¿Cuantificamos adecuadamente nitratos en suelo? Para saberlo hay que validar

INTRODUCCIÓN

El nitrógeno (N) es uno de los elementos más ampliamente distribuidos en la naturaleza. Cumple importantes funciones en la fisiología de las plantas siendo esencial para su crecimiento y desarrollo. Los nitratos (NO3-) son una de las formas de N más importantes para las plantas. Su contenido en el suelo es variable y depende de factores como la humedad, temperatura, estado vegetativo del cultivo, manejo del suelo, etc. (Bono & Alvarez, 2006).

Los suelos agrícolas generalmente presentan deficiencias de este nutriente por lo que la agricultura de altos rendimientos depende del uso de fertilizantes nitrogenados. El diagnóstico preciso de los requerimientos de N realizado a través del análisis de suelo permite mejorar la eficiencia de uso de N y por lo tanto el balance económico del productor, evitando además posibles riesgos de contaminación de aguas subterráneas (Videla & Echeverría, 2005).

Es importante contar con métodos que permitan obtener la concentración correcta de NO3- en el suelo, para ello los mismos deben ser previamente validados. La validación de un método analítico es el procedimiento que permite establecer, por medio de estudios de laboratorio, una base de datos que demuestre científicamente que es adecuado para cumplir con las aplicaciones analíticas requeridas (IRAM 301/ISO 17025, 2005).

Este trabajo tiene como objetivo realizar la validación de tres métodos de análisis de NO3- en suelo: 1) el método del ACr (West & Ramachandran, 1966), 2) el método del EIS de NO3- (DetectION) y 3) el método del NCH (COPAINS SRL). El método 1 es utilizado en el Laboratorio de Suelo y Agua de la EEA “Ing. Agr. Guillermo Covas” Anguil INTA como método de referencia, mientras que los métodos 2 y 3 son métodos alternativos que suponen una mayor rapidez y menos manipulaciones para el análisis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis químico

Las características de los métodos utilizados se resumen en la tabla 1, destacando las diferencias más importantes entre estos.

¿Cuantificamos adecuadamente nitratos en suelo? Para saberlo hay que validar - Image 1

Procedimiento de validación

Los métodos evaluados pertenecen a la categoría “componentes mayoritarios” según el Organismo Argentino de Acreditación (OAA) (2008). Los parámetros estadísticos que deben analizarse para la validación son: linealidad, sensibilidad, veracidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), rango, robustez e incertidumbre (Urel).
El análisis de la robustez de los métodos se realizó evaluando cuatro pretratamientos que podrían experimentar las muestras de suelo previo a la etapa de extracción de NO3-. Los pretratamientos fueron: a) Muestra analizada inmediatamente luego de su ingreso al laboratorio (tal cual), b) Muestra con su humedad inicial, en bolsa plástica, almacenada a temperatura ambiente por una semana (simulada), c) Muestra seca en estufa de circulación forzada a 60 °C durante 1 hora (seca) colocada en láminas de 1 cm de espesor, d) Muestra almacenada en freezer a -20 ºC entre 30 a 60 días (freezer).
Las especificaciones ó condiciones por cumplir para cada parámetro, se establecieron en forma conjunta entre el cliente y el laboratorio (Bono, com. pers.).

Muestras de suelo

Para el análisis de la precisión y veracidad se utilizaron tres muestras de referencia: M3, M5 y M6 (una para cada metodo, ACr, EIS y NCH respectivamente) provenientes del 3º ECI de la RILSAV (Ostinelli & Carreira, 2011).
En la tabla 2 se muestran los promedios de las concentraciones de NO3 de dichas muestras:

¿Cuantificamos adecuadamente nitratos en suelo? Para saberlo hay que validar - Image 2

Por otro lado, para el estudio de la robustez se utilizaron 6 muestras de suelos clasificados como Haplustol Éntico y Ustipsament Típico, extraídas del predio de la EEA “Ing. Agr. Guillermo Covas” Anguil INTA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la tabla 3 se observan los valores obtenidos para los tres métodos analizados en el estudio de validación y los criterios de aceptación definidos para cada parámetro.

La linealidad es la capacidad del método analítico de producir resultados que sean directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra. El coeficiente de correlación obtenido, el cual se asocia al grado de linealidad, esta por encima del criterio de aceptación definido, r2> 0.9900, en los métodos ACr y EIS, lo cual indica un alto grado de linealidad en los rangos de concentración utilizados. Mientras que el r2 obtenido para el método NCH estuvo por debajo de criterio establecido.

La sensibilidad es el parámetro que permite diferenciar entre pequeñas variaciones de la concentración de NO3-. Tanto el método ACr como el EIS indican buena sensibilidad, dado que la desviación estándar relativa de la pendiente (DER pend) es < 3 %, mientras que el método NCH no se ajusta a dicho criterio.

La veracidad es la proximidad entre el promedio de una serie de resultados y el valor verdadero de la medida. Tanto el método ACr como el NCH indican un valor de veracidad dentro del criterio de aceptación establecido, mientras que el método EIS esta por encima del mismo. Es conocido que muchos suelos pueden contener suficiente cantidad de iones interferentes, principalmente cloruros, que provocan resultados erróneos en medidas realizadas con electrodo (Onken et al., 1970) por lo que los resultados obtenidos podrían indicar la presencia de estos iones en las muestras analizadas.

La precisión es la proximidad entre los resultados de mediciones independientes y normalmente se evalúa estudiando la repetibilidad (R) y la precisión intermedia (P). R es la precisión obtenida bajo las mismas condiciones operativas en un intervalo de tiempo corto, mientras que P contempla variaciones intralaboratorio que ocurren por ejemplo en diferentes días de análisis. En la tabla 3 se observa que tanto la R como P de los tres métodos estudiados están por debajo del criterio de aceptación establecido (CV< 15%).

El LOD es la menor cantidad de analito que puede diferenciarse de la lectura del blanco, mientras que el LOQ es la menor cantidad de analito que puede cuantificarse con precisión y veracidad. Los resultados obtenidos indican que tanto el método ACr como el EIS cumplen con los criterios de aceptación, mientras que no es así para el método NCH. Este último permite cuantificar concentraciones de NO3- que están muy próximas al valor recomendado para fertilización, que en líneas generales, es menor a 20 ppm en la capa superficial de suelo (0-20 cm) (Bono & Romano, 2007).

La Urel es un parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores. Puede observarse en la tabla que los métodos ACr y NCH tienen una Urel inferior al 20 %, mientras que ésta es mayor para el método EIS. Esto último podría asociarse a la sobreestimación del resultado por presencia de iones interferentes, tal como se indicó para la determinación de veracidad.

¿Cuantificamos adecuadamente nitratos en suelo? Para saberlo hay que validar - Image 3

El rango de concentraciones de NO3- dentro del cual se realizó el estudio de validación fue desde 7 a 230 ppm.

La robustez de un método es la capacidad para mantenerse sin cambios ante pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método, tal como el pretratamiento de la muestra. En la figura 1 se muestra el promedio de las diferencias relativas (PDR%) de los pretratamientos de muestra simulada, seca y freezer vs. muestra tal cual. Se observa que el PDR% para el pretratamiento de muestra simulada esta por encima del criterio de aceptación establecido (PDR% < 15) en los tres métodos estudiados. Por el contrario, en el pretratamiento de muestra seca los valores obtenidos son inferiores al límite establecido en los tres métodos. Finalmente se observa que el pretratamiento de muestra freezer tuvo un comportamiento variable, indicando un PDR% mayor a 15 % en los métodos ACr y NCH, pero menor a 15 % en el método EIS.

¿Cuantificamos adecuadamente nitratos en suelo? Para saberlo hay que validar - Image 4

Los altos PDR% obtenidos para el pretratamiento de muestra simulada podrían asociarse a la continua acción microbiológica que ocurre durante el almacenamiento a temperatura ambiente con la humedad inicial, tal como lo señalan Griffin et al (2009). Dichos resultados indicarían que este pretratamiento no es adecuado para la conservación de las muestras de suelo previo al análisis de NO3-. Los valores obtenidos para el pretratamiento de muestra seca indican que este modo de conservación es adecuado, dado que el secado en estufa de una fina capa de muestra durante una hora disminuye la actividad microbiana y por lo tanto la variación del contenido original de NO3- en la muestra. Finalmente, los resultados obtenidos para el pretratamiento en freezer no permiten ser concluyentes sobre la aptitud del mismo en los tres métodos dado que el comportamiento no fue similar. El método EIS parece ser robusto al realizar este pretratamiento, pero no es así para el caso de los métodos ACr y NCH. Zamolinski & Gentilini (1986) mencionaron que la conservación de muestras de suelos, clasificados como Hapludoles Thaptoárgicos, en freezer a -20 ºC es un sistema satisfactorio, sin embargo resaltaron que esta aptitud debería evaluarse para diferentes tipos de suelos. Los resultados obtenidos en este trabajo indican además que esto dependerá del método de cuantificación.

CONCLUSIÓN

En base a los resultados de la validación se concluye que el método ACr aplicado a muestras de suelo pretratadas con secado en estufa, resulta apto para el análisis de NO3- en suelos clasificados como Haplustol Éntico y Ustipsament Típico. La validación del método EIS no arrojo resultados satisfactorios debido a que no cumple con el criterio de aceptación establecido para el parámetro veracidad, lo cual indica que los valores obtenidos por este método sobreestiman la concentración de NO3- en las muestras de suelo analizadas. Este comportamiento se asociaría a la presencia de iones cloruro. El método NCH no resultó apto para definir decisiones de fertilización dado que en el procedimiento de validación no se cumplieron los criterios especificados para los parámetros LOD, LOQ y sensibilidad. Sin embargo, el NCH resulta ser un método práctico para su empleo a campo, que permite estimar el contenido aproximado de este nutriente.

Es importante destacar que el secado de la muestra en estufa parece ser el método más apropiado para su conservación, sin considerar el método de cuantificación. El secado, además, permite agilizar la manipulación de muestras en el laboratorio, mejorar el uso del espacio, extender los tiempos de análisis en períodos de mucha demanda y conservar la muestra en archivo para futuros análisis.

AGRADECIMIENTOS: INTA, FCEyN UNLPam.

BIBLIOGRAFÍA

Bono, A & Álvarez, R 2006. Estimación de nitratos en profundidad en suelos de la región semiárido y subhúmeda pampeana. INFO AGRO 33: 25-26
Bono, A & Romano, N. 2007. Nitrógeno. En: Quiroga, A; Bono, A (ed). Manual de fertilidad y evaluación de suelos. 1ª edn. Pp. 60-64. EEA Anguil “Ing. Agr. Guillermo Covas”, INTA.
Copains, SRL. Nitracheck: consejos de utilización. Challenge agriculture. (M.R.) Gardonne. France. http://www.copains.com.ar/pdf/med_nitrachek.pdf. Ultimo acceso: 08/11/2011
Detection. Instruction manual & operation guide: nitrate combination electrode. http://www.nicosensors.com/pNitrate.html. Ultimo acceso: 04/11/2011.
Griffin, G; Jokela, W; Ross, D; Pettenelli, D; Morris, T & Wolf, A. 2009. Recommended soil nitrate-N test. Chapter 4. Cooperative Bulletin No. 493. P 28
IRAM 301/ISO 17025. 2005. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración.
Onken, AB & Sunderman, HD. 1970. Use of nitrate electrode for determination of nitrate in soils. SOIL SCI PLANT ANAL. 1: 155-161.
Organismo Argentino de Acreditación OAA. 2008. "Guía para la validación de métodos de ensayo". Código: DC-LE-05. Versión: 2. Pág. 9.
Ostinelli, M & Carreira, D. 2011. 3º Ensayo de Comparación Interlaboratorios de Suelos. RILSAV. PE AERN 5653. INTA.
Videla, C. & Echeverría, H. 2005. Métodos rápidos para la determinación del contenido de nitratos en suelos. 1ª Ed. EEA INTA Balcarce-- FCA-UNMP. P 139
West, P.W. & Ramachandran, T.P. 1966. Spectrophotometric determination of nitrate using chromotropic acid. ANAL CHIM ACTA 35: 317-324.
Zamolinski, A. & Gentilini, T.H. 1986. Acondicionamiento de la muestra de suelo para la determinación postergada de nitratos. Publicación Técnica Nº 6. Sec. de estado de agricultura, ganadería y pesca de la nación. EEA INTA Villegas.