Importancia de la detección de una proteína transportadora de hierro dependiente de TON-B en sobrenadantes de cultivos de Avibacterium Paragallinarum

Un estudio realizado con cultivos bacterianos de Pasteurela multocida (Pm) identificó como parte de sus proteínas de membrana externa (PME) un grupo de proteínas denominadas proteínas transportadoras dependientes de Ton-B (PT-dTB) mediante la técnica de desorción/ionización láser asistida por matriz o MALDITOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) (1). Lo importante de este hallazgo es la función que cumplirían estas PME para Pm, dicha función se relacionaría con la interacción con transferrinas y lactoferrinas captando iones hierro para esta bacteria. A la fecha se sabe que las PME juegan un importante rol durante la colonización, invasión, patogenicidad y además provee una protección inmune frente a la infección de bacterias gram-negativas (1). Estas mismas PTdTB son las responsables de brindar la patogenicidad a Actinobacillus pleuropneumoniae y de interferir con el metabolismo del ion hierro en el hospedero durante las infecciones con Neiseria gonorrhoeae, induciendo un decrecimiento de la respuesta inmune lo cual facilitaría la colonización (2).

Muchas de las bacterias gram-negativas incluyendo Pasteurellaceae presentan PT-dTB que están relacionadas con el transporte de este ion importante para la supervivencia de las bacterias (1). Por lo que la detección de PT-dTB en el material secretado bacteriano en condiciones de cultivos aumentaría su capacidad de toma de hierro, además, la identificación de estos PT-dTB en otros agentes patógenos como Avibacterium paragallinarum, seria de importancia para comprender su biología con el objetivo de encontrar formas de controlar esta bacteria en el sector avícola.

Se emplearon 3 serotipos de Av. Paragallinarum, FARPER-113 (SerotipoB), FARPER-114 (SerotipoA) y FARPER-140 (SerotipoC), provenientes del cepario del Laboratorio de Microbiología y Serología de FARVET SAC. Se siguieron las metodologías de cultivos y tipificaciones previamente reportados por Falconi-Agapito et al (3). Cultivos realizados en medios Brain Heart Infusion (BHI) de Av. pragallinarum (50mL) crecidos toda la noche se centrifugaron a 5,000 x g durante 30 minutos. Luego el sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de 0.45µm, alicuotado en tubos de 2mL, cuantificados por ensayos de bradford y almacenados a -80ºC hasta su posterior uso en los ensayos de ELISA. También se emplearon sobrenadantes bacterianos de Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella gallinarum 9R (ambas bacterias relacionadas con enfermedades aviares) y Bortedella bronchiseptica (bacteria no relacionada con aves) como controles de especificidad.

Para la detección de los PT-dTB en Av. paragallinarum se emplearon anticuerpos monoclonales de ratón diseñados durante el proyecto de investigación titulado: “Desarrollo de un kit para el diagnóstico diferencial y rápido de la coriza infecciosa y el síndrome de cabeza hinchada en la industria avícola” bajo el contrato: “C-184-FINCYT-FIDECOMPIPEA-2014”, en donde se seleccionaron péptidos inmunogénicos de proteínas identificadas en el genoma secuenciado de un aislado peruano Av. paragallinararum (4). Para esto también se corroboró la reactividad del anticuerpo frente a la forma recombinante de esta proteína expresada en Escherichia coli BL21 (Datos no mostrados).

Un volumen de 100µL de sobrenadante diluido en PBS (Fosfato buferado salino a pH 7.4) fue agregado a placas de ELISA (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria) e incubados toda la noche a 4ºC. Al día siguiente la placa fue lavada una vez con 150µL de wash buffer (PBS+0.05% Tween 20), bloqueada con 100 µL PBS + 0.5% suero fetal bovino e incubadas durante una hora a temperatura ambiente. Después la placa fue lavada 3 veces con 150µL de wash buffer, se agregó 100µL del anticuerpo anti-PT-dTB-Av. paragallinarum (5 y 10 µg/mL) y se incubó a 37ºC durante una hora. Pasado este tiempo la placa fue lavada tres veces con 150µL de wash buffer, se agregó 100µL del anticuerpo anti-mouse (goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Abcam, Cambridge, MA, USA)) diluido 1:5,000 y se incubó a 37ºC durante una hora. Finalmente, la placa fue lavada 4 veces con 150µL de wash buffer, se agregó 100µL de TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) (Abcam, Cambridge, MA, USA), se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se le agregó 100µL de H2SO4 2N. La placa fue leída a 450nm en un lector EON microplate reader instrument (Biotek, Winooski, VT, USA).

Todas las muestras fueron corridas por triplicadas, las lecturas se presentaron como valores de DO450nm que fueron restados del blanco técnico (sólo PBS), los análisis y gráficos fueron realizados con GraphPad Software (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA).

Mediante ensayos de ELISA empleando anticuerpos monoclonales específicos se logró detectar PT-dTB en los sobrenadantes provenientes de los cultivos de Av. paragallinarum (serotipos A, B y C). Se observó diferencias significativas (p<0.05) para los valores obtenidos de cada serotipo, siendo los sobrenadantes de los serotipos A y C los más reactivos con respecto al serotipo B. Se observó una relación entre los valores de reactividad y la concentración (µg/mL) de sobrenadante empleado (30 - 0.3 µg/mL), para los serotipos A y C se detectó una reactividad positiva hasta los 0.3µg/mL, mientras que para el serotipo B se obtuvo una reactividad positiva hasta los 3 µg/mL de sobrenadante empleado. Altas reactividades se obtuvieron para los serotipos A y C a una concentración de 30ug/mL con respecto al serotipo B evaluado a la misma concentración (Figura 1).

A lo largo de las distintas concentraciones de anticuerpos empleados (2.5; 5 y 10 µg/ mL) se observó una mayor afinidad por los serotipos A y C, y esta fue mayor cuando se empleó una concentración de 10 µg/mL de anticuerpo monoclonal y una menor afinidad a una concentración de 2.5 µg/mL. Si bien se observó afinidad del anticuerpo monoclonal por las diluciones del sobrenadante del serotipo B, esta fue baja comparada con los demás serotipos siendo esta diferencia aún más evidente a una concentración de 10 µg/ mL de anticuerpo empleado. La reactividad observada fue proporcional a las diferentes diluciones empleadas de sobrenadante para cada concentración de anticuerpo empleado (Figura 2).

Un estudio previo ha demostrado que Av. paragallinarum capta el hierro de la ovotransferrina y transferina de gallinas y pavos mediante receptores de ovotransferina, conocidas como transportadoras dependientes de tbpA y tbpB, ubicadas en la membrana externa.

Ante la posibilidad de una reactividad inespecífica por parte del anticuerpo monoclonal, se evaluaron sobrenadantes de cultivo de bacterias patogénicas causantes de otras enfermedades aviares mediante ensayo de ELISA a una concentración de 10 µg/mL de anticuerpo monoclonal. Se observó una mínima reactividad por parte del anticuerpo monoclonal frente a los sobrenadantes bacterianos de Ornithobacterium rhinotracheale, Salmonella gallinarum y Bortedella bronchiseptica. (Figura 3). Los valores de reactividad para estas otras bacterias fueron bajos comparados con los valores obtenidos para los sobrenadantes Av. paragallinarum a la misma concentración de anticuerpo (10 µg/mL) (Figura 2). De esta forma al no presentar una alta afinidad por estos sobrenadantes provenientes de cultivo bacteriano diferentes a Av. paragallinarum se estableció la especificidad del anticuerpo monoclonal por la proteína PT-dTB en sobrenadantes de cultivos bacterianos de Av. paragallinarum.

Un estudio previo ha demostrado que Av. paragallinarum capta el hierro de la ovotransferrina y transferina de gallinas y pavos (5) mediante receptores de ovotransferina, conocidas como transportadoras dependientes de tbpA y tbpB, ubicadas en la membrana externa (6). La proteína tbpB pertenece al grupo de las proteínas transportadoras dependientes de TonB (PT-dTB) (7), se ha reportado que estas PT-dTB están relacionadas en la captación o regulación de hierro y se sabe que cumplen un rol importante en la virulencia de N. gonorrhoeae, A. pleuropneumoniae y P. multocida (1). Además estas proteínas en P. multocida están formando parte de las proteínas de membrana externa (PME) los cuales han sido reportados como inmunógenos frente a desafíos homólogos y heterológos (8). En este trabajo se empleó un anticuerpo monoclonal específico para la detección de PTdTB en Av. paragallinarum. Nuestros ensayos demostraron la presencia de estas proteínas “PT-dTB” en los sobrenadantes de cultivos en Av. paragallinarum. La presencia de estas PT-dTB fue mayor en los sobrenadantes de cultivos de los serotipos A y C comparado con el serotipo B, sin embargo no se conoce sobre esta diferencia entre serotipos de Av. paragallinarum.

Es importante remarcar que la presencia de estas proteínas en Av. paragallinarum cumplen un rol en el transporte de hierro del medio exterior hacia el interior de la bacteria (6); pero su identificación en los sobrenadante de los cultivos generan nuevas interrogantes. Estos resultados son similares con lo reportado para P. multocida y sus proteínas presentes (como tbpA) en sus vesículas de membrana externa (VME) aislados a partir de los sobrenadantes de cultivos bacterianos (9). Dichas vesículas son liberadas naturalmente de la membrana externa y contienen fosfolípidos, lipopolisacridos, componentes de la pared celular, proteínas periplásmicas y PME (10). Además, estudios previos han identificado putativos factores de virulencia formando parte de las VME en los sobrenadantes de Av. paragallinarum (11), por lo que estudios futuros que impliquen los sobrenadantes de cultivos de Av. paragallinarum deben ser considerados para esclarecer la función de esta PT-dTB formando parte de las VME.

Cabe indicar que estos hallazgos se realizan en base a cultivos bacterianos obtenidos bajo condiciones de laboratorio y deben ser tomados con cuidado como una pequeña evidencia de lo que puede estar ocurriendo en el nicho natural de la bacteria. Además, existen reportes de la identificación de PT-dTB a partir de PME de Av. paragallinarum empleando la diferenciación de proteínas mediante pesos moleculares y su análisis mediante MALDI-TOF (12); sin embargo, este es el primer trabajo que emplea la detección directa de la PT-dTB mediante anticuerpos monoclonales específicos para Av. paragallinarum en sobrenadantes de cultivos.

Probablemente, esta PT-dTB se encuentre formando parte de las VME el cual obedecería a una estrategia de la bacteria para ampliar sus mecanismos de captación de este ion tan importante para su supervivencia. Por lo que el metabolismo de hierro en el desarrollo de la Coriza infecciosa aviar causada por Av. paragallinarum podría ser un factor para comprender su patogenicidad y nos sirva para buscar nuevas alternativas de control de esta enfermedad que tiene un gran impacto en el sector avícola (Figura 4).

El presente trabajo fue cofinanciado mediante el Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú), bajo el contrato 184-FINCyT-PIPEA-2014.