Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico

I. INTRODUCCIÓN

En la búsqueda de nuevas materias primas, muchos estudios han propuesto el aprovechamiento de los subproductos generados en las industrias de frutas como fuente de ingredientes funcionales, ya que estos contienen cantidades considerables de compuestos bioactivos además de ser una fuente natural barata (Peschel et al., 2006; Kong et al., 2010; Dorta et al., 2012), no solo para su aplicación en alimentos sino también en productos farmacéuticos y cosméticos (Shahidi y Naczk, 2004).

En la pulpa de café un subproducto del beneficio del café se reporta un contenido importante de compuestos fenólicos con actividad antioxidante, como ácidos clorogénicos, epicatequina y otros (Ramirez-Martinez, 1988; Ramirez-Coronel et al., 2004), sin embargo, no se han propuesto procedimientos de aprovechamiento de estos compuestos. Por otro lado, el desarrollo y aplicación de la tecnología de extracción con fluidos supercríticos (EFS) representa una alternativa al empleo tradicional de solventes orgánicos (Turner, 2006) en los procesos de extracción de estos compuestos. En el presente estudio se evaluó la aplicación de extracción supercrítica antisolvente (SAE) para la obtención de un extracto concentrado en ácido clorogénico (ACG), presentes en la pulpa de café, planteándose como objetivos: Evaluar el potencial de la pulpa de café como fuente aprovechable de antioxidantes naturales mediante extracción con CO₂-SC, cuantificar la concentración de ácido clorogénico en los extractos etanólicos de pulpa deshidratada de café y obtener un extracto con alta actividad antioxidante y alto contenido en ácido clorogénico mediante CO₂-SC.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Esta investigación se llevó a cabo en los laboratorios del grupo de investigación en Fluidos Supercríticos del Departamento de Ingeniería Industrial de la Universidad de Salerno en Italia. Las muestras de fruto de café, Coffea arabica variedad Typica, fueron proporcionadas por productores de Fapecafes en la parroquia Malacatos (1470 m.s.n.m.) del cantón Loja en Ecuador. Las muestras recién colectadas fueron caracterizadas en cuanto a humedad, a través del método gravimétrico según AOAC 931.04 (AOAC, 2005); pH, mediante técnicas AOAC 970.2 (AOAC, 2005); Sólidos solubles, aplicando la norma NTE-INEN 380-1985, e inmediatamente siguieron un proceso de beneficio húmedo (Duicela et al., 2009) obteniéndose la pulpa como sub producto. Las muestras de pulpa fueron deshidratadas en estufa (Memmer mod. SNB400) a60°C hasta humedad final menor al 10% y reducidas en tamaño en un molino eléctrico de cuchillas y clasificada en tamices, generando cinco fracciones (A, mayor a 500 µm; B, mayor a 250 µm y menor a 500 µm; C, mayor a 200 µm y menor a 250 µm; D, mayor a 160 µm y menor a 200 µm; E, menor a 160 µm).

Los solventes y estándares utilizados fueron adquiridos a marcas reconocidas. Ácido acético 96% y Metanol grado HPLC y analítico de Carlo Erba (Italia). Etanol absoluto 99,5% Fluka, Agua grado HPLC, 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), L- ácido ascórbico 99,5% (vitamina C), Ácido clorogénico grado titración (95%) fueron de Sigma (Aldrich, Milán). El Dióxido de carbono, CO₂ (99% de pureza) fue adquirido a la Sociedad Oxígeno de Nápoles (Italia)

2.1. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.1.1 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

En la obtención de extractos etanólicos se utilizó una modificación del método aplicado por Landi et al. (2009):3 g de pulpa de café se pusieron en contacto con 60 mL de etanol absoluto (99%) para someterlos a maceración con agitación magnética a 1100 revoluciones por minuto durante tres horas a temperatura ambiente (15 °C); posteriormente el extracto se filtró con membrana millipore de 0.45 µm de porosidad; la fracción líquida se evaporó para eliminar el solvente a temperatura de45 °C y presión reducida en rotavapor Büchi R-200 con baño de calentamiento Büchi B-490. El mismo procedimiento de extracción se repitió para obtener extractos de 6 y 24 horas. De esta forma se obtuvieron 3 extractos por cada fracción de tamaño de gránulo (A, mayor a 500 µm; B, entre 500 y 250 µm; C, entre 200 y 250 µm; D, entre 160 y 200 µm; E, menor a 160µm), teniéndose en total 15 muestras (tratamientos). Se registró el peso de los extractos secos para calcular el rendimiento de extracción. Los extractos secos fueron almacenados a temperatura de -4 °C en un frigorífico comercial, hasta su empleo en los análisis y proceso SAE.

2.1.2 CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO CLOROGÉNICO

La cuantificación del ácido clorogénico mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa se realizó en dos etapas; la primera para seleccionar el tamaño de partícula con mayor rendimiento y una posterior en los productos (“precipitado” y “separado”) del proceso de extracción SAE.

Para seleccionar el tamaño de partícula, la cuantificación se realizó con una modificación del método empleado por Ramirez-Martinez (1988): la fase móvil correspondió a una mezcla de solventes, 90% solvente A (metanol grado HPLC), 10% solvente B (solución acuosa 2% de ácido acético grado HPLC); se inyectaron 5 µL de solución de extractos en una columna Hypersil BDS C₁₈, 4,6 x 250 mm, 5µm (Agilent); con flujo isocrático de la fase móvil de 0,5 mL/min por 30 minutos. Para la cuantificación en las fracciones SAE, se cambió el método en cuanto al gradiente, para ello se utilizó el gradiente descrito por Ramirez-Coronel et al. (2004), empleando la misma fase móvil descrita anteriormente; se inyectaron 10 µL de solución de extracto en una columna Hypersil BDS C₁₈, 4,6 x 250 mm, 5 µm (Agilent); con flujo de la fase móvil de 1 mL/min; las condiciones de elución fueron las siguientes: condición inicial 3% A; 0 – 5 min, 9% A; 5 – 15 min, 16% A; 15 – 45 min, 50% A; 45 – 48 min, 90% A; y 48 – 51 min, 90% A. Luego la columna fue lavada y reacondicionada por nueve minutos. En ambos casos se utilizó un estándar externo de ácido clorogénico empleando soluciones de concentraciones conocidas de 125, 250, 500 y 1000 ppm para la cuantificación del compuesto en los extractos. El equipo empleado correspondió a un HPLC Hewlet Packard equipado con una bomba cuaternaria y desgasificador series 1100, acoplado a un auto muestreador y detector de arreglo de diodos (DAD) Agilent series 1200. La integración de los resultados se realizó mediante el software Chemstation para LC.

2.1.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Se empleó el método desarrollado por Brand Williams et al. (1995), con modificaciones descritas por Thaipong et al. (2006). Se preparó una solución patrón disolviendo 24 mg de DPPH con 100 mL de metanol. La solución de trabajo se preparó mezclando 10 mL de solución patrón con 52 mL de metanol hasta obtener una lectura en absorbancia de 1,1 ± 0,02 unidades a una longitud de onda de 515 nm en un espectrómetro UV (Varian). Se emplearon curvas estándar de ácido ascórbico con concentraciones entre 50 – 2000 µMol/L. Los resultados fueron expresados en µmoles equivalentes de vitamina C/g de pulpa fresca (µMol. eq. Vit. C/g PF). Se evaluó la actividad antioxidante de los extractos etanólicos sometidos al proceso con CO₂ SC así como las fracciones obtenidas en el mismo: “precipitado” y “separado”.

2.1.4 EXTRACCIÓN CON DIÓXIDO DE CARBONO SUPERCRÍTICO ANTISOLVENTE (SAE)

Dado que las propiedades de solvatación del CO₂ SC no permiten extraer de forma directa compuestos polares ni de alto peso molecular (Martínez, 2008) como el ácido clorogénico, se buscó emplear el procedimiento de extracción supercrítica antisolvente (SAE). Se empleó la técnica SAE, en un equipo de extracción a escala semipiloto. El proceso de extracción SAE consistió en poner en contacto una solución etanólica del extracto con fluido supercrítico CO₂SC. De esta forma el CO₂ SC, que fluye continuamente, disuelve el etanol y algunos compuestos presentes en el extracto mientras los compuestos no solubles en CO₂ SC precipitan y se recogen en un filtro.

En esta etapa se usó el extracto etanólico con mayor concentración en ácido clorogénico; a partir de este extracto seco se prepararon 30 mL de una solución con concentración del 3% en peso en etanol absoluto 99.5%. Se estudió el efecto de la presión (80 y 150 bar) y temperatura del CO₂ SC (35 y 40 °C) sobre la recuperación de ácido clorogénico presente en el extracto de partida (cuatro tratamientos); ambas condiciones de operación modulan la densidad del CO₂ SC y por ende el poder de solvatación (Alkio, 2008). Por cada prueba de extracción SAE se obtuvieron dos muestras, la correspondiente al extracto recuperado en la cámara de precipitación (“precipitado”) y la de la corriente de etanol recuperada en el separador (“separado”). Un balance de materia sobre la cantidad recuperada y la cantidad inicial de materia prima permitió determinar la eficiencia de recuperación del compuesto de interés.

2.1.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS

La selección del tamaño de partícula y del tiempo más adecuados de extracción etanólica se realizó por medio de un análisis de varianza, con nivel de significancia del 0,05%, entre los rendimientos de extracción del ácido clorogénico y en la medida de capacidad antioxidante. Los resultados se expresaron como valor promedio y desviación estándar de tres repeticiones. Similar análisis se realizó para los resultados de la extracción SAE, para determinar la diferencia entre tratamientos, sobre la recuperación y el rendimiento de ácido clorogénico en la cámara de precipitación y en el separador, y en la medida de capacidad antioxidante; asimismo, se realizó la prueba de Tukey para determinar el tratamiento más adecuado. Todos los análisis estadísticos se realizaron empleando el software estadístico MINITAB ® 14.

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 CARACTERÍSTICAS DE LA PULPA DE CAFÉ

Se obtuvo los siguientes valores en la caracterización de la pulpa de café: Humedad en pulpa fresca, 86,63 %; pH, 5,47; sólidos solubles (°Brix), 14,67 %; humedad en pulpa seca, 9,57 %. Estos valores son indicadores del grado de madurez que presentó la pulpa de café; según Marín et al. (2003), en este estado de madurez el café presenta mejor calidad física aumentando la cantidad de café pergamino y disminuyendo el porcentaje de frutos sin despulpar. El pH varió entre 4,6 y 6,3, similar a los reportados por Aldean (2011) sobre café de Vilcabamba (pH 4,7 – 6,9). La pulpa fue deshidratada hasta humedad menor al 10%.

3.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS

Los resultados de la extracción por maceración de la pulpa con etanol se muestran en el Cuadro 1. El análisis de varianza mostró que el tiempo y el tamaño de partícula tienen efecto sobre el rendimiento y la actividad antioxidante; en la concentración de ACG solo el tiempo tuvo efecto significativo. Se encontró diferencia significativa (Tukey) entre diversos pares de extractos de diferente tamaño de partícula dentro de cada uno de los aspectos evaluados; los valores con letra diferente presentan diferencia significativa (p < 0,05).

El tiempo de extracción (maceración) tuvo efecto directo sobre el rendimiento de extracción, el contenido de ACG y la actividad antioxidante, Figs 1 a 3, siendo este efecto más marcado en el rendimiento de extracción y la actividad antioxidante. Por otro lado, se observa que a medida que disminuye el tamaño de partícula hasta 200-250 µm se incrementa el rendimiento en la extracción y la actividad antioxidante, luego de lo cual se mantienen casi constantes; en cambio el contenido de ácido clorogénico se mantiene casi constante con todos los tamaños de partícula ensayados (p < 0,05).

Cuadro 1: Resultados de extracción etanólica en pulpa de café

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 1

Fig. N° 1: Efecto del tamaño de partícula sobre el rendimiento de la extracción durante 3, 6 y 24 horas de maceración

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 2

Fig. N° 2: Efecto del tamaño de partícula sobre el contenido de ACG durante 3, 6 y 24 horas de maceración

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 3

Fig. N° 3: Efecto del tamaño de partícula sobre la actividad antioxidante durante 3, 6 y 24 horas de maceración

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 4

En cada tiempo de contacto se observó un valor máximo de rendimiento en peso de 13%, 16% y 21% para 3, 6 y 24 horas (Fig. 1). Tomando en cuenta el rendimiento se consideró la extracción durante 24 horas en muestras con tamaño menor o igual a 250 µm como el más adecuado, pues, si se observa la Fig. 4, los mejores resultados correspondieron a un tiempo de 24 horas de extracción y tamaño de partícula entre 250 y 160 µm, pues el análisis estadístico no mostró diferencia significativa (p < 0,05) entre 36,15 mg ACG/ g ES; 36,27 mg ACG/ g ES y 35,58 mg ACG/ g ES, para los tamaños C (200-250 µm), D (160-200 µm) y E (?160 µm) respectivamente.

Figura 4: Curva de concentración de ACG en extractos etanólicos

El aumento de los valores en rendimiento de extracción, concentración de ACG y actividad antioxidante, con el tiempo de extracción utilizando etanol como solvente concuerda con lo observado en diferentes estudios de optimización de extracción. Chirinos et al. (2007) estudiaron la extracción de compuestos fenólicos en tubérculos de mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) mostrando un aumento del rendimiento de extracción con el tiempo hasta los 60 minutos luego del cual el incremento no fue significativo. Similarmente, Yap et al. (2009) estudiaron la optimización de las condiciones de extracción de compuestos fenólicos en residuos de Averrhoa carambola L., observando que el contenido de fenoles totales aumenta con el incremento del tiempo de extracción; notando además que en tiempos de contacto prolongados puede ocurrir disminución del contenido de fenoles totales debido a degradación por oxidación de los compuestos, lo que podría explicar los bajos valores de extracción del ACG. Por otra parte Kong et al. (2010) observaron incremento en la extracción de fenoles totales a partir de sub-productos industriales de guayaba (Psidium guajava L.) al incrementar el tiempo de extracción, observando además mejoría del rendimiento con la temperatura de extracción (40 -60 ºC).

Por otro lado, el aumento del rendimiento de extracción con la disminución del tamaño de partícula está de acuerdo con los resultados presentados por Mukhopadhyay et al. (2006) y de Wang et al. (2011), quienes evaluaron la extracción de compuestos fenólicos como función del tamaño de partícula en el rango de 2 hasta 0,25 mm; sin embargo Reverchon et al. (1993) mencionan que es necesario optimizar el tamaño adecuado pues al reducir demasiado el tamaño se liberan sustancias contaminantes como ceras y material celular que obstaculizan la extracción, esto podría haber ocurrido en el tamaño de partícula menor a 160 µm, pues el aumento de superficie de contacto correspondiente aumenta la solubilidad y disposición de otros compuestos diferentes, no solo los fenólicos, pudiendo tener efecto pro oxidante aumentando la velocidad de degradación de los compuestos antioxidantes.

La medida de actividad antioxidante arrojó 53,42 µMol Vit C/g ES, expresada en base a la pulpa seca de café, similar al valor determinado por Panamito (2010) en pulpa de café proveniente de Palanda, 56,76 µMol Vit C/g ES, y el Pangui 51,1 µMol Vit C/g ES, pero menor frente al presentado para el café de Vilcabamba 181,68 µMol Vit C/g ES. Si se compara esta actividad antioxidante con la presentada en el trabajo de Kuskoski et al.(2005) para diferentes frutas entre ellas: mora (4,69 µMol Vit C/g FS), uva (6,01 µMol Vit C/g FS), açaí (6,16 µMol Vit C/g FS), guayaba (5,72 µMol Vit C/g FS), fresa (7,54 µMol Vit C/g FS), acerola (54,45 µMol Vit C/g FS), entre otras, se puede identificar que la pulpa de café presentó una considerable actividad antioxidante, superior a las citadas.

Tomando en cuenta las variables respuesta se consideró como extracto viable para la segunda etapa de fraccionamiento antisolvente (SAE) al obtenido con tamaño de partícula entre 200-250 µm durante un tiempo de maceración de 24 horas por presentar el valor más alto en los resultados de extracción así como al hecho de que las curvas de concentración de ACG y actividad antioxidante muestran un decremento de sus valores en el extracto con tamaño de partícula menor a 200 µm.

4.3 EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA ANTISOLVENTE, SAE

Las pruebas de extracción supercrítica con solvente (SAE) fueron realizadas en las condiciones de operación resumidas en el Cuadro 2. El proceso de fraccionamiento dio como resultado dos productos; en la cámara (“precipitado”) un producto semisólido, inodoro, de color blanco amarillento, altamente viscoso que permaneció pegado a la pared interna de la cámara y un segundo producto (“separado”) que correspondió a la solución de etanol condensada en el separador, un líquido de color amarillo con aroma distintivo a café, que fue evaporada a vacío para su cuantificación y análisis. El CO₂ SC en el proceso funcionó como antisolvente para precipitar los compuestos (insolubles) de alto peso molecular y como solvente para extraer etanol y compuestos solubles presentes en la muestra.

Cuadro 2: Condiciones de operación en pruebas SAE

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 6

Los resultados obtenidos en las pruebas de extracción SAE se reportan en el Cuadro 3. De acuerdo al análisis de varianza, se determinó que la temperatura, la presión y la interacción temperatura*presión tuvieron efecto significativo tanto en las respuestas del “precipitado” como en el “separado”. El análisis de Tukey entre los resultados para “precipitado” y “separado” arrojó las diferencias significativas (p<0,05) que se muestran en los valores con letra diferente.

La recuperación del extracto seco inyectado no fue total, pues se alcanzó en todos los tratamientos un porcentaje de recuperación de “precipitado” más “separado” muy cercano al 90% (entre 86,9% y 89,1%) (Cuadro 3), identificándose que las pérdidas estuvieron asociadas a la adhesión del extracto en las líneas de proceso, filtro y cámara de precipitación, cantidades de extracto que no se recuperaron con el proceso de limpieza por la presencia de azucares en la solución inyectada.

Para determinar la combinación más adecuada de temperatura y presión en la recuperación del ACG fue necesario analizar cada respuesta en el “precipitado” y el “separado” y compararlos con los valores de la solución inyectada. Los mejores resultados de recuperación de ACG en el “precipitado” se obtuvieron con las pruebas SAE 1 y SAE 4, mientras que en el “separado” con la prueba SAE 3 (Cuadro 3).

Cuadro 3: Resultados en pruebas SAE

Extracción de ácido clorogénico de la pulpa de café con CO2 supercrítico - Image 7

El cambio de concentración de ACG a partir de la solución inyectada (contenido inicial de ACG de 34,38 mg/g ES) mostró diferencias entre el “precipitado” y el “separado”; en el precipitado la concentración permaneció casi constante en 19 – 22 mg ACG/g ES, que significó una disminución entre 33 al 45 %, mientras que en el “separado” estuvo entre 42 – 60 mg ACG/g ES, lo cual significó un aumento entre el 25 al 72 % con respecto a la concentración de la solución inyectada del extracto (34,38 mg ACG/g ES). En todos los tratamientos el ACG fue mayormente arrastrado hasta el separado debido a modificación de la solubilidad del ACG en la mezcla CO₂-EtOH, resultado similar al observado en el trabajo de Catchpole et al. (2004), en donde los compuestos de alto peso molecular presentes en tintura etanólica de propolis (ácidos cinámicos y flavonoides) fueron extraídos por la mezcla CO₂-EtOH, mientras que los más polares precipitaron en la cámara, teniendo, de igual manera, concentración constante en el precipitado y un aumento moderado en el separado sobre el rango de presiones entre 250 y 300 bar.

Tomando en cuenta el contenido inicial de ACG la mayor recuperación se obtuvo en el “separado” con los tratamientos SAE 2: 53,4 % y SAE 3: 56,9 % (Cuadro 3). Esta diferencia se debería a que, la extracción simultánea de compuestos diferentes presentes en la pulpa de café, como azúcares y coloides, interfiere con la precipitación de ACG, pues el material recogido en el “precipitado” fue un semisólido altamente viscoso y pegajoso.

Respecto a la medida de actividad antioxidante (Cuadro 3), los mejores resultados en el “precipitado” se obtuvieron en las pruebas SAE 2: 318,9 ± 2,0 µMol Vit C/g ES y SAE 3: 329,4 ± 2,4 µMol Vit C/g ES, no encontrándose diferencias estadísticas significativas entre estos tratamientos pero sí entre éstos y los otros dos (SAE 1 y SAE 4). En el “separado” el mejor resultado se obtuvo en la prueba SAE 1 con 441,3 ± 1,8 µMol Vit C/g ES, existiendo diferencia estadística significativa entre los cuatro tratamientos.

En términos generales, en los tratamientos del “separado” se obtuvieron mayores valores de actividad antioxidante que en el “precipitado”, lo cual guarda relación con la concentración de ácido clorogénico (ACG), la que también fue mayor en el separado que en el “precipitado”.

Tomando en cuenta el rendimiento de extracto seco, la concentración de ACG y la actividad antioxidante se considera como mejor tratamientos a SAE 2, que corresponde a la densidad del antisolvente de 815 kg/m³. Floris et al. (2010) indican que, en la extracción con CO₂ SC la regla es que a temperatura fija con el aumento de presión aumenta el poder de extracción, teniendo más compuestos co-extraídos. En este caso se puede pensar en co-extracción de compuestos fenólicos asociados al ACG como epicatequina, ácidos isoclorogénicos, catequina, ácido caféico y ferúlico, esto se demuestra por su medida de actividad antioxidante de 364,6 µMol Vit C/g ES.

IV CONCLUSIONES

El rendimiento de extracción etanólica, la concentración de ácido clorogénico (ACG) (mg ACG/g ES) y la actividad antioxidante (µMol Vit C/g ES) fueron afectadas en forma directa por el tiempo de extracción y en forma inversa por el tamaño de partícula. Las mejores condiciones de extracción etanólica correspondieron a tiempo de 24 horas de extracción y tamaño de partícula entre 200 y 250 µm.
En la extracción SAE, la presión y temperatura del CO₂ SC tuvieron efecto sobre el fraccionamiento del ACG, mejorando en todos los casos la concentración en el producto “separado”, entre 16% y 65% sobre la concentración del producto inyectado.
En el “precipitado” a una temperatura fija, el aumento en la presión aumentó la solubilidad del ACG, mientras que en el “separado” la solubilidad o arrastre del ACG aumenta con la disminución de la presión. Los mejores resultados se obtuvieron en condiciones de P: 150 bar y T: 35 ºC, correspondientes a densidad del CO₂ SC de 815 kg/m³.
La actividad antioxidante en los productos de la extracción SAE fue mejorada, con un valor de 364,6 ± 4,70 µMol Vit C/g ES, o sea, un incremento en 41% de la capacidad mostrada en el extracto etanólico.
Es posible utilizar la técnica SAE para fraccionar compuestos con alta polaridad como ACG utilizando CO₂ SC como antisolvente; sin embargo, para aumentar el rendimiento de la extracción, es necesaria una etapa previa de purificación para reducir la interferencia de sustancias aglomerantes (compuestos azucarados) en la precipitación directa en la cámara. Floris et al. (2010) y Catchpole et al. (2004) indican que el rendimiento del proceso SAE está limitado por las condiciones iniciales del extracto, por ello primero se debe eliminar las interferencias de polisacáridos y la valoración de compuestos antioxidantes presentes en la pulpa de café.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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