La importancia de los marcadores de la salud intestinal en la evaluación de probióticos

La salud intestinal es uno de los temas más relevantes de la avicultura en los últimos años. Son varios los factores que intervienen en la salud intestinal y los más importantes están relacionados con la microbiota, la nutrición y la respuesta del huésped (integridad e inflamación intestinal).

No obstante, evaluar y predecir la salud intestinal es muy complejo y a menudo inexacto. Aun así, los marcadores intestinales son necesarios para (1) predecir los problemas de rendimiento, (2) evaluar la eficacia de las estrategias de salud intestinal, (3) justificar las intervenciones de producción y (4) probar los cambios nutricionales y las nuevas herramientas de diagnóstico.

En el campo se han utilizado varios marcadores relacionados con la salud intestinal para ayudar a supervisar el estado de salud de las aves de corral. A pesar de ello, la eficacia de dichos marcadores sigue siendo discutida, principalmente debido a la dificultad de establecer criterios científicos y a los problemas para establecer una muestra ideal y estadísticamente aceptable.  Además, algunos de estos marcadores tienen una baja correlación directa con los parámetros

Sin embargo, algunos marcadores han sido probados y utilizados exhaustivamente, lo que proporciona una mayor seguridad a los usuarios, sobre todo porque cuentan con una base científica probada.  Entre dichos marcadores, los sistemas de puntuación macroscópica mediante necropsias, los análisis histopatológicos y morfométricos, el análisis de la microbiota y los metabolitos intestinales son metodologías que presentan una correlación positiva con el estado de salud intestinal de las aves.

El objetivo del presente artículo es revisar algunas metodologías de evaluación de la salud intestinal en aves de corral y plantear cómo se han comprobado los efectos del probiótico Alterion®, una cepa exclusiva del Bacillus subtilis (29784), en la modulación de esos marcadores de salud intestinal.

En general, la evaluación y clasificación mediante puntuaciones macroscópicas se realiza tras la muerte o el sacrificio de los animales enfermos. Ahora bien, en avicultura, la realización de necropsias con el fin de controlar el estado de salud es habitual y de extrema importancia para el diagnóstico y el control de las enfermedades. La aplicación de puntuaciones macroscópicas de las lesiones se realiza durante la inspección necroscópica de un ave y, hoy en día, se considera como la principal herramienta para el seguimiento de la salud intestinal en la avicultura.

Se pueden observar varias metodologías de puntuación en el campo. Sin embargo, la metodología publicada por Teirlynck y colaboradores (2011) demostró ser sencilla de aplicar y fácil de controlar. Además, el sistema de puntuación de las lesiones macroscópicas mostró una correlación negativa en relación con la longitud de las vellosidades y una correlación positiva con la infiltración de linfocitos T en situaciones de disbacteriosis (Figura 1a y 1b).

Figura 1a. Correlación de la puntuación macroscópica con la longitud de las vellosidades y el infiltrado de linfocitos T.

Figura 1b. Correlación de la puntuación macroscópica con el infiltrado de linfocitos T.

Utilizando la metodología de Teirlync y colaboradores se realizó una prueba con desafío nutricional mediante la inclusión de un 20% de centeno, induciendo un aumento en el contenido de PNA (polisacáridos no amiláceos) de las dietas, y posteriormente se evaluaron los efectos del probiótico Alterion^® (Bacillus subtilis 29784). La puntuación de la enteritis bacteriana se redujo a 1,0 en los animales del grupo Alterion^®, mientras que los animales del grupo de control (sólo desafiados con PNA) mantuvieron una puntuación de 2,0 (Figura 2). Este estudio demostró que es posible verificar los efectos del probiótico Alterion^® mediante una metodología de evaluación de puntuación macroscópica.

Figura 2: Alterion^® (Bs 29784) disminuye la puntuación macroscópica en pollo de engorda desafiado con altos niveles de polisacáridos no amiláceos (PNA).

Tras los análisis macroscópicos, se recolectaron muestras intestinales para realizar evaluaciones microscópicas. Estas evaluaciones pueden ser histomorfométricas, cuando se miden las estructuras intestinales como la altura de las vellosidades, el grosor de las criptas y la relación vellosidades/criptas; e histopatológicas, cuando se evalúan las lesiones en el epitelio intestinal (mucosa y submucosa) y las capas adyacentes. Se han desarrollado algunas metodologías para facilitar una evaluación histológica mediante la aplicación de sistemas de puntuación para diferentes parámetros de la mucosa intestinal, por ejemplo: el grosor de la lámina propia, el grosor epitelial, la proliferación de enterocitos, el infiltrado de células inmunes, la proliferación de células de Globet y la presencia de ooquistes (Kraieski et al., 2017; Belote et al., 2018, 2019).

De hecho, las evaluaciones histomorfológicas del intestino pueden ayudar a evaluar la integridad epitelial y la inflamación (Gholamiandehkordi et al., 2007). Además, algunos estudios asocian el aumento de la altura de las vellosidades, el grosor de la lámina propia y la cantidad de células epiteliales con un mayor peso corporal de las aves (Kraieski et al., 2017). En los estudios realizados con el probiótico Alterion^®, observamos un aumento significativo de la longitud de las vellosidades en comparación con el grupo de control (sin aditivos para la salud intestinal) en el íleon (control = 0,66 µm; Alterion^® = 0,79 µm, P<0,05) y en el ciego (control = 1,25 µm; Alterion^® = 1,46 µm, P<0,05). La tabla 1 resume los resultados encontrados (Jacquier et al., 2019).

Tabla 1: Morfología del íleon y del ciego en pollos de engorda de 42 días suplementados con Alterion^® (tabla adaptada por Jacquier et al., 2019).

No obstante, sabemos que los simples análisis morfométricos no son suficientes para evaluar el estado de integridad del epitelio intestinal. De este modo, la adición de evaluaciones histológicas a través de puntuaciones de diferentes parámetros ayuda en el análisis de la estructura epitelial. De hecho, utilizando la metodología publicada por Kraieski et al. (2017), denominada ISI (I see inside), observamos que el probiótico Alterion^® disminuyó la puntuación ISI cuando se comparó con el grupo control negativo (sin aditivos) y el grupo de antibióticos (enramicina 10 ppm) en aves desafiadas bajo un modelo experimental de enteritis necrótica (Figura 3 y 4). En concreto, destaca la disminución del grosor de la lámina propia y del epitelio de la mucosa, así como la disminución del infiltrado inflamatorio en estas dos regiones (Figura 3; Tirano et al., 2019). Estos datos comprueban el potencial del probiótico Alterion^® para mejorar la integridad y modular la inflamación epitelial en situaciones con o sin desafío.

Figura 3: Efectos de Alterion^® en la puntuación microscópica del ISI en pollo de engorda de 14 días desafiado bajo el modelo de enteritis necrótica.

Figura 4: Alterion^® disminuye la puntuación ISI en pollo de engorda desafiado con enteritis necrótica.

El análisis de la microbiota intestinal de las aves sigue siendo considerado como una herramienta compleja y de poca utilidad en la rutina diaria de la industria avícola. Sin embargo, esta tecnología se ha popularizado y varios estudios han observado importantes correlaciones con la salud intestinal y los índices zootécnicos. La evaluación de la microbiota intestinal desde una perspectiva ecológica podría aportar conocimientos sobre cómo promover la salud a través de la nutrición, modulando comunidades microbianas específicas.

La microbiota puede clasificarse como resistente cuando la población microbiana tiene una mayor diversidad y un mayor número de bacterias con propiedades antiinflamatorias (bacterias productoras de butirato como Ruminococcaceae spp y Lachnospiraceae spp) y menos patógenos oportunistas como Clostridiumperfringens y Enterobacteriaceae spp, así como Salmonella spp y Escherichiacoli. Varios estudios han demostrado los beneficios de ampliar los Firmicutes o de aumentar la proporción Firmicutes/Bacteroidetes. Entre los Firmicutes productores de butirato, destaca la disminución de la población de Faecalibacteriumprausnitzii, que demuestra ser un marcador importante en situaciones patógenas específicas. De hecho, Faecalibacteriumprausnitzii presenta propiedades antiinflamatorias, en parte relacionadas con la secreción de metabolitos que bloquean la activación del factor de transcripción nuclear kB (NF-kB) y la secreción de interleucina 8 (IL-8) (Sokol et al., 2008).

El análisis de la microbiota intestinal de las aves sigue siendo considerado como una herramienta compleja y de poca utilidad en la rutina diaria de la industria avícola. Sin embargo, esta tecnología se ha popularizado y varios estudios han observado importantes correlaciones con la salud intestinal y los índices zootécnicos. La evaluación de la microbiota intestinal desde una perspectiva ecológica podría aportar conocimientos sobre cómo promover la salud a través de la nutrición, modulando comunidades microbianas específicas.

La microbiota puede clasificarse como resistente cuando la población microbiana tiene una mayor diversidad y un mayor número de bacterias con propiedades antiinflamatorias (bacterias productoras de butirato como Ruminococcaceae spp y Lachnospiraceae spp) y menos patógenos oportunistas como Clostridiumperfringens y Enterobacteriaceae spp, así como Salmonella spp y Escherichiacoli. Varios estudios han demostrado los beneficios de ampliar los Firmicutes o de aumentar la proporción Firmicutes/Bacteroidetes. Entre los Firmicutes productores de butirato, destaca la disminución de la población de Faecalibacteriumprausnitzii, que demuestra ser un marcador importante en situaciones patógenas específicas. De hecho, Faecalibacteriumprausnitzii presenta propiedades antiinflamatorias, en parte relacionadas con la secreción de metabolitos que bloquean la activación del factor de transcripción nuclear kB (NF-kB) y la secreción de interleucina 8 (IL-8) (Sokol et al., 2008).

Figura 5: Diversidad de la microbiota en muestras de contenido cecal de pollos de engorda suplementados con Alterion^® (adaptado por Keerqin et al., 2021).

Tabla 2: Efectos del probiótico Alterion^® en la microbiota del ciego (tabla adaptada por Jacquier et al. 2019; Poultry Science 98:2548-54).

Por último, no podemos olvidar los metabolitos microbianos, los cuales pueden también estar relacionados con la salud intestinal. Como se ha mencionado anteriormente, las bacterias de la microbiota convierten los carbohidratos complejos (como el PNA), la fibra e incluso las proteínas en una serie de metabolitos que tienen diversos efectos en la salud de los animales. Un ejemplo ya mencionado sería la transformación de los PNA que da lugar predominantemente a la producción de ácidos grasos de cadena corta como el butirato y el propionato.  

Otros metabolitos están asociados a la integridad intestinal, como la hipoxantina, el pantotenato y el ácido nicotínico, que están estrechamente relacionados con el control de los procesos inflamatorios y la restauración de los tejidos. El ácido nicotínico (niacina) activa el receptor GPR109A (un tipo de receptor nicotínico) en el epitelio intestinal, suprimiendo la inflamación local (Singh et al., 2014).

Figura 6: El ácido nicotínico modula la inflamación en el intestino de las aves (adaptado por Singh et al. 2014; Immunity. 16; 40(1): 128-139).

Se ha demostrado que el ácido nicotínico aumenta la proliferación de enterocitos y la "cicatrización" epitelial en un modelo in vitro con células CaCo-2. Además, observamos que la suplementación con el probiótico fue capaz de aumentar los niveles de ácido nicotínico en el lumen del íleon y el yeyuno del pollo de engorda de 13 días (P < 0,01), revelando uno de los mecanismos de acción de Alterion^® en la salud intestinal de las aves de corral (Figura 7).

Figura 7: Contenido de ácido nicotínico en el íleon y el yeyuno de pollo de engorda suplementado o no con Alterion^®.

Se han desarrollado numerosas tecnologías moleculares para apoyar la comprensión de la salud intestinal, como la metagenómica, la metabolómica (¿Cuál es el término en inglés? Esta palabra no tiene sentido en español, a menos que sea nueva), el metatranscriptoma, etc.; actualmente forman parte de la línea de investigación de numerosos grupos de investigación y empresas en el campo de la avicultura. Aun así, debido a la complejidad del intestino de las aves de corral, la replicación de estas metodologías en el campo es un gran reto para los profesionales de la avicultura.

En resumen, en el presente artículo se han revisado algunos de los marcadores importantes de la salud intestinal de las aves de corral, que pueden utilizarse tanto en el ámbito académico como en aplicaciones prácticas de campo. La evaluación de los efectos de un aditivo nutricional en la salud intestinal requiere del uso de varias herramientas y marcadores, y un solo factor no parece ser suficiente para evaluar el estado de salud intestinal de un ave. Como podemos ver, varios marcadores ya pueden guiarnos en diversas estrategias de seguimiento de la integridad intestinal e incluso en la evaluación de productos probióticos. De forma reveladora, demostramos que todos estos marcadores pudieran utilizarse para evaluar y probar la consistencia del probiótico Alterion^® como herramienta para reforzar la integridad intestinal, la modulación (o el control) de la inflamación y la modulación de la microbiota.