Un Herpesvirus de Pavo Recombinante que Expresa la Proteína F del Genotipo XII del Virus de la Enfermedad de Newcastle Generado por los Sistemas NHEJ-CRISPR/Cas9 y Cre-LoxP Confiere Protección contra un Desafío del Genotipo XII en Pollos

La enfermedad de Newcastle (ND, por sus siglas en inglés: Newcastle disease) es una enfermedad aviar altamente contagiosa con un impacto significativo en la producción avícola mundial. La ND es causada por el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés: Newcastle disease virus), antes conocido como Avian ortoavulavirus 1 (AOAV-1), perteneciente a la familia Paramyxoviridae (Consultado el 20 de octubre del 2021: (https://talk.ictvonline.org/taxonomy/). El genoma de NDV es un ARN monocatenario, no segmentado, de sentido negativo, que codifica seis proteínas estructurales: proteína de la nucleocápside (NP), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), proteína de fusión (F), proteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN), y proteína grande (L) [1, 2]. La partícula viral de NDV tiene las glicoproteínas F y HN, ambas localizadas en la envoltura del virión, que participan en la unión del virus, la entrada a la célula, en el inicio del ciclo infeccioso del virus y la liberación de la célula. La glicoproteína F ha sido considerada como un antígeno importante porque proporciona una mejor protección en comparación con HN [3].

Basado en el análisis molecular, el NDV se ha clasificado en dos clases: I y II [4]. Los aislamientos de clase I están todos agrupados en un solo genotipo y generalmente son cepas lentogénicas. Por el contrario, los aislamientos de clase II se clasifican en genotipos I-XXI, y se pueden dividir en tres grupos según su virulencia: velogénicos, mesogénicos, y lentogénicos [5].

La circulación de una cepa velogénica de NDV, perteneciente al genotipo XII, ha sido reportada en América del Sur (Colombia y Perú, subgenotipo XIIa) [6-8]. Para controlar su propagación, la mayoría de las granjas avícolas han aplicado programas de vacunación, con cepas vacunales pertenecientes a los genotipos I y II (LaSota y B1), las cuales han sido ampliamente utilizadas durante años. Estas vacunas clásicas contra la ND pueden ser tanto vivas atenuadas como inactivadas, y han demostrado una eficacia limitada para controlar la diseminación del virus y superar los altos niveles de anticuerpos maternales (MDA, por sus siglas en inglés: maternally derived antibodies) que interfieren con la eficacia de estas vacunas en la industria avícola.

Para superar estas limitaciones de las vacunas clásicas de NDV, se han explorado estrategias para expresar proteínas inmunogénicas del NDV en vectores virales. La más común utilizada es el Meleagrid herpesvirus 1 (MeAHV1), o el herpesvirus del pavo (HVT), que expresa la proteína F o HN del NDV.Estas vacunas vectorizadas son eficaces para inducir una protección completa contra el NDV [9 - 12].

El HVT, que pertenece al serotipo 3 del virus de la enfermedad de Marek (MDV, por sus siglas en inglés: Mareks’s disease virus) con un genoma de ácido desoxirribonucleico de doble cadena (dsDNA, por sus siglas en inglés: double-stranded deoxyribonucleic acid), es un alfaherpesvirus no patógeno de los pollos [13]. HVT se usa ampliamente como vacuna viva contra MDV [14], y se considera como un candidato vacunal adecuado debido a su capacidad para lograr una infección persistente, incluso en presencia de anticuerpos maternales [10], disminuir la diseminación del virus, e induce inmunidad celular y humoral de larga duración (hasta las 50 semanas de edad) con una dosis única de vacunación que se puede administrar in ovo o al primer día de edad [10, 12, 15 - 17].

El HVT también se ha utilizado ampliamente como vector viral para la expresión de antígenos heterólogos de diversas enfermedades aviares, tales como,enfermedad infecciosa de la bursa (IBD, por sus siglas en inglés: infectious bursal disease) [18], influenza aviar (AI, por sus siglas: avian influenza) [19, 20], laringotraqueítis infecciosa (ILT, por sus siglas en inglés: infectious laryngotracheitis) [21], chlamydia psittaci [22] y ND [11, 23].

Varias regiones del genoma HVT han sidoutilizadas para la inserción de genes foráneos [24], y la región intergénica UL45 y UL46 de región única larga (UL, por sus siglas en inglés: unique long) ha sido comúnmente seleccionada como el sitio de inserción [20, 25 - 29]. Se han utilizado varias estrategias para generar HVT recombinante (rHVT), incluidos los métodos clásicos de recombinación homóloga, la reconstitución de genomas virales recombinantes a partir de cósmidos superpuestos y clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés, bacterial artificial chromosome) [30]. Si bien estos métodos permiten la inserción de genes protectivos de otros patógenos aviares, estas estrategias a menudo consumen mucho tiempo y tienen muchas limitaciones [26].

El sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR, por sus siglas en inglés: clustered regularly interspaced short palindromic repeat) /Cas, es un nuevo sistema de edición de genes, derivado de un sistema inmunitario bacteriano, puede conferir la capacidad de recordar y destruir fagos como herramienta de defensa contra los invasores virales [31]. El sistema CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9)de tipo II, consiste en una endonucleasa Cas9 guiada por ARN de Streptococcus pyogenes, un ARN guía único (sgRNA, por sus siglas en inglés: single guide RNA) y el crRNA trans-activante (tracrRNA, por sus siglas en inglés: trans-activating crRNA) [32], ha sido desarrollado para la edición de células eucariotas mediante la introducción de roturas de doble cadena (DSBs, por sus siglas en inglés: double-stranded breaks) precisas y eficientes en el ácido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en inglés: deoxyribonucleic acid) [33]. Estos DSBs posteriormente se reparan mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés: non-homologous end joining), que repara el DNA mientras provoca la presencia de indeles (inserciones o deleciones) en la región, o mediante la reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés: homology-directed repair), que repara el ADN en la presencia de un donador con secuencias homólogas al DNA [34]. El sistema CRISPR/Cas9, ha demostrado ser una poderosa herramienta genética para la edición de virus de DNA como el virus de Epstein-Barr [35], el virus de la pseudorrabia [36 - 41], adenovirus [42] y virus vaccinia [43]. La tecnología CRISPR/Cas9 también se ha aplicado recientemente para editar el genoma de los herpesvirus aviares y el desarrollo potencial de vacunas virales recombinantes [26 - 29, 44 - 49].

 En este estudio, nuestro principal objetivo fue generar una vacuna vectorizada rHVT, expresando la proteína inmunogénica F (rHVT-F) de una cepa velogénica deNDV genotipo XII que circula en Perú, y evaluar la protección en pollos libres de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés: specific pathogen-free) frente a un desafío contra el NDV genotipo XII. Elegimos insertar el gen F de NDV en la región intergénica UL45-UL46 del HVT usando NHEJ-CRISPR/Cas9. El rHVT-F, fue evaluado in vitro e in vivo, para la estabilidad e integridad del casete insertado, así como para la expresión de la proteína F. Nuestros resultados confirmaron, una vez más, que los sistemas NHEJ-CRISPR/Cas9 y Cre-LoxP son un sistema rápido y eficiente para editar el genoma HVT, así como una fuente de información precisa para generar nuevos virus recombinantes. El rHVT-F se evaluó como potencial candidato vacunal en pollos frente a un desafío con el NDV genotipo XII.

Todos los procedimientos y protocolos experimentales de este estudio se realizaron siguiendo el Protocolo No. 01-2021, aprobado el 12 de agosto de 2021 por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FVMZ) de la Universidad Nacional de Hermilio Valdizán (UNHEVAL)

En este estudio se utilizaron pollos SPF de un día de edad del Laboratorio Charles Rivers. Después de la eclosión, todos los pollos fueron alojados en jaulas en un Laboratorio de bioseguridad nivel 2 (BLS-2). Se proporcionó alimento y agua con acceso ad libitum.

Para el desafío, los pollos fueron etiquetados con precintos de colores/números y trasladados a un Laboratorio de bioseguridad nivel3 (BLS-3) ubicado en FARVET S.A.C.

Después del desafío, los pollos fueron monitoreados diariamente por signos clínicos y mortalidad por 14 días. Los pollos con signos clínicos severos de ND fueron inmediatamente sacrificados/retirados y considerados como muertos.

Se prepararon células primarias de fibroblastos de embrión de pollo (CEF, por sus siglas en inglés: primary chicken embryo fibroblast) a partir de huevos embrionados SPF de 10 días de edad (Charles River Avian Vaccine Services, Norwich, CT, EE. UU.) y se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12 (1:1) 1× (DMEM 1×) (n.º de catálogo SH30004.04, HyClone, Logan, UT, USA.) suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés: fetal bovine serum) inactivado por calor (n.º de catálogo SH30066.03, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.) y 1× antibiótico-antimicótico-100× (No. de catálogo 15240062, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.) a 37 °C bajo una atmósfera con 5 % de CO2.

La cepa Fc126 de HVT de tipo salvaje (wtHVT, por sus siglas en inglés: wild-type HVT), fue obtenida del Laboratorio de oncología y enfermedades aviares (ADOL) (East Lansing, MI, USA.), se utilizó para la construcción y producción del nuevo virus recombinante.

La cepa de desafío NDV, conocida también como NDV/peacock/Perú/2011 (PP2011) (Número de acceso de GenBank: KR732614) perteneciente a la Clase II genotipo XII del NDV, con índice de patogenicidad intracerebral (IPIC, por sus siglas en inglés: intracerebral pathogenicity index) 1.80, con la característica de patotipo velogénico, fue previamente aislado y caracterizado en el Perú [7].

La secuencia de laregión intergénica UL45–UL46, del genoma HVT, fue evaluada para el diseño de los sgRNA (Consultado el 29 de mayo del 2019: https:// www.genscript.com/gRNA-design-tool.html). El plásmido px459v2.0 (No. de catálogo 62988, Addgene, Cambridge, MA, USA.) fue digerido con BbsI-HF (NEB, New England BioLabs, Ipswich, MA, USA.) y luego fue purificado utilizando con un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA, USA.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de oligo-ADN sgRNA-UL45-46-F/R, correspondientes al sgRNA de la secuencia, fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT, Coralville, IA, USA.) y clonados en el vector de clonación previamente digerido px459v2.0 para la construcción de px459v2.0-sgRNA-UL45-46. La secuencia sg-A, fue obtenida previamente de una publicación anterior [33] y que finalmente se clonó en px459v2.0 de la misma manera.

Para la construcción del plásmido donador, utilizamos el plásmido pGEM-sgA-GFP-VP2, que contenía: dos secuencias sg-A en ambos extremos, dos secuencias LoxP para la escisión del casete indicador de la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés: green fluorescent protein) y un casete de expresión de proteína VP2 flanqueado por dos sitios de restricción SfiI [27]. El pGEM-sgA-GFP-VP2 fue digerido por la enzima SfiI para eliminar el casete de expresión de la proteína VP2, obteniendo el plásmido linealizado pGEM-sgA-GFP. Se diseñó un nuevo casete de expresión F que contiene el marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés open reaading frame) de la proteína F del NDV de la cepa PP2011 del genotipo XII (Número de acceso de GenBank: KR732614), aislado previamente en Perú [7] bajo el control de un promotor de citomegalovirus murino (mCMV) y una secuencia señal poli-A (pA). Este casete fue sintetizado por GenScript (Piscataway, NJ, USA.) y posteriormente fue clonado en el plásmido pUC57 a través de los sitios de restricción SfiI. Seguidamente, el plásmido se digirió con la enzima SfiI y el casete de expresión de la proteína F se purificó para subclonarlo en pGEM-sgA-GFP. El plásmido obtenido se denominó pGEM-sgA-GFP-F-XII. La inserción del casete de expresión F en el plásmido se verificó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés: polymerase chain reaction) (datos no mostrados) utilizando cebadores específicos 1F/1R y 2F/2R (Tabla 1).

Tabla 1. Lista de las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio.

 

Las células CEF, fueron cultivadas en placas de 12 pocillos, posteriormente fueron transfectadas con 1 µg de plásmido donador y 0,5 µg de cada sgRNA usando el reactivo Lipofectamine® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.), según el protocolo del fabricante. A las 24 h post–transfección (hpt), el medio de cultivo celular fue cambiado a DMEM 1× suplementado con 2% de SFB, y la infección con wtHVT se realizó con una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés: multiplicity of infecction) de 0.01. Después de tres días, las células transfectadas/infectadas se transfirieron a placas de seis pocillos y los clones que expresaban el marcador GFP se aislaron mediante tres rondas de aislamientos de placa seleccionando placas con fluorescencia verde. Posteriormente, células individuales que expresan GFP se clasificaron en placas de 96 pocillos mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés: fluorescence-activated cell sorting) en un clasificador de células BD FACSMelody™ (BD Biosciences, San José, CA, USA.).

La inserción del casete de expresión de F de NDV en el genoma HVT, en el locus correcto, se verificó mediante PCR usando los cebadores “junction” NDV-F(XII)-5F y HVT UL46-5R (Tabla 1). La correcta inserción del casete fue confirmado de los productos de la PCR (Figura 1C). El nuevo HVT recombinante se denominó rHVT-GFP-F.

 

Figura 1. La estrategia utilizada para la generación del virus rHVT-F.  (A) El genoma del Herpesvirus de pavo (HVT, por sus siglas en inglés: Herpesvirus of turkey) wild-type(wt), es demostrado con las regiones “unique long” (UL), “unique short” (US), “terminal/internal repeat long” (TRL/IRL), y “short” (TRS/IRS). El “single guide” (sg)RNA-UL45-46, introduce un corte en la doble cadena (DSBs, por sus siglas en inglés: double-stranded breaks) en la región intergénica UL45–UL46 del genoma del wtHVT.El símbolo de la tijera (verde) representa la región específica del sgRNA-UL45-46 en la región UL45-UL46 del genoma del wtHVT. El casete de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés: green fluorescence protein) contiene: El promotor factor de elongación (pEF, por sus siglas en inglés: elongation factor promoter), el marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés: open reading frame) completo de la GFP, y la secuencia señal poly-A (pA). El casete de expresión de la proteína Fusión (F) contiene: el promotor de citomegalovirus murino (mCMV), el ORF de la proteína F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés: Newcastle disease virus), y la pA. Los casetes de expresión GFP y F del plásmido donador fueron flanqueados con los sitios específicos de sgA para introducir el corte deseado para su liberación e integración en el genoma de wtHVT usando la estrategia de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés: non-homologous end joining)— y Repeticiones Palíndromas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas(CRISPR, por sus siglas en inglés: clustered regularly interspaced short palindromic repeat) – asociada a 9 (CRISPR/Cas9). El símbolo de la tijera (negra) representa el sitio específico del sgRNA-sgA en el plásmido donador. El casete de expresión reportero fue retirado del genoma de rHVT-GFP-F usando el sistema Cre-loxP, luego el nuevo recombinante HVT fue nombrado rHVT-F. El fragmento amplificado mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés: polymerase chain reaction) usando los cebadores 1F/1R y 2F/2R, demostraron la correcta inserción del casete de expresión F en el plásmido pGEM-sgA-GFP-F-XII. Los cebadores “junction” NDV-F(XII)-5F/HVT UL46-5R (507 bp, pares de bases=bp) demostraron la inserción del casete de expresión F en la región correcta en el genoma de rHVT-GPF-F y rHVT-F (después de retirar el casete reportero GFP). Los cebadores HVT UL45F/HVT UL46R (3950 bp) demostraron la presencia del casete de expresión F completo en la región correcta en el genoma de rHVT-F. El dibujo fue creado con Biorender.com (No fue dibujado a escala). (B) La comparación de la morfología de las placas de lisis entre rHVT-GFP-F, rHVT-F, y wtHVT. La morfología de las placas de lisis en las células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF, por sus siglas en inglés: chicken embryo fibroblast) infectados con los virus the rHVT-GFP-F, rHVT-F, and wtHVT, fue observado con un microscopio en campo claro (panel inferior) y fluorescencia (panel superior): 100× de aumento, y todas las escalas de barra representa 500µm. (C) la presencia del casete de expresión F en el genoma de HVT fue verificado mediante PCR usando los cebadores NDV-F(XII)-5F y HVT UL46-5R, como se demuestra en (A), en rHVT-GFP-F y rHVT-F, respectivamente.

La expresión de la proteína F en la superficie celular se evaluó mediante citometría de flujo. Células CEF fueron crecidas en un frasco de cultivo celular T75, fueron infectadas con una MOI de 0.01, con el virus rHVT-GFP-F y se mantuvieron durante 48 a 72 h antes de la cosecha. Seguidamente las células fueron lavadas dos veces con la solución salina tamponada con fosfato 1× (PBS 1×, por sus siglas en inglés: phosphate-buffered saline 1×) y 5 % de FBS, los sitios de anticuerpos no específicos se bloquearon con suero de ratón normal al 5 % (No. de catálogo ab7486, Abcam, Cambridge, MA, USA.) en buffer FACS durante 15 min a 4°C. Luego, las células se incubaron con suero de pollo anti-NDV (No. 10100482, Charles River Avian Vaccine Services, Norwich, CT, USA.) (1:6400) durante 2 h a 4 °C. Después de lavar dos veces con PBS-5% FBS en PBS 1×, las células se incubaron con 2.5 µg/ml de goat anti-chicken IgY conjugada con Alexa Fluor® 647 (No. de catálogo ab150171, Abcam, Cambridge, MA, USA.) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS 1× al 5% de FBS. Se realizó el análisis de citometría de flujo (Beckman Coulter Gallios, Brea, CA, USA.) en una configuración de 3 láser/10 colores y los datos se analizaron con el software FlowJo v7.6.5 (TreeStar, Ashland, OR, USA.). Los resultados se expresaron como porcentaje de células infectadas (%). El nivel de expresión de la proteína se reportó como la intensidad media de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés: median fluorescence intensity). Para cada muestra, se adquirieron 30.000 eventos. El experimento se repitió tres veces de forma independiente.

El casete de expresión del reportero GFP fue removido con la recombinasa Cre. Las células CEF se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos y luego se infectaron con rHVT-GFP-F, con una MOI de 0.001. Después de 24 h post-infección (hpi), las células fueron transfectadas con 2 μg del plásmido de la recombinasa Cre pcDNA3-Cre [26]. Después de 4 días, las placas negativas a GFP se seleccionaron y purificaron mediante tres rondas de selección de placas. La remoción completa del casete GFP reportero se evaluó por PCR, utilizando cebadores específicos HVT UL45F y HVT UL46R (Tabla 1). La presencia del casete de expresión de NDV F en el genoma HVT en el locus correcto se verificó nuevamente mediante PCR utilizando los cebadores “junction” NDV-F(XII)-5F y HVT UL46-5R (Tabla 1). El HVT recombinante resultante se denominó rHVT-F.

Las células CEF, fueron cultivadas en placas de cultivo celular de 12 pocillos, se infectaron con una MOI de 0.005 con el virus wtHVT y rHVT-F. A las 72 hpi, las células fueron lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1× (DPBS 1×, por sus siglas en inglés: Dulbecco´s phosphate-buffered saline 1×), se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min y se permeabilizaron con 0.1% de TRITON® X-100 (No. de catálogo 648463, Merck, Darmstadt, Alemania) en DPBS 1× durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se incubaron con el anticuerpo primario en una solución de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés: bovine serum albumin) al 5 % (No. de catálogo A7030-500G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA.) en DPBS 1× durante 1 h a temperatura ambiente. Se usó un anticuerpo de ratón contra MDV (B149M) (1:200) (No. de catálogo ab90487, Abcam, Cambridge, MA, USA.) como control positivo para la detección de infección por HVT, y suero de pollo anti-NDV (1:200) (No. 10100486, Charles River Avian Vaccine Services, Norwich, CT, USA.) para la detección de la expresión de la proteína F. Después de lavar tres veces con DPBS 1×, las células se incubaron con goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor^® 594 (1:100) (No. de catálogo ab150116, Abcam, Cambridge, MA, USA.) y goat anti-chicken IgY H&L Alexa Fluor^® 405 (1:200) (No. de catálogo ab175674, Abcam, Cambridge, MA, USA.), respectivamente, en DPBS 1× con BSA al 5% durante 45 min a temperatura ambiente. Los resultados se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia Axio ObserverA1 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Las imágenes digitales se tomaron con un aumento de 50× y se procesaron con una cámara AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Para evaluar la expresión de la proteína F del NDV por el virus rHVT-F, células CEF fueron infectadas con el virus recombinante con una MOI de 0.01. A las 72 hpi, las células CEF fueron lisadas, estos lisados celulares fueron analizadas mediante Western blot. Adicionalmente, el análisis de Western blot fue realizado también para examinar la incorporación de la proteína F en las partículas de los virus recombinantes. Para ello, los virus que se encontraban en los sobrenadantes de células CEF infectadas con el virus recombinante fueron concentradosmediante filtración tangencial utilizando Sartoflow Advanced (Sartorius, Gottingen, Alemania) y se sometieron a una ultracentrifugación en una Ultracentrífuga Optima L-100K (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA.) utilizando gradientes de sucrosa para obtener partículas de virus purificadas. El análisis de Western blot se llevó a cabo usando un anticuerpo policlonal de conejo específico contra la proteína F de NDV (20:5000) (GenScript Laboratories, Piscataway, NJ, USA.) como anticuerpo primario y un anticuerpo de ratón anti-rabbit IgG, conjugado HRP (2:5000) (No. de catálogo A01827, GenScript Laboratories, Piscataway, NJ, USA.), como anticuerpo secundario. Simultáneamente, se llevó a cabo la detección de la proteína Beta-actina, como control de carga en lisadoscelulares, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón contra Beta-actina (No. de catálogo ab8226, Abcam, Cambridge, MA, USA.) (5:5000) como anticuerpo primario y un anticuerpo policlonal goat anti-mouse IgG, conjugado con HRP (No. de catálogo A00160, GenScript Laboratories, Piscataway, NJ, USA.) (3:5000), como anticuerpo secundario. La expresión de la proteína fue visualizada con una cámara CCD Azure c600 sistema de imágenes (Azure Biosystems, Inc., Dublin, OH, USA.).

Los títulos virales fueron determinadospor unidades formadoras de placas (PFUs, por sus siglas en inglés: palque-forming units) en células CEF. Para comparar la infectividad y las propiedades de crecimiento de los virus wtHVT y rHVT-F, células CEF fueron cultivadas en placas de cultivo celular de 6 pocillos por duplicado, e infectadas con 100 PFUs por pocillo de cada virus, yse recolectaron a los 24, 48, 72, 96, y 120 hpi. Las células recolectadas fueron tituladas mediante un ensayo de placa utilizando células CEF sembradas en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una confluencia del 50 %. Las PFUs de las diferentes diluciones fueron determinardas y contadas cinco días después utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Axio Observer. A1 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). El experimento se repitió tres veces de forma independiente.

Para evaluar la estabilidad genética del virus rHVT-F, fue cultivado en células CEF por 20 pasajes sucesivos. El DNA viral se extrajo de las células CEF infectadas cada cinco pasajes, la presencia y la estabilidad del casete insertado se confirmaron mediante PCR utilizando cebadores específicos HVT UL45F y HVT UL46R (Tabla 1). La expresión de la proteína F también se evaluó en 20 pasajes por IFA, siguiendo el procedimiento describió anteriormente. El experimento se repitió tres veces de forma independiente.

Para evaluar la replicación y la estabilidad del virus rHVT-F in vivo, diez pollos SPF de 1 día de edad fueron vacunados con 2500 PFUs de virus rHVT-F ywtHVT (n = 5, pollos respectivamente).

Además, para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia del virus rHVT-F, veinte y uno pollos SPF de 1 día de edad fueron divididos al azar y distribuidos en dos grupos: Grupo #1 = vacunados con el virus rHVT-F (n = 14) y grupo #2 = no vacunado control al desafío (n = 7). El grupo #1 fue vacunado con 2500 PFUs/pollo (en un volumen comercial de 200 µL) por inyección subcutánea en el cuello. Los anticuerpos séricos se analizaron mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés: enzyme-linked immunosorbent assay) y una prueba de inhibición de la Hemaglutinación (HI, por sus siglas en inglés: hemagglutination-inhibition).

Para determinar la eficacia de la vacuna rHVT-F contra el genotipo XII del NDV, el grupo #1 = vacunados con el virus rHVT-F y el grupo #2 = no vacunados, fueron desafiados a los 49 días post-vacunación (dpv) con la cepa velogénica del genotipo XII de NDV, NDV/peacock/Perú/2011 (PP2011). El virus de desafío se administró (en 0.05 mL) por vía oculo-nasal con 10⁵ dosis letal media (LD₅₀ ,por sus siglas en inglés: median lethal doses) que induce100 % de mortalidad en 4 a 6 días en pollos SPF (datos no reportados). Seguido del desafío, los pollos fueron monitoreados diariamente por signos clínicos y mortalidad durante el período de 14 días. Se recolectaron hisopados orales y cloacales para la cuantificación de la diseminación del virus de desafío mediante ensayo de placa. Finalmente, la protección se determinó en función de la mortalidad y la presencia de signos clínicos de ND.

Para medir los anticuerpos específicos de inmunoglobulina Y (IgY, por sus siglas en inglés: specific immunoglobulin Y) contra el NDV, los sueros de muestras de sangre se recolectaron parcialmente en los pollos, mediante sangrado de la vena braquial del ala, a los 20, 34 y 49 dpv. Todas las muestras de suero se separaron de las muestras de sangre mediante centrifugación a 3500 rpm durante 7 min a temperatura ambiente. Para el ELISA, el kit comercial ID Screen®Newcastle Disease Indirect (ID.Vet, Grabels, Francia) fue utilizado siguiendo el protocolo del fabricante. La lectura se realizó a 450 nm utilizando un lector de microplacas automatizado (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA.).Todas las muestras de suero se analizaron utilizando un antisuero de control positivo y negativo proporcionado por el kit, y los títulos de anticuerpos se cuantificaron utilizando el software proporcionado por el fabricante. Las muestras de suero con título de anticuerpos ELISA ≥ 993 se consideraron positivas. El HI solo se evaluó a los 49 dpv; los títulos de anticuerpos se calcularon utilizando 4 unidades de hemaglutinación (HU, por sus siglas en inglés: haemagglutination units) de la cepa LaSota como antígeno, siguiendo el procedimiento descrito en el Manual Terrestre de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) - Capítulo 3.3.14. Enfermedad de Newcastle (infección por el virus de la enfermedad de Newcastle) [50].

Se recolectaron muestras de hisopados orales y cloacales de los pollos a los 3, 5 y 8 días post desafío (dpc, por sus siglas en inglés: days post-challenge). Estas muestras del grupo #1 (n = 7) y del grupo #2 (n = 7) se cuantificaron mediante un ensayo de placa. Los hisopos fueron embebidos en 1 mL de DPBS 1× con 10× antibiótico-antimicótico-100× (No. de catálogo 15240062, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.) por 30 min a 4 °C, luego fueron retirados, las muestras fueron centrifugadas a 5000 rcf por 15 min a 4 °C. Luego, 25 µL de sobrenadante fuerondiluídos en diluciones seriadas de 10 veces en 225 µL de DMEM 1×sinFBS. Seguidamente 200 µL de cada de dilución fueron añadidos sobre cada pocillo de la monocapa DF-1 previamente sembrada en placas de cultivo celular de 12 pocillos, por 1 h de adsorción a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO₂, finalmente se colocó el medio de recubrimiento sobre la monocapa celular: DMEM 1× suplementado con agarosa al 0.5%, FBS al 2% y MgCl₂ 30 mM. Después de 4 días, las células fueron fijadas y tiñidas con paraformaldehído al 3.2% y cristal violeta al 0.2%. Los títulos de NDV fueron reportados como PFUs/mL.

El aislamiento del virus se realizó utilizando linfocitos de sangre periférica (PBLs, por sus siglas en inglés: peripheral blood lymphocytes) recolectados de pollos vacunados con rHVT-F y wtHVT. Se recolectaron muestras de sangre heparinizadas (grupo n = 5 pollos por cada virus) a los 28, 35 y 74 dpv. Entre ellos, 4 ml de la mezcla de muestras de sangre se diluyeron con un volumen igual de DPBS 1× a temperatura ambiente y se homogeneizaron por inversión tres veces. Adicionalmente, se colocaron 4 mL de la mezcla sangre/DPBS 1× sobre una capa de 4 mL de Histopaque^®-1077 (No. de catálogo 10771, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA.) (1:1). Las muestras se centrifugaron a 400 rcf durante 30 min a temperatura ambiente. Los linfocitos fueron recolectados de la interfase entre el histopaque y el suero, luego se lavaron dos veces con DPBS 1× a 300 rcf por 10 min. Finalmente, los linfocitos fueron resuspendidos en DMEM 1× suplementado con FBS al 10 %, seguidamente fueron inoculados sobre una monocapa de células CEF y fueron co-cultivados hasta que se observación de placas de lisis. La presencia de HVT y la estabilidad de la expresión de la proteína F del NDV en el virus rHVT-F a los 28, 35 y 74 dpv se evaluó mediante IFA, PCR y análisis de Western blot descritos anteriormente.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism v8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA.). Las diferencias en los títulos de anticuerpos, entre los grupos vacunados y no vacunados, se compararon mediante la prueba de comparaciones múltiples Tukey de ANOVA dentro de cada día. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar las diferencias de diseminación viral entre cada grupo dentro de cada día y tipo de muestra. Se utilizó la prueba de Mantel-Cox para comparar la supervivencia entre los grupos. Las diferencias se consideraron significativas en * p< 0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001 y **** p < 0.0001.

Los sgRNAs (sgRNA-sgA y sgRNA-UL45-46) fueron diseñados, sintetizados, y clonados en el plásmido px459v2.0, el cual contiene el gen Cas9 de S. pyrogenes. Los plásmidos resultantes fueron nombrados px459v2.0-sgRNA-sgA y px459v2.0-sgRNA-UL45-46.

El plásmido donador pGEM-sgA-GFP-F-XII generado del pGEM-sgA-GFP-VP2, contiene el casete de expresión del  reportero GFP flanqueado con dos secuencias LoxP para la escisión y el casete de expresión de F. Los dos casetes fueron flanqueados por los sitios sg-A para introducir la escisión deseada para su liberación e integración en la región intergénica UL45-UL46 del genoma de wtHVT, tras la introducción de un DSB. La escisión del genoma viraly el plásmido donante, por Cas9, promovieron la inserción de los casetes de expresión de GFP y F en la región intergénica UL45-UL46 del genoma de wtHVT, como se muestra en la figura 1A. La inserción exitosa de los casetes de expresión de GFP y F en la región genómica mostró que la reparación mediada por NHEJ permite la activación de la expresión de los casetes después de la introducción de un DSB en el genoma de HVT por CRISPR/Cas9.                                                   

Para la generación del virus rHVT-GFP-F, se co-transfectaron células CEF con pGEMsgA-GFP-F-XII, px459v2.0-sgRNA-sgA y px459v2.0-sgRNA-UL45-46. A las 24 horas post-transfección, las células fueron infectadas con el wtHVT con una MOI de 0.01. Las placas de lisis que expresaban GFP fueron visibles aproximadamente a los tres días post transfección , lo que demuestra la inserción exitosa del donador (Figura 1B). El virus recombinante se aisló mediante tres rondas de aislamiento de placas, seleccionando las placas de lisis verdes fluorescentes, después de ello las células individuales que expresaban la GFP fueron sembradas en placas de cultivo celular de 96 pocillos mediante FACS. La presencia del casete de expresión de F en la región intergénica UL45-UL46 fue confirmada por PCR utilizando los cebadores de “junction” NDV-F(XII)-5F y HVT UL46-5R, lo cual demostró una inserción correcta en el genoma de wtHVT (Figura 1C).                                                                             

Posteriormente, la escisión del casete de expresión del reportero GFP fue realizada por tratamiento con la recombinasa Cre (Sistema Cre-LoxP), y se confirmó por PCR usando los cebadores HVT UL45F y HVT UL46R (Figura 1A). Se detectó la presencia del casete de expresión NDV F en el genoma de wtHVT en el locus correcto, nuevamente, mediante PCR usando cebadores de “junction” NDV-F(XII)-5F y HVT UL46-5R (Figura 1C). El nuevo HVT recombinante fue denominado rHVT-F.

Para este ensayo, se utilizó el virus rHVT-GFP-F que contiene el casete de expresión GFP. Para evaluar la expresión de la proteína F en la superficie durante el proceso de infección, se cosecharon células CEF infectadas con una MOI de 0.01 con el virus rHVT-GFP-F a las 48 y 72 hpi para ser analizadas por citometría de flujo. A las 48 hpi, observamos que 39.3 ± 0.63% (media ± desviación estándar) (SD, por sus siglas en inglés: standard deviation) de células expresaron la proteína GFP, y 10.7 ± 0.3% de células co-expresaron la proteína F. Mientras que a las 72 hpi, el porcentaje de GFP + células incrementó a 61.95 ± 6.43%, y el de células que co-expresaron la proteína F incrementó 31.1 ± 4.9% (Figura 2A). El nivel de expresión de la proteína F fue además evaluado determinando el MFI. Como se esperaba, el MFI a las 72 hpi (1617 ± 183) fue más alto que a las 48 hpi (491 ± 125) (Figura 2B).

Figura 2. Evaluación de la expresión de la proteína F en la superficie celular y su expresión sobre el tiempo. Las células fueron infectadas con el virus rHVT-GFP-F a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés: multiplicity of infection) de 0.01 y cosechada a las 48 y 72 horas post-infección (hpi) para evaluar la expresión en la superficie celular y en general el nivel de expresión de la proteína F. Las células CEF fueron marcadas con un anti-suero de pollo contra NDV como un anticuerpo primario y un anti-IgY de pollo conjugado a Alexa fluor^®647 como un anticuerpo secundario. (A) Porcentaje de células infectadas que expresan GFP (Q1) o GFP y las proteína F (Q2). (B) La expresión de la proteína F fue evaluada mediante la determinación de la intensidad media de fluorescencia(MFI, por sus siglas en inglés: median fluorescence intensity) y gated en la población GFP+. La MFI de células infectadas con rHVT-GFP-F a las 48 hpi es demostrada en rojo, y a las 72 hpi es demostrada en celeste. Los colores negros y azul corresponden al MFI de células no infectadas (Mock) de las 48 y 72 hpi, respectivamente. Las células fueron evaluadas mediante citometría de flujo (Beckman Coulter Gallios, CA, USA) en una configuración de color 3 laser/10, y los datos fueron analizados utilizando FlowJo software v7.6.5 (TreeStar, Ashland, OR, USA). Para cada muestra, 30, 000 eventos fueron adquiridos. Los datos fueron demostrados como la media ± desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés: standard deviation) de tres experimentos independientes, pero solo una imagen representativa es demostrada.

Para confirmar la expresión de la proteína F insertada en el virus rHVT-F, células CEF infectadas fueron analizadas por Western blot. Utilizando un anticuerpo policlonal de conejo específico contra la proteína F de NDV. Se visualizó una banda con un aparente peso molecular de ~52 kDa, correspondiente a la subunidad clivada (F1) de la proteínaF de NDV, fue detectada en el lisado celularde células CEF infectadas con el virus recombinante. La proteína Beta-actina de ~42 kDa fue detectada como un control en los lisados celulares (Figura 3A). Para examinar la incorporación de la proteína F en las partículas del virus recombinante, el virus fue parcialmente purificado por ultra centrifugación en gradiente de sucrosa, a partir de sobrenadante recolectado de células CEF infectadas con el virus recombinante, finalmente fue analizado por Western blot. Del mismo modo, la proteína F fue detectada en el virus recombinante purificado (Figura 3B), indicando que la proteína F fue incorporada en las partículas virales. Por el contrario, la proteína F no fue detectada en las células CEF infectadas con wtHVTo en las partículas de wtHVT purificado.

 

Figura 3. Caracterización del rHVT-F. Expresión de la proteína F de NDV en células CEF y su incorporación en las partículas virales de rHVT-F. Las células CEF fueron infectadas con el virus recombinante con una MOI de 0.01. Luego, las células CEF fueron cosechadas a las 72 hpi y procesadas para preparar los lisados celulares. Adicionalmente, los virus del sobrenadante de las células CEF infectadas con el virus recombinante fueron concentrados mediante filtración tangencial (Sartoflow Advanced), luego fue sujeto a ultracentrifugación sobre un gradiente de sucrosa para obtener las partículas virales parcialmente purificadas. Estas muestras fueron evaluadas mediante un análisis de Western blot usando un anticuerpo policlonal especifico de conejo contra la proteína F de NDV como un anticuerpo primario y un anticuerpo de ratón contra IgG de conejo conjugado a la peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés: horseradish peroxidase) como un anticuerpo secundario. (A) De izquierda a derecha mostramos el marcador de peso molecular (MW, por sus siglas en inglés: molecular weight) (carril 1), lisado de células CEF infectadas con wtHVT (carril 2), y células CEF infectadas con rHVT-F (carril 3). La proteína Beta-actina (~42 kDa) fue usado como un control de carga en los lisados celulares. (B) De izquierda a derecha mostramos al marcador MW (carril 1), partículas virales parcialmente purificadas del sobrenadante: de células CEF infectadas con wtHVT (carril 2), y células CEF infectadas con rHVT-F (carril 3). La flecha negra indica una banda de ~52 kDa que corresponde a la subunidad clivada (F1) de la proteína F de NDV. (C) Cinética de la replicación in vitro del virus rHVT-F. Las células CEF fueron infectadas con los virus rHVT-F y wtHVT con 100 unidades formadoras de placas (PFUs, por sus siglas en inglés: plaque-formingunits). Las células infectadas fueron cosechadas a las 24, 48, 72, 96 y 120 hpi y tituladas mediante ensayo en placa. Luego, los títulos virales fueron analizados usando “two-way ANOVA” con un test de multiple comparación. Los resultados no fueron estadísticamente significativos (p > 0.05)

Las propiedades de replicación de los virus rHVT-F y wtHVT en células CEF fue medido por observación de la morfología de la placa de lisis y la cinética de crecimiento. Células CEF fueron crecidas en placas de cultivo celular de 6 pocillos donde fueron infectadas con 100 PFUs de los virus. Lac células CEF fueron cosechadas en diferentes tiempos y titulados por ensayo en placa, tal como se describió previamente. Estos estudios muestran que la cinética de replicación viral no mostró diferentes significativas entre los virus wtHVT y rHVT-F (p> 0.05) (Figure 3C). Igualmente, la morfología de la placa de lisis fue muy similar al de wtHVT.

El IFA mostró la expresión de la proteína F en las células CEF infectadas con el virus recombinante en el pasaje 20 (Figura 4A). Estas observaciones demostraron que la replicación del virus recombinante no afectó la expresión de la proteína F de NDV. Para determinar la estabilidad genética del virus rHVT-F, fue cultivado en células CEF por 20 pasajes sucesivos. El genoma viral, analizado después de cada 5 pasajes, por PCR; mostró una banda de 3950 pb y no mostró la banda de 554 pb, la cual solo está presente en wtHVT, sugiriendo la estabilidad del inserto en el genoma del virus recombinante (Figura 4B).

Figura 4. Estabilidad del virus rHVT-F. (A) La expresión de la proteína F fue detectado mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA, por sus siglas en inglés: indirect immunofluorescence assay) en las células  CEF infectadas con el virus rHVT-F en el pasaje N° 20 utilizando un anti-suero de pollo contra NDV, seguido de un anticuerpo de cabra anti-IgY de pollo conjugado a Alexa fluor^®405 (fluorescencia azul). Luego el HVT fue detectado con un anticuerpo de ratón contra el virus de la enfermedad de Marek (MDV, por sus siglas en inglés, Marek’s disease virus) (B149M), seguido de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a Alexa fluor^® 594 (fluorescencia roja) y visualizado mediante un microscopio de campo claro y fluorescencia: con 50× de aumento, todas las escalas de barra representan 500 µm. (B) La estabilidad genética del virus rHVT-F fue detectado de las células CEF infectadas, para ello el ácido desoxirribonucleico (ADN, por sus siglas en inglés: deoxyribonucleic acid fue extraído y analizado mediante PCR con los cebadores HVT UL45F y HVT UL46R en los pasajes 1, 5, 10, 15, y 20. La secuencia genética y dirección de los cebadores son demostrados en la Figura 1A. El tamaño molecular es demostrado al lado izquierdo del gel en bp.

El monitoreo serológico mostró que los pollos SPF del grupo vacunado con la vacuna rHVT-F desarrolló anticuerpos IgY específicos contra NDV detectado por ELISA.  La proporción de pollos positivos fue 28.6% a los 20 dpv, con títulos de 972 ± 769.5 (media ± SD); además, la seropositividad incrementó a 85.7%, con títulos de 3025 ± 1975.5 a los 34 dpv; finalmente, todos los pollos fueron positivos (100%) a los 49 dpv, con títulos de 4664 ± 2231.1. Los resultados indicaron que la vacuna rHVT-F indujo un incremento significativo en la respuesta de anticuerpos a los 34 (p = 0.0063) y 49 dpv (p = 0.0497) (Figura 5A). El ELISA mostró resultados negativos en todos los pollos control no vacunados a las 20, 34, y 49 dpv, con títulos de 16 ± 6.4, 9 ± 7.2, y 46 ± 13.4 (media ± SD), respectivamente, que estaban muy por debajo del límite positivo de 993.

 

Figura 5. Respuesta inmune humoral y protección conferida mediante la vacuna rHVT-F contra un desafío con NDV genotipo XII. Dos grupos de pollos libres de patógenos específicos (SPF, por sus sigla en inglés: specific pathogen-free): Grupo #1 = vacunado con rHVT-F (n=14) y el grupo #2 = control no vacunado para ser desafiado (n = 7). Fueron inmunizados al primer día de edad, y el desafío fue realizado a los 49 días post-vacunación (dpv) con 10⁵ dosis letal media (LD₅₀, por sus siglas en inglés: median lethal doses)/pollo, mediante la vía óculo-nasal. (A) anticuerpos específicos IgY en pollos vacunados a los 20, 34, y 49 dpv. Los títulos de las muestras de sueros que fueron negativos por  ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés: enzyme-linked immunosorbent assay) son demostrados debajo del límite de detección (Cutoff = 993). SD = Desviación estándar. (B) La tasa de supervivencia de pollo vacunados no mostraron mortalidad en 14 días post-desafío (dpc, por sus siglas en inglés: days post-challenge). (C) Titulos de la diseminación del virus de desafío a partir de hisopados cloacales y orales de pollos, después del desafío es cuantificado mediante ensayo en placa. ND = no detectado; NS = no sobrevivientes; dpc = días post-desafío (por sus en inglés days post-challenge. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, y **** p < 0.0001.

El nivel de anticuerpos por la prueba HI solo fuemedido a los 49 dpv, en donde todas las muestras de suero colectadas de pollos vacunados fueron positivas por HI, y el título promedio fue 4.3 ± 1.2 log2. Por lo tanto, el virus rHVT-F fue capaz de producir una eficiente respuesta inmune humoral contra NDV en pollos SPF con solo una dosis de vacunación.

La eficacia protectora en pollos vacunados fue demostrada por la ausencia de signos clínicos y la mortalidad durante los 14 dpc. Pollos SPF de un día de edad fueron vacunados con una sola dosis de la vacuna rHVT-F, por la vía subcutánea en el cuello, y luego desafiados a los 49 dpv con NDV genotipo XII por la vía óculo-nasal. Todos los pollos vacunados con la vacuna rHVT-F mostraron una protección completa contra NDV genotipo XII, resultando 100% de protección (14/14) y libres de signos clínicos. Por el contrario, los pollos no vacunados del grupo control presentaron signos clínicos típicos de NDV entre los días 3 a 5 dpc y alcanzaron el 100% (7/7) de mortalidad a los 6 dpc (Figura 5B).   

La diseminación del virus desafío fue cuantificado por ensayo en placa en células DF-1, de muestras recolectadas de hisopados orales y cloacales, placas de lisis de gran tamaño fueron observadas a los 4 días post-ensayo. Hubo un efecto significativo y fuerte reducción de títulos (virus diseminado) en el tracto respiratorio superior (muestras de hisopados orales) de los pollos vacunados en comparación al grupo control no vacunado después del desafío, donde 5 de 7 pollos fueron negativos a los 3 dpc (p = 0.0012), y siete de siete pollos fueron negativos a los 5 (p = 0.0006) y 8 dpc. Comparado a esto, todos los pollos del grupo control no vacunado y desafiado, fueron positivos en las muestras de hisopados orales a los 3 y 5 dpc (Tabla 2 y Figura 5C). Los pollos del grupo no vacunado mostraron títulos altos de infección viral en el día 5 dpc.

Tabla 2. Frecuencia de aislamiento del virus de desafío en los grupos de vacunación

 

La diferencia en los títulos de la diseminación del virus desafío entre los grupos vacunados y no vacunados fue aún alto en las muestras de hisopados cloacales, ya que no se detectó diseminación viral enel tracto digestivo de los pollos vacunados (7 de 7 pollos fueron negativos a los 3, 5, y 8 dpc). Al mismo tiempo, una cantidad significativa del virus de desafío pudo ser detectado en el grupo no vacunado comparado al grupo vacunado a los 3 (p = 0.0210) y 5 dpc (p = 0.0006) en las muestras de hisopados cloacales (Tabla 2 y Figura 5C).

La replicación fue evaluada basada en el aislamiento viralen células CEF, de los virus rHVT-F y wtHVT en los linfocitos de pollos vacunados. La apariencia de un efecto citopático, su morfología, y tamaño de las placas de lisis en células CEF, después de 7 a 10 días post-incubación de linfocitos, fue confirmada e interpretada como muestra positiva para aislamiento. Todas las muestras recolectadas de pollos inmunizados con los virus rHVT-F y wtHVT fueron positivas a los 28, 35, y 74 dpv por PCR, indicando que la inserción del gen F en el genoma wtHVT no alteró la replicación in vivo. Ninguna placa de lisis viral fue detectada en el grupo control no vacunado interpretándose como negativo para aislamiento.                                                                                            

La estabilidad de expresión del gen F fue confirmado desde el primer aislamiento hasta el último por IFA (Figura 6A), PCR (Figura 6B), y Western blot (Figura 6C), indicando que la expresión se mantuvo estable in vivo. El análisis de Western blot mostró una banda de ~59 kDa correspondiente al precursor inactivo (F0), una banda de ~52 kDa correspondiente a la subunidad clivada (F1), y una banda de ~120 kDa correspondiente al dímero F1 (dF1) de la proteína F de NDV (Figura 6C). La morfología de las placas y la expresión de la proteína F en HVT demostró que el recombinante no había adquirido alguna desventaja debido a su modificación estructural de su genoma por inserción de este gen.

 

Figura 6.  Detección de la replicación y estabilidad del virus rHVT-F in vivo. El aislamiento de rHVT-F y wtHVT a partir de linfocitos fue confirmado mediante IFA, PCR, y análisis de Western blot a los 28, 35, y 74 dpv. Un pool de linfocitos de sangre periférica (PBLs, por sus siglas en inglés: peripheral blood lymphocytes) de pollos (n = 5) fue usado para el aislamiento de cada virus. En los resultados, solo una imagen representativa de cada virus es mostrada. (A) IFA fue realizado en células CEF infectadas con los virus aislados mediante el marcaje con un anti-suero de pollo anti-NDV, seguido de un anticuerpo de cabra anti-IgY de pollo conjugado a alexa fluor^® 405 (fluorescencia azul). HVT fue detectado con un anticuerpo de ratón contra MDV (B149M), seguido de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a Alexa fluor^® 594 (fluorescencia roja) y visualizado mediante un microscopio de campo claro y fluorescencia: con 50× de aumento, todas las escalas de barra representan 500µ. (B) La estabilidad genética de los virus aislados fue evaluada a partir de células CEF infectadas, del cual el DNA viral fue extraído y analizado mediante PCR con los cebadores HVT UL45F y HVT UL46R. De izquierda a derecha son mostrados: el marcador MW (carril 1), DNA extraído de células CEF infectadas con los virus aislados: rHVT-F a los 28 (carril 2), 35 (carril 3), y 74 dpv (carril 4), así también como wtHVT a los 28 (carril 5), 35 (carril 6), y 74 dpv (carril 7). El tamaño molecular es indicado al lado izquierdo del gel como bp. La flecha negra indica el MW esperado de la banda. (C) La expresión de la proteína F de NDV fue evaluado mediante un análisis de Western blot en células CEF infectadas con los virus aislados usando un anticuerpo policlonal especifico de conejo contra la proteína F de NDV como un anticuerpo primario y un anticuerpo de ratón anti-IgG de conejo conjugado a HRP como un anticuerpo secundario. De izquierda a derecha mostramos el marcador MW (carril 1), lisados de células CEF infectadas con los virus aislados: rHVT-F a los 28 (carril 2), 35 (carril 3), y 74 dpv (carril 4), asi mismo wtHVT a los 28 (carril 5), 35 (carril 6),  y 74 dpv (carril 7). La flecha negra indican una banda de ~59 kDa que corresponde al precursor inactivo (F0), una banda de ~52 kDa que corresponde a la subunidad clivada (F1) y una banda de ~120 kDa que corresponde a dimeros de F1 (dF1) de la proteína F de NDV. La proteína Beta-actina (~42 kDa) fue usado como un control de carga en los lisados de células.

Las clásicas vacunas de ND han demostrado una eficacia limitada en el control de la diseminación viral y en la superación de altos niveles de anticuerpos maternales en pollos. Para abordar estos problemas, muchos autores han propuesto el uso de HVT como una vacuna de vector viral para la expresión de las proteínas F y HN de NDV, debido a su habilidad depersistir en presencia de alto títulos de anticuerpos maternales[10], reducir la propagación viral en aves vacunadas, e inducir inmunidad celular y humoral de larga duración con aplicación de una sola dosis [10,12,15-17]. Sin embargo, el genoma HVT puede alojar grandes fragmentos de DNA foráneo en su genoma sin alguna interferencia para su replicación [51]. En este estudio, desarrollamos una vacuna vectorizada de HVT recombinante expresando el antígeno F de NDV (rHVT-F) del genotipo XII, cepa circulante en Perú, usando los sistemas NHEJ–CRISPR/Cas9 y Cre-LoxP. La vacuna rHVT-F administrada en pollos SPF de un día de edad, fue capaz de inducir alta protección en los pollos vacunados por la ausencia de algún signo clínico típico de la enfermedad de NDV, como se evaluó a los 14 dpc, generando una completa protección contra la cepa desafío de NDV perteneciente al genotipo XII a los 49 dpc en todos los pollos vacunados, comparado con el grupo control no vacunado que presentó una mortalidad del 100% a los 6 dpc por desafío vía óculo-nasal (imitación de la infección viral en el campo).

Nuestros resultados demostraron que la vacuna rHVT-F además detuvo la propagación del virus desafío desde las vías respiratorias superiores a los 5 dpc. Además, ninguno de los pollos vacunados propagó el virus desafío en los hisopados cloacales, indicando una completa supresión del virus en el tracto intestinal posiblemente debido a la inmunidad sólida sistémica y humoral asegurando una fuerte supresión de la replicación del virus desafío en el cuerpo de los pollos vacunados. Estos hallazgos han sido reportados en otros estudios [10,12,15,17]. En este estudio, logramos aislar el virus rHVT-F en células CEF en muestras PBLs a los 28, 35, y 74 dpv, probablemente debido a su replicación en los órganos linfoides, lo cual causaría una supuesta inmunidad sistémica. Por otro lado, hay evidencia de que los pollos vacunados con Rispens, SB-1, y HVT han demostrado integración del genoma viral en los telómeros de cromosomas del bazo debido a que alberga repeticiones teloméricas (TMRs) en su genoma viral [52], así esta evidencia probablemente podría explicar la presencia del virus en PBLs en esteestudio.                                                                                                                                                       

Un reciente estudio indicó que el patrón de diseminación viral está asociado con la vía de inoculación del virus desafío, en donde la inoculación se dio por vía intranasal, la excreción del virus desafío en la vía oro-nasal es detectable entre 100 a 90% de pollos vacunados (20 y 28 días de edad respectivamente) a los 4 dpc, mostrando gran susceptibilidad de las vías respiratorias superiores [17]. Esto puede ser explicado por la rápida colonización del virus, posiblemente debido a una incompleta o débil respuesta inmune local de la superficie mucosa del tracto respiratorio en los primeros días del inicio de la enfermedad [10]. Sin embargo, como se mencionó, no detectamos diseminación del virus desafío en el 5 dpc en pollos vacunados en la vía oral.                                                                                                                                 

Por otro lado, ¿Es posible que estos resultados respondan a la hipótesis acerca de una mejor eficacia de una vacuna homóloga con una reducción significativa en la diseminación viral? Lo cierto es que, en este estudio, hipotetizamos que esta vacuna rHVT-F desarrollada contra una cepa antigénicamente similar a la cepa desafío mejoraría la eficacia de la vacuna, con protección clínica y adicionalmente contribuir a una completa reducción en la diseminación viral lo cual es mostrado en nuestros resultados.                                                                                  

Algunos estudios científicos han sugerido que mayor distancia genética entre los antígenos vacunales y la cepa viral de desafío de campo es una de las causas de la ineficiente reducción en la diseminación del virus desafío en el tracto respiratorio de las aves vacunadas [53]. Por otro lado, otros han reportado, que considerando que todas las cepas de NDV pertenecen a un serotipo Avian paramixovirus 1 (APMV-1), antígenos de cualquier cepa de NDV pueden ser usados comovacuna para cualquier genotipo; proporcionando una protección, morbilidad, y mortalidad contra cualquier cepa de desafío de NDV y que la eficacia de las vacunas en el control de la diseminación viral podría ser principalmente asociada con la característica de vacunas, vía de aplicación,inadecuada vacunación, cadenas de frío inapropiadas para las vacunas, sistema inmune, y diferentes condiciones ambientales [53,54]. Sin embargo, debido al incremento de la diversidad viral, todas las cepas de NDV son divididas en dos clases, Clase I (un solo genotipo) y clase II (21 genotipos), basados en el análisis de la secuencia completa del gen F [5], lo cual justifica potencialmente la necesidad de renovar y desarrollar vacunas compatibles antigénicamente que puedan ofrecer una protección mejorada contra NDV velogénico, reducir la diseminación y transmisión del virus [55,56].

En pollos, el nivel de respuesta humoral sistémica contra NDV ha sido considerada un buen indicador de protección contra el desafío. El anticuerpo IgM es el isotipo predominante producido después de una exposición inicial a un nuevo antígeno, pero el anticuerpo IgY es el principal isotipo producido en la respuesta sistémica secundaria activa después de IgM. [57].

En este estudio, monitoreamos los niveles de anticuerpo IgY contra NDV en suero por ELISA con títulos que incrementaron significativamente a los 34 (p = 0.0063) y 49 dpv (p = 0.0497). Aunque no monitoreamos otras inmunoglobulinas (Ig) tales como IgM o IgA, estos anticuerpos podrían además jugar un papel esencial contra el desafío de NDV. Un estudio ha detectado los niveles IgM, IgY, e IgA en muestras de suero después de la inmunización con rHVT-F por ELISAs in house, sugiriendo la inducción de una completa respuesta humoral inmune [58].

Por otro lado, obtuvimos títulos positivos de anticuerpos (4.3 ± 1.2 log2) por la prueba HI a los 49 dpv. A pesar de que esta prueba es usualmente utilizada para medir la concentración de anticuerpos anti-hemaglutinina-neuraminidasa inducidos por vacunas vivas convencionales, siendo diferente para la vacuna de este estudio, en donde el HVT solo expresa la proteína F y no la proteína HN de NDV. Otros autores, han reportado títulos positivos de HI en aves vacunadas, con una vacuna vectorizada que expresa la proteína F, están asociados con un efecto de impedimento estérico en el cual muchos anticuerpos F son capaces de inhibir hemaglutinación [59].

En este estudio, demostramos que la inserción del gen F no afectó la morfología de placas y la replicación del virus recombinante cuando fue comparado con el virus wtHVT. Estos resultados coinciden con otros trabajos que usaron la técnica NHEJ–CRISPR/Cas9 para generar HVT-VP2 [26,27]. Por otro lado, la primera generación de los virus recombinantes obtenidos usando otros sistemas tiende a replicar menos en comparación al virus wtHVT, por lo tanto, generan niveles subóptimos de expresión del antígeno viral, y esto podría contribuir a un retraso en la inducción de un nivel óptimo de anticuerpos protectores. Podría ser debido a múltiples pasajes bajo la selección con antibiótico y muchas rondas de purificación de placas que podrían alterar las características biológicas y finalmente provocando inestabilidad. Estos pasos son eliminados o reducidos usando el sistema CRISPR/Cas9 debido a su eficiencia en la integración de distintos genes foráneos en el genoma de wtHVT. Muchos estudios han demostrado que los virus recombinantes obtenidos por el sistema CRISPR/Cas9 fueron estables in vitro [26,37,45,48]. De acuerdo con estos reportes, demostramos que el casete insertado se mantiene estable incluso después de 20 pasajes, lo cual fue confirmado por PCR e IFA. Además, demostramos la integridad genética del casete de expresión F mediante PCR.     

Técnicas convencionales de recombinación han sido usadas para desarrollar las vacunas recombinantes actuales de HVT-NDV. Sin embargo, estas técnicas consumen tiempo y son laboriosas. Recientemente, muchos estudios han reportado la utilidad de la tecnología CRISPR/Cas9 en el estudio de genes específicos y proteínas esenciales de los herpesvirus [44,46,47], estableciendo así su uso como una herramienta ideal para editar genomas virales [26,27].

Por lo tanto, la edición de genes basada en CRISPR/Cas9 puede ser usada como una rápida, simple, y efectiva plataforma para la generación de nuevas vacunas recombinantes que expresan diversos antígenos en el genoma de HVT [26–29,49]. Esta herramienta innovadora de edición de genes (CRISPR/Cas9) se ha establecido rápidamente como una herramienta versátil y poderosa que ha permitido la inserción de genes foráneos, tales como proteína roja fluorescente (RFP, por sus siglas en inglés: red fluorescent protein) [26], GFP [44], antígeno VP2 del virus de la enfermedadinfecciosa de la bursa (IBDV, por sus siglas en inglés: infectious bursal disease virus)[26,27], glicoproteína D-glicoproteína I (gDgI) del virus de laringotraqueitis infecciosa (ILTV, por sus siglas en inglés: infectious laryngotracheitis virus) [49], y el antígeno HA del virus de la influenza aviar (AIV, por sus siglas en inglés: avian influenza virus)[28,29,49]. Basado en el éxito de estos estudios, nosotros utilizamos la técnica CRISPR/Cas9 para generar un nuevo HVT recombinante que expresa la proteína F de NDV del genotipo XII, un genotipo específico de amplia circulación en Perú. NDV tiene dos proteínas inmunogénicas: HN y F. Seleccionamos el gen F para la generación del HVT recombinante, ya que otros estudios han demostrado que es suficiente para inducir una protección completa [9,10,12,17,60].

Los mecanismos moleculares para reparar DSBs, creado por Cas9, sigue dos vías: NHEJ y HDR. Empleamos la vía NHEJ para introducir el casete de expresión F de NDV en la región intergénica UL45-UL46, porque esta víaocurre en todas las fases del ciclo celular, y su eficiencia es de tres a seis veces mayor que la de HDR. La vía HDR es considerado menos eficiente ya que es restringido a las fases S y G2 del ciclo celular. Otra ventaja de la vía NHEJ es la capacidad para reparar el ADN en 30 minutos, mientras que HDR puede requerir un retraso de siete horas para completar el proceso de reparación [61].                                                                                                                                             

Además de esto, en la vía NHEJ, no necesitamos construir brazos homólogos, haciendo el proceso de clonación más rápido y sencillo. Corroborando nuestros resultados, otros colegas determinaron que es una vía rápida y eficientepara generar la integración de genes en el genoma de herpesvirus.