para el comercio internacional de animales y sus productos.

En México se tiene una clasificación equivalente descrita en el acuerdo de reporte de enfermedades del SIVE publicado en el DOF del 20/09/2007, donde las enfermedades de clasifican en tres Grupos: Grupo 1: Enfermedades Exóticas de reporte inmediato: Influenza Aviar (excepto IABP H5N2, Clamidiosis y Bronquitis Infecciosa (excepto Conn. Mass). Grupo 2: Enfermedades Enzoóticas, transmisibles de gran impacto sanitario y/o económico y/o de salud pública: Enf. de Newcastle y Salmonelosis Aviar (S gallinarum) . Grupo 3: Enfermedades Enzoóticas de menor riesgo sanitario y/o económico y/o de salud pública.
En el Cuadro 1 se observa la comparación de la clasificación de las enfermedades entre México y la OIE.
Cuadro 1.- Clasificacion de las enfermedades de las aves en Mexico y en OIE
 
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 1

VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA E INFRAESTRUCTURA DIAGNOSTICA:

1.- Enfermedades bajo control oficial.
Existen tres enfermedades de las aves bajo control oficial, cada una con una campaña para el control y erradicación sujeta a una Norma Oficial Mexicana.
Estas enfermedades son Salmonelosis Aviar por Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum; la Enfermedad de Newcastle, presentación velogénica y la Influenza Aviar. La SAGARPA tiene registrados en la actualidad 27 laboratorios autorizados para las estas pruebas de diagnóstico. Los Laboratorios están localizados en 20 de los 32 estados de la Republica Mexicana (Figura 1) Existen además 2 laboratorios oficiales de referencia (CPA para Influenza Aviar y CENASA para Enf. de Newcastle y Salmonelosis Aviar).
Las pruebas oficiales utilizadas en las campañas oficiales el número de laboratorios que las realizan se observan en el Cuadro 2.


Figura 1.- Localización geográfica de los laboratorios de diagnóstico que realizan pruebas para las campañas avícolas.
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 2
 
Cuadro 2.- Pruebas Oficiales para las campañas de control y erradicación de Salmonelosis Aviar, Enfermedad de Newcastle e Influenza Aviar en México.
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 3

 
CAMPAÑAS OFICIALES: PERSPECTIVAS A FUTURO Y CONCORDANCIA CON LINEAMIENTOS INTERNACIONALES:

En el caso de las enfermedades bajo campaña, existen algunas diferencias de las pruebas utilizadas en México con los lineamientos Internacionales sugeridos por la OIE, que contemplan, además de las técnicas tradicionales, pruebas basadas en Biología Molecular, con los objetivos de obtener una mayor sensibilidad, un diagnóstico mas rápido y una clasificación más precisa de los agentes, particularmente virales. (Cuadro 3). Actualmente estas técnicas están en período de validación y estandarización en la mayoría de los países.

El establecimiento de estas técnicas como pruebas oficiales de campaña implica para los laboratorios una inversión importante el la compra del equipo requerido y de la infraestructura del laboratorio; las pruebas tiene un nivel elevado de complejidad en su realización, la conservación de las muestras puede ser difícil y se requiere de un conocimiento previo del material genético de los microorganismos para poder interpretar los resultados, lo que conduce a un costo elevado de los análisis. Estas técnicas no pueden determinar la viabilidad del microorganismo detectado.
Cuadro 3: Comparación de las pruebas oficiales para diagnostico de Salmonelosis Aviar, Enf. de Newcastle e In Influenza Aviar en México y en OIE
 
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 4
2.- Enfermedades sin control oficial:
El resto de las enfermedades de las aves no están sujetas a alguna normatividad que regule la metodología de diagnóstico. Existen en México alrededor de 15 laboratorios que hacen pruebas para estas enfermedades de las aves, pertenecientes a Universidades o a Compañías Privadas. En general la infraestructura diagnóstica es similar entre los laboratorios y las pruebas realizadas rutinariamente son de patología (necropsias e histopatología), serología, parasitología, microbiología (bacteriología, micología, virología) y análisis químicos. En algunos centros de Investigación se han desarrollado laboratorios para pruebas de biología molecular y/o de toxicología.
En el Cuadro 4 se resume el tipo de pruebas que se realiza en los laboratorios dedicados al diagnóstico de enfermedades de las aves, mencionando sus aplicaciones, ventajas, desventajas y las perspectivas de desarrollo. Las pruebas de Patología usuales son Necropsias e Histopatología. En el caso de Necropsias se busca desarrollar sistemas de registro de lesiones sistemáticos y cuantitativos, que faciliten el manejo de la información y permitan realizar análisis estadísticos con facilidad. En Histopatología se busca estandarizar técnicas inmunohistoquímicas (ej, peroxidasa) que permitan la detección específica del agente al mismo tiempo que se evalúan las lesiones microscópicas.

En el caso de Serología, las perspectivas incluyen el desarrollo de antígenos nuevos que permitan una mayor especificidad de las pruebas, particularmente en los casos en los que los agentes están sufriendo mutaciones o modificaciones constantes (BI, IA) y el desarrollo de sistemas tipo "DIVA" para la diferenciación de animales infectados de animales vacunados.

En el caso de Parasitología, el desarrollo esta orientado a detectar los patrones de resistencia hacia los agentes anticoccidianos y las diferencias antigénicas entre las coccidias (ej. E maxima).

En las pruebas de Microbiología, la tendencia del desarrollo es establecer una metodología que incremente la sensibilidad de las pruebas, que tipifique con mayor exactitud al agente y que detecte marcadores de virulencia. Las pruebas rápidas en placas y los estuches automatizados de identificación para bacterias y hongos reducen sustancialmente los tiempos de análisis. El aislamiento viral mas utilizado es con el uso de embriones de pollo, sin embargo, algunas asociaciones de protección a los animales estas cuestionando fuertemente este sistema de diagnóstico Es posible detectar la presencia de antígenos específicos en las muestras con antisueros marcados con fluoresceína o peroxidasa, que requieren estandarización de los reactivos.

Los métodos más modernos para la detección de patógenos aviares utilizan la tecnología de la biología molecular y se basan en la detección del material genético (DNA o RNA) del agente. Para poder realizar la identificación se requiere tener una cantidad suficiente de material genético, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles) permite amplificar la cantidad de DNA hasta niveles detectables, posteriormente la identificación específica del material genético se puede realizar por diferentes técnicas. Estas técnicas se basan en la detección de una porción altamente específica del genoma de los microorganismos. Las ventajas de estas técnicas incluyen su rapidez, su alta sensibilidad y la posibilidad de tipificación de los microorganismos. Las desventajas de estas técnicas incluyen su costo, su elevado nivel de tecnología, la complejidad en la conservación de las muestras, y el requerir del conocimiento del material genético de los microorganismos; estas técnicas no pueden determinar la viabilidad del microorganismo detectado.

Existen pruebas para la detección y pruebas para la tipificación de los microorganismos. Las pruebas de detección incluyen PCR, RT-PCR, PCR en Tiempo Real y PCR Anidada. En las pruebas clásicas de PCR se amplifica e identifica una porción conocida del DNA. La identificación se realiza por tamaño y peso molecular en geles de agarosa o por hibridación con una sonda marcada para ser identificada (dot-blot). En la prueba de RT-PCR el genoma de los virus RNA es convertido en DNA con una enzima Retrotransciptasa, para posteriormente ser amplificado.

En la Prueba de PCR en Tiempo Real, la prueba es cuantitativa, tiene mayor sensibilidad y la detección de los fragmentos amplificados es inmediata, sin el uso del paso de separación e identificación en geles de Agarosa. La prueba de PCR Anidada es una doble prueba de PCR, la segunda reacción usa como patrón el producto amplificado de la primera reacción, lo que aumenta su sensibilidad y puede hacerse de manera cuantitativa, puede utilizarse para tipificar algunos virus. Las pruebas de tipificación son capaces, además de identificar al microorganismo, de tipificarlo y clasificarlo. En la prueba del Análisis del Polimorfismo de los Fragmentos de Restricción (PCR-RFLP), el DNA amplificado es cortado con diferentes enzimas de restricción y y el patrón de los cortes se compara con un patrón conocido de un agente en particular.

En la prueba de Análisis de DNA Polimorfo Ampliado al Azar (PCR-RAPD) el DNA es ampliado en pequeños fragmentos que también son separados por electroforesis para obtener un patrón de bandas que se compara con un patrón conocido; se utiliza para microorganismos con DNA mas complejo. La secuenciación genética es la prueba más específica, En esta prueba el material genético ampliado posteriormente es analizado para identificar el orden de los nucleótidos que lo componen utilizando nucleótidos marcados con fluorocromos. Posteriormente estas secuencias son comparadas con secuencias conocidas del microorganismo para determinar que grado de similitud genética existe entre ellos para poder clasificarlos; generalmente la comparación se hace con secuencias conocidas publicadas en Internet (Gen Bank) que permiten comparar la secuencia obtenida con secuencias de todo el mundo de manera rápida y sencilla.

Para realizar estas comparaciones es necesario el uso de programas bioinformáticos que comparan y agrupan estas secuencias en función de sus similitudes. La forma gráfica mas sencilla de representar las similitudes de todas las cepas comparadas es un árbol filogenético.

Para las pruebas de análisis Químicos y Toxicología el objetivo es desarrollar una metodología que aumente la sensibilidad a nivel de picogramos o nanogramos, como las espectrometrías de masas, infrarroja y absorción atómica y las cromatografias de gases y de líquidos de alta resolución, para garantizar mayor sensibilidad, mayor precisión, mayor reproducibilidad y garantizar la inocuidad alimentaria y las exigencias del comercio internacional.


SISTEMA DE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD


Todos los laboratorios deben de contar con un Sistema de Aseguramiento de Calidad que constate la confiabilidad de los resultados, incluyendo Políticas de Calidad, control de calidad en insumos, equipos y procesos, uso de patrones de referencia y trazabilidad de los sistemas de medición y procedimientos de reconfirmación de resultados. Puede haber discrepancias entre los resultados obtenidos y los esperados, eventualmente pueden presentarse errores en los análisis.
Los errores en un resultado pueden ser atribuidos a la prueba, a la muestra o al sistema de muestreo.

Un Resultado Falso Negativo, es decir, un resultado erróneamente negativo en una muestra positiva puede ser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una sensibilidad baja; Error en el tiempo de muestreo (un muestreo precoz o un muestreo tardío); muestra no representativa: número inadecuado de muestras, selección inadecuada de las muestras; concentración baja del agente en la muestra; inactivación del agente en la muestra.

Un Resultado Falso Positivo, es decir, un resultado erróneamente positivo en una muestra negativa puede ser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una especificidad baja; contaminación cruzada de la muestra durante el muestreo; contaminación cruzada entre las muestras; contaminación de la muestra en el laboratorio; reacciones cruzadas por agentes similares; reacciones inespecíficas.

Cuadro 4.- Metodología actual y perspectiva de desarrollo de las pruebas de laboratorio aplicadas en las aves.
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 5
 
Cuadro 4b.- Metodología actual y perspectiva de desarrollo de las pruebas de laboratorio aplicadas en las aves (continuación)
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 6
 
Cuadro 4c.- Metodología actual y perspectiva de desarrollo de las pruebas de laboratorio aplicadas en las aves (continuación)
Perspectiva del Diagnóstico en Aves - Image 7
 
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA 
- A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, 1998. Published by The American Association of Avian Pathologist, University of Pennsylvania, USA.
- C. Riddell: Avian Histopathology, Published by The American Association of Avian Pathologist, University of Pennsylvania, USA, 1987.
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- Grain Inspection Handbook. U. S. Department of Agriculture. Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration. Federal Grain Inspection Service, 1997.
- Long, P., B. Millard, L. Joyner and C. Norton: A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria. Latina VI: 200-217, 1976
- Manual de Procedimientos Técnicos de Laboratorio, 5° Edición 2007. , Laboratorio de Control de Calidad y Patología Aviar, PAPSA, editado por MVZ J.C. Valladares, 2007
- NCCLS. Performance Standars for Antimicrobial disk and Dilution Susceptibility Test for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard. NCCLS Document M31A (ISBN 1-56238-37739), 1999.. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA.
- NOM-005-ZOO-1993, Campaña Nacional contra la Salmonelosis Aviar
- NOM-013-ZOO-1994, Campaña Nacional contra la Enfermedad de Newcastle
- NOM-044-Z00-1994, Campaña Nacional contra la Influenza Aviar, modificada el 30 de enero de 2006
- Officials Methods of Analysis of A.O.A.C. International, 17ª Ed.2002. Edited by Dr William Horwitz. AOAC International, USA
- OIE Manual of Diagnostic Test and and vaccines of terrestrial Animals 5TH Edition, 2004
- Tejada, I.: Control de Calidad y análisis de alimentos para animales, México, 1992.
- United States Pharmacopeia, the National Formulary, USP 27 NF22, 2004 The United States Pharmacopeial Convention, Inc, USA

PRESENTADO EN EL XXI CONGRESO PANAMERICANO DE CIENCIAS VETERINARIAS 2008 y 16° REUNION ANUAL DEL CONSEJO TECNICO CONSULTIVO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL (CONASA), EN EL FORO: INFRAESTRUCTURA Y OPERACIÓN DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO, DEL 12 AL 16 DE OCTUBRE DEL 2008
 
Autor/es:
Consultor independiente en Diagnóstico y Patología Aviar. Control y Prevención de enfermedades en Avicultura; y Jefe de la Sección de Ciencias de la Salud Animal del Departamento de Ciencias Biológicas (Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán - UNAM)
 
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